实验三酶联免疫吸附试验(ELISA).ppt

实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA) 2.补体结合反应,1.酶联免疫吸附试验（ELISA),免疫标记技术,定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP,免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体,酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),3. 原理（以间接性ELISA为例）：,显色,实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测,实验材料,脱纤维绵羊红细胞 抗原 兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清 HRP标记羊抗兔IgG 二抗 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L 酶标板，酶标仪,实验方法,1.抗原的处理：,脱纤维绵羊血,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,取2mL压积红细胞,加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞,用包被缓冲液稀释成1：400备用,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加二抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标二抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,预期结果,阳性：显色为黄色 阴性：无色,1 2 3 4,阴性,阴性,阳性,阳性,注意事项,洗涤彻底，避免交叉污染。 按顺序加样，孔底无气泡。 包被和温育在湿盒内进行。,2.补体结合反应 （Complement fixation Test, CFT）,概念：,补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。,补反中包括两个系统五种成分： 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,待测系统 抗原+未知血清,补体,1,2,Step 1 抗原抗体复合物的形成,Step 2 补体的结合和耗竭,指示系统 SRBC+抗SRBC抗体,Step 3 SRBC的裂解,1,2,1：No Ab； 2：Ab,Ag,Y,Ab 阳性,No Ab 阴性,Ag,Ag,Ag,抗原：伤寒菌裂解产物 待测血清：56，30min 补体：豚鼠血清 2%绵羊红细胞 溶血素,材料：,方法：,1,2,3,4,5,试验管,血清 对照管,抗原 对照管,补体 对照管,SRBC 对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀，37，水浴15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL, , , , , , , , , ,摇匀，3