课件：第六章人类疾病动物模型.ppt

第六章 人类疾病动物模型,主要内容,第一节 人类疾病动物模型概述 第二节 基本疾病病理过程动物模型 第三节 肿瘤动物模型 第四节 各系统疾病动物模型 第五节 免疫缺陷动物模型,第一节 人类疾病动物模型概述,人类疾病动物模型(animal model of human diseases)是指生物医学研究中所建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关实验材料。,使用动物模型是现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段。人类疾病动物模型的研究，实质上是有关实验动物的应用科学。利用各种动物的生物学特性和疾病特点与人类疾病进行比较研究，从而加强对人类疾病的发生过程、机制乃至防治的认识。,长期以来，人们发现选用人作为实验对象来推动医学的发展是困难的，临床积累的经验不仅在时间和空间上存在着局限性，许多实验在道义上和方法上还受到种种限制。而动物模型克服了这些不足点，其在生物医学所起的独特作用，正受到越来越多的医学科技工作者的重视。,一、动物模型的意义及优越性,人类疾病的发生发展是十分复杂的，要深入探讨其发病机制及防治离不开实验研究，而许多研究不可能也不允许在人体上试验。通过在动物身上复制出类似人类的各种疾病或某些生命现象，进而有意识地改变在自然条件下不可能或不容易排除的因素，以便更加准确地观察和分析实验结果，并将实验结果推论到人类疾病，从而有助于更全面、更深刻地认识人类疾的发生、发展规律和制订防治措施。因此，生物医学研究中常常使用动物模型作为临床和实验假说的试验基础，其意义十分明显。,1、动物模型的意义,2、动物模型的优越性,避免了在人体上进行实验所造成的危害 临床上对一些疾病的研究不可能在人体上重复进行，而用动物作为人类的“替难者”，就可以在人为设计的实验条件下反复观察和研究，甚至为了研究需要可以损伤动物组织、器官或处死动物。 可提供发病率低、潜伏期长和病程长的疾病材料 一般而言，遗传性、免疫性、代谢性、内分泌和血液系统疾病在临床上发病率低，研究人员可以有意识的提高其在动物种群中的发病率或用不同方法复制出各种模型进行研究。 某些疾病的潜伏期很长，很难进行研究，有些致病因素需要隔代或者几代才能显示出来，一个科学家很难有幸在人体进行3代以上的观察，而许多动物由于生命的周期很短，在实验室观察几十代是很容易的。,可以严格控制实验条件，增强方法学上的可比性 一般来说，临床上很多疾病是十分复杂的，而采用动物来复制疾病模型，可选择相同品种、品系、，性别、年龄、体重、活动性、健康状态等严加控制的各种等级的标准实验动物，实验时温度、湿度、光照、造影、饲料等实验条件也可严格控制。用单一的病因作用复制成一定的疾病模型。这样，对某种疾病及其过程的研究就可排除其他影响因素，使所得的研究结果更为准确。,可便于样品收集和简化实验操作 动物模型作为人类疾病的“复制品”，可按需要随时采集各种样品，甚至及时或分批处死动物收集样本，以了解疾病的全过程，这在临床上是难以办到的。实验动物的小型化发展趋势也有利于动物的日常管理和简化实验操作。,有助于全面地认识疾病的本质 已知某些病原体(或病因)既可使人类致病，又可引起动物发病，在不同物种所导致的疾病表现可能各有特点。通过对人畜共患疾病进行比较研究，可以充分认识同一病原体(或病因)对不同机体带来的损害，对该疾病有更全面系统的了解，从而更有利于认识该病原体(或病因)在人体上所引起的一切病理变化。 疾病动物模型的另一用途在于能够细致观察环境或遗传因素对疾病发生发展的影响，这在临床上也是难以办到的，对于全面地认识疾病本质有重要意义。,二、动物模型的分类,(一)按产生原因分类 实验性或诱发性动物模型,实验性或诱发性动物模型(experimental or artificial induced animal model)是指使用物理、化学、生物等致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病的功能、代谢或形态性结构方面的病变，即人为地诱发动物产生类似人类疾病的动物模型。,优点：制作方法简便，实验条件比较简单，其他因素容易控制，在短时间内可以复制大量的动物模型。 缺点：主要是诱发的动物模型与自然产生的疾病模型在某些方面有所不同，如诱发性肿瘤与自发性肿瘤对药物敏感性有差异；而且有些人类疾病不能用人工方法诱发动物疾病模型，有它一定的局限性。,自发性动物模型 自发性动物模型(spontaneous animal model)是指实验动物未经过任何有意识的人工处置，在自然情况下动物自然发生或由于基因突变的异常表现经遗传育种保留下来的动物疾病模型。其中主要包括突变系的遗传病和近交系的肿瘤动物模型。,优点：在一定程度上排除了人为的因素，更接近人类相应疾病的发病情况，其应用价值很高。 缺点：这类模型目前所发现的种类有限，来源比较困难，而且自发性疾病模型动物的饲养条件要求高，遗传育种也比较麻烦，需要一定的时间，若大量使用上存在一定的困难。,抗疾病型动物模型(negative animal modal)是指特定的疾病不会在某种动物身上发生，因而可以用来探讨为何这种动物对该疾病有天然的抵抗力。如哺乳类动物均易感染血吸虫，而居于洞庭湖流域的东方田鼠却不感染血吸虫病，因此，可用于血吸虫感染机制和抗病的研究。,抗疾病型动物模型,生物医学动物模型(biomedical animal model)是指利用健康动物固有的生物学特性来提供人类疾病相似表现的动物模型。 例如：兔甲状旁腺分布比较分散、位置不固定，摘除甲状腺不影响甲状旁腺功能，是摘除甲状腺实验较理想的动物模型；沙鼠缺乏完整的基底动脉环，左右大脑供血相对独立，是研究中风的理想模型；鹿的正常红细胞是镰刀形的，多年来被用于镰刀形红细胞贫血的研究。但这类动物模型与人类疾病存在着一定的差异，研究人员在使用这类动物模型时应加以分析比较。,生物医学动物模型,（二）按系统范围分类,疾病的基本病理过程动物模型 疾病的基本病理过程动物模型(animal model of fundamental pathologic processes of disease)是指具有各种疾病共同的一些病理变化过程表现动物模型。各种致病原(或病因)在一定条件下作用于动物后，动物都会出现一些共同的功能、代谢和形态结构的变化，这些变化不是某种疾病所特有的，而是各种疾病都可能发生的。如发热、炎症、休克、电解质紊乱等。,各系统疾病动物模型 各系统疾病动物模型(animal model of different system disease)是指与人类各系统疾病相应的动物模型。如：神经、心血管、呼吸、消化、泌尿等系统疾病相应的动物模型。,（三）按中医药体系分类,祖国传统医学源远流长，经过数千年的实践，已形成了较完整的独特体系。如独特的理论体系：辨证论治；独特的评价标准：证、病、症等；独特的处置措施：中药、针灸、养生；独特的观察指标：舌、脉、神、色等；独特的认识特色：审证求因。通过中医药动物实验，建立中医证候动物模型，为中医基础病理学、基础药理学研究提供了重要的依据。 根据中医证分类，动物模型可分为阴虚、阳虚、气虚、血虚、脾虚和肾虚动物模型、厥脱症模型等。 按中药理论分类，有解表药、清热药、止血药、补益药、理气药、平喘药、祛风湿药、平肝熄风药、活血化瘀药、止咳化痰药等动物模型。中医药动物模型，不论从 “证”或从“药”分类，每个“证”或“药”的动物模型不止一种动物，也不止一种方法。,疾病模型的种类包括整体动物模型、离体器官和组织模型、细胞株模型和数学模型。 广义的数学模型是指用抽象符号对原型某些因素或基本量及其相互关系所作的描述。 狭义的数学模型则仅指描述所研究的系或过程动态规律的方程而言。,（四）按模型种类分类,三、动物模型设计原则和评估,（一）设计原则,相似性原则,重复性原则,可靠性原则,适用性和可控性原则,易行性和经济性原则,在动物身上复制人类疾病模型，目的在于从中找出可以推广 (外推)应用于人体的有关规律。因此，设计动物模型的一个重要原则就是，所复制的模型应尽可能近似于人类疾病的情况。,为了尽量做到与人类疾病相似，首先要注意动物的选择。其次，为了尽可能使模型与人类疾病相似，还要在实践中对方法不断加以改进。例如结扎兔的阑尾血管，固然可以使阑尾坏死、穿孔并导致腹膜炎，但这与人类急性梗阻性阑尾炎合并穿孔和腹膜炎不一样。如果给兔结扎阑尾基部而保留原来的血液供应，由此而引起的阑尾穿孔及腹膜炎就与人的情况相似，因而是一种较理想的方法。, 相似性原则,理想的动物模型应是规范化的，能够准确地重复再现。为了增加动物模型复制时的重复性，必须在动物品种、品系、年龄、性别、体重、健康状况；饲养管理、实验及环境条件、实验方法步骤；药品生产厂家、批号、纯度规格、给药剂型、剂量、途径；仪器型号、灵敏度、精确度乃至实验者及其操作技术熟练程度等方面保持一致，因为一致性是动物模型复制重现性的可靠保证。, 重复性原则,复制的动物模型应力求可靠地反映人类疾病，即可特异性地反映某种疾病或某种功能、代谢、结构变化，应具备该种疾病的主要症状和体征，并经化验或X光照片、心电图、病理切片等检查证实。容易自发地产生某些相应病变或易产生与待复制疾病相混淆疾病的动物就不宜选用。, 可靠性原则,复制动物模型时还应考虑到今后的临床应用和便于控制其疾病发展，以利于进行研究。如：选用大鼠、小鼠作实验性腹膜炎不适用，因为它们对革兰阴性菌有较高的抵抗力，不容易造成腹膜炎。有的动物对某一致病因子特别敏感，实验中无法控制，极易死亡，也不适用。如给犬腹腔注射粪便滤液能引起腹膜炎，但很快死亡（80%24h内死亡），来不及进行实验治疗观察。,4适用性和可控性原则,在复制动物模型时，应遵循经济易行的原则。灵长类动物与人最接近，复制的疾病模型也很相似，但灵长类稀少价昂，实验中采用较少；许多小动物如大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠等也可以复制出十分近似的人类疾病模型，它们的遗传背景大多明确，体内微生物可加以控制，模型性状显著和稳定，而且价廉易得，便于管理。因此，科研工作者大多采用小动物复制人类疾病模型。,5易行性和经济性原则,(二)动物模型评估,建立疾病动物模型的最终目的是为了防治人类疾病。因此，对疾病动物模型的评估主要取决于模型与人类疾病的相似或可比程度。一个理想的疾病动物模型应具有以下特点： 能再现所要研究的人类疾病，即动物疾病表现与人类疾病相似。 动物可重复产生该疾病，最好能在两种或两种以上的动物身上复制该疾病。 动物背景资料完整，等级合格，生命周期能满足实验需要. 动物要价廉、来源充足、便于运送。 尽可能选用小动物。,四、复制方法及其注意事项,(一）复制方法,1、生物因素：如细胞、细菌、病毒、寄生虫、生物毒素、激素等作为致病原，可通过接种使健康动物发生疾病。,2、物理因素： 不同的物理因素作用于动物可复制出不同的疾病模型。例如：在机械力作用下产生外伤性脑损伤、骨折等模型；气压变动复制高空病、潜水病；温度过高或过低产生烧(烫)伤或冻伤，等等。,3、化学因素：化学因素可直接或间接(通过代谢)引起动物致病，造成组织、器官或全身损害，出现某些类似人类疾病的功能、代谢、形态结构方面的变化。如用各种化学致癌物诱发各种肿瘤，用各种化学毒物或毒气诱发各种中毒性疾病。,（二）注意事项,不同致病因素使动物所产生的临床症状和发病情况是不同的，研究者应根据研究的需要，有针对性地选择恰当的致病因素和实验方法。动物的遗传背景、性别、年龄等对模型复制也有一定的影响，不同品种、性别、年龄的动物存在剂量、耐受性和副作用等差异。复制动物模型应注意选用标准化和有实用价值的动物。近交系动物由于存在近交衰退、自发性疾病多有可能因育种或环境的改变而发生基因突变及遗传漂变等缺点，需慎重选用。 此外，动物模型复制的成败还与环境因素密切相关。动物饲料、所处的居住场所、光线、湿度、噪声、等任何一项被忽视都可能带来严重影响。复制过程中实验操作如固定、麻醉、手术、药物和并发症等处置不当，同样会产生不良的后果，因此在复制模型时应充分考虑环境因素和操作技术。,第二节 基本疾病病理过程动物模型,一、电解质、酸碱平衡紊乱及应激反应动物模型,（一）水和电解质代谢紊乱动物模型复制方法,用10%乌拉坦按10ml/kg体重注入家兔或豚鼠耳缘静脉麻醉，并仰卧固定。分离颈总动脉并插管。将心电图机各针形电极按导联线标志色分别插入四肢踝部皮下（顺序与人连接相同），选择或aVF导联描记一段正常心电图。 家兔静脉注入5%氯化钾2ml。出现异常波形后，开动纪录装置，描记一段心电图，并采血3ml测定血浆钾浓度，然后继续间歇性注入5%氯化钾，每次2ml，描记异常心电波形。 用豚鼠则从腹腔注入5%KCI 1ml，注意观察示波器荧屏上心电图改变。每5分钟再腹腔注射5%KCl 0.5ml，直至心电图出现改变时，从颈动脉采血3ml，测定血浆钾浓度。观察高钾血症的心电图改变。最后注入10%氯化钾，边注射边观察心电波形改变。出现室颤时，开胸观察心脏停跳情况。,(二)酸碱平衡紊乱动物模型复制方法,手术准备 选取1.5kg以上的家兔，用3%戊巴比妥钠1mlkg体重静脉注射麻醉后，仰卧位固定。分离气管，作气管插管。再分离左侧颈动脉，远心端结扎，近心端用动脉夹夹闭，作动脉插管。取血用动脉插管内应充满肝素，插好后与动脉连接处用手术线结扎固定，软胶管用弹簧夹夹闭。手术完成后，采动脉血测定血气指标，包括动脉血pH、PO2、Pco2、标准碳酸氢盐(SB)、实际碳酸氢盐(AB)、缓冲碱(BB)、剩余碱(BE)等。采血方法应严格按血气分析方法操作。采血时要测定体温。观察呼吸频率及呼吸深浅的变化，并作记录。,1复制急性呼吸性酸中毒 用止血钳夹闭气管插管的23，造成气道阻塞，持续10分钟，按上述方法取血测血气指标并观察呼吸。然后放开止血钳，待呼吸恢复正常。 2复制急性代谢性酸中毒 动物呼吸恢复正常后，耳缘静脉缓慢(1ml分钟)注入5%乳酸溶液(10mlkg体重15mlkg体重)，注射完毕，按上述方法取血测血气指标井观察记录呼吸变化。 3复制代谢性碱中毒 动物呼吸恢复正常时，自耳缘静脉注入5%碳酸氢钠10ml15mlkg体重，同上法取血测血气指标，并观察记录呼吸变化。,复制方法,(三)应激反应动物模型复制方法 用一只卵圆钳夹住大鼠头颈部皮肤，另一只卵圆钳夹住尾部，将大鼠两后腿放入90水中(浸至腹股沟处止)，烫10秒。烫后10分钟，眶静脉取血，分离血浆，测皮质醇和血糖用。皮质醇明显升高。,注意事项 在模型复制过程中，应注意动物不要过分饥饿与剧烈运动，以免体内酸性物质增多，影响实验结果。每次抽血时要注意抽前放掉插管内肝素，抽血后及时向插管内注入肝素。测血气用血标本必须保证与空气隔绝，以防结果不准确。,二、水肿、发热、发热及凝血动物模型复制方法,(一)水肿动物模型复制方法 1家兔实验性肺水肿 按3%戊巴比妥钠0.8mlkg体重腹腔内注射麻醉家兔，固定于兔台上。分离气管和一侧颈外静脉。插入气管插管并结扎固定，描记呼吸及插静脉管，把静脉导管连接静脉输液装置，注意排除管道内气体。打开静脉输液装置的螺旋夹，进行输液，缓慢输入生理盐水(5滴10dmin)。分别描记正常呼吸曲线，并用听诊器听肺部的呼吸音，然后输入37生理盐水(输入总量按100mlkg体重，输液速度为180200dmin)。待滴注接近完毕时立即向输液瓶中加入肾上腺素生理盐水(按肾上腺素0.45mgkg体重)继续输入。密切观察呼吸改变和气管内是否有粉红色泡沫液体流出，并用听诊器听诊肺部有无湿性啰音出现。,死亡动物记录死亡时间，存活动物造病后30分钟则夹住气管，放血处死动物。打开胸腔，用线在气管分叉处结扎以防止肺水肿液流出，在结扎处以上切断气管，小心将心脏及其血管分离(勿损伤肺)，把肺取出，用滤纸吸去肺表面的水分后称取肺重，计算肺系数。然后肉眼观察肺大体改变，并切开肺，观察切面的改变，注意有无泡沫液体流出。镜下观察正常肺组织和肺水肿组织切片，计算肺系数。 肺系数计算公式：肺系数：肺重量(g)体重(kg)。正常兔肺系数为45。,2大鼠实验性肺水肿 用1%戊巴比妥钠0.4mll00g体重腹腔注射大鼠麻醉，固定于鼠台，观察动物一般表现、呼吸和肤色后腹腔注入0.1%肾上腺素0.1ml100g体重。记录时间，观察动物的变化，注意口鼻有无泡沫样液体流出。动物死亡后，准确称取大鼠尸体重。解剖尸体，结扎气管后取出心肺，分离心脏(注意不要损伤肺组织)，将肺表面血迹用滤纸撩去后准确称肺重，然后肉眼观察肺大体的改变，井切开肺，观察切面的改变，注意有无泡沫液体流出。镜下观察正常肺组织和肺水肿组织切片，计算大鼠肺系数。肺系数计算公式：肺系数：肺重量(g)体重量(kg)。正常大鼠肺系数为48。,(二)发热动物模型复制方法 1大肠杆菌内毒素法 取体重2.02.5kg健康家兔，称重，测量直肠温度，每10分钟一次，测量三次后，静脉麻醉，将0.20g/ml精制大肠杆菌内毒素生理盐水溶液经38水浴30分钟后，兔耳缘静脉注入5mlkg注射后，每隔10分钟测量一次体温，各测9次12次。,2大肠杆菌法 取体重2.02.5kg健康大鼠称重，测量直肠温度，每10分钟一次。自尿中或腹水中分出的大肠杆菌菌株，用生理盐水调制成0.5ml中含106107个细菌的浓度，给大鼠静脉注射，3.5小时4小时后发热，反应可达高峰，体温升高1.72.0。浓度增加到108109个细菌0.5ml时，动物不发热而全部死亡，因此以前一种浓度为宜。,3伤寒杆菌内毒素法 用生理盐水制成内毒素混悬液，按50g/kg体重、10gkg体重、2.0gkg体重和0.4gkg体重的剂量，给大鼠腹腔注射，能出现符合剂量反应的规律。根据体温升高的情况来看，推荐采用50gkg体重腹腔注射为宜。 4伤寒副伤寒菌苗法 可利用现成的伤寒副伤寒四联菌苗，按0.5mlkg2.0mlkg给家兔静脉注射，所用菌苗应不低于100亿ml。菌苗注入12小时，即见直肠温度上升1.01.5，持续3小时4小时。 5啤酒酵母混悬液法 在实验时用0.5%甲基纤维素或生理盐水分别制成10%、5%、1%、0.2%啤酒酵母混悬液，按10mlkg体重的剂量给体重150200g大鼠背部皮下注射，3小时后体温上升，6小时可达高峰，体温升高1.2-2.2。凡直肠温度上升不到0.8的大鼠，应予剔除。,6灭活大肠杆菌或乙型副伤寒杆菌培养液法 将在3037培养3周4周的大肠杆菌肉汤培养液，或培养了34昼夜的乙型副伤寒杆菌肉汤培养液，以细菌滤器过滤。把留在滤器上的细菌剩余物，放人盛有甘油lml-2ml的研钵中碾碎、高压灭菌。取该混悬液0.2ml，以滤过液(肉汤)2ml稀释后，给家兔皮下注射。几小时内即可引起发热，井持续12小时左右。 7.腐败干草剂法 将约50g的干草浸入1L水中，放在温暖处14周，然后用普通方法将腐败浸液过滤煮沸，使蒸发至原容积一半。该滤液内含腐败菌及其代谢产物，给家兔静脉注射2ml3ml，可在1小时内引起发热，持续8小时10小时。,1引起肿胀的炎症模型 选用体重2.02.5kg健康家兔，随机分组，用推剪剪去耳壳背面短毛直至耳根。在一侧耳壳背面下13处，皮下注射松节油0.2ml。于另一侧耳壳相应位置皮下注射生理盐水0.2ml，作对照。每隔20分钟，观察注射松节油及生理盐水部位的局部变化，并用卡尺测量肿胀部位厚度，连续6次。观察引起高峰时间和消退时间，比较两侧差异情况。在注射松节油后30分钟-40分钟，于注射生理盐水侧的耳缘静脉，缓缓注射1%锥蓝溶液(3.0mlkg)。然后观察局部出现蓝染情况，用直尺测量蓝染范围。注射松节油后1小时2小时，可见耳廓下垂，为耳廓功能障碍。观察第6次结束后，剪下双耳，用直径0.6cm环钻取同一位置两耳片，扭力天平称重，以右耳重减左耳重为炎症胀度。,(三)炎症动物模型复制方法,2白细胞渗出的炎症模型 取雄性大鼠，用20%乌拉坦0.5ml100g体重腹腔注射麻醉，仰卧固定后，于剑突右侧lcm处剪毛，常规消毒，将1%角叉菜胶生理盐水0.5ml注入大鼠右胸腔内，引起角叉菜胶胸膜炎。8小时12小时后，断头处死动物。打开胸腔，用注射器抽取渗出液，测定胸膜炎渗出液量。然后，取一支试管，用吸管准确加入0.38ml白细胞稀释液，加入20l炎性渗出液，混匀后将稀释液滴入计数室内静置3分钟，在低倍显微镜下数四个大方格内的白细胞。计算渗出液中的白细胞。四个大方格白细胞总数乘以50，即为每ml渗出液内的白细胞数。最后测定胸腔炎性渗出液中蛋白含量。,(四)弥漫性血管内凝血动物模型复制方法 取幼犬或家兔称重，按3%戊巴比妥钠o8mlkg腹腔内注射麻醉，固定。分离一侧颈总动脉和股静脉，分别插管，用于取血和给药。采取正常血查Hb、RBC和纤维蛋白原等。然后按10%高分子右旋糖酐(4050万u)15mlkg在3分钟内从静脉注入，紧接着再注入纤维蛋白原90mgkg，给药后的20分钟、40分钟和60分钟分别按上述检查指标重复检查。,三、缺氧、休克及实验性高血压动物模型复制方法,(一)缺氧动物模型复制方法 1乏氧性缺氧动物模型复制 取小鼠1只，称重，将其置入含5g钠石灰的缺氧瓶内。观察一般状态，呼吸频率(次10s)和幅度，皮肤及口唇的颜色。盖紧瓶塞，接通水银检压计，记录时间和实验室温度，以后每隔3分钟重复观察上述指标一次，并记录水银面上升或下降的刻度，直到动物死亡，记录死亡时间。将耗氧压换算成耗氧量和耗氧率。再依次打开腹腔，比较血液和肝脏颜色。,2 CO中毒性缺氧动物模型复制 取小鼠一只，观察同上，尾部取血一滴置装有2ml生理盐水的小试管内备用。再将小鼠放入缺氧瓶内，连接好CO发生器。自一氧化碳气体产生后，注意观察小鼠有何变化。等小鼠呼吸明显加深、变慢或出现痉挛倒下时，立即打开缺氧瓶塞，迅速取出小鼠，然后从尾部取血一滴，置入2ml生理盐水小试管，与第一次取血颜色对比。,3亚硝酸盐中毒性缺氧动物模型复制 取两只体重相近的小鼠，向腹腔内注入2.5%亚硝酸钠0.3ml，其中一只注药后立即再向腹腔注入0.5%美蓝溶液0.3ml，进行抢救；另一只注药后向腹腔注入生理盐水0.3ml作对照。观察同乏氧性缺氧动物模型复制，比较两鼠症状出现情况及死亡时间。 4氰化钾中毒性缺氧动物模型复制 取小鼠两只，观察正常表现后，腹腔内注射0.1%KCN 0.2ml。观察同乏氧性缺氧动物模型复制。待动物出现四肢软瘫时立即取出一只向腹腔内注入10%硫代硫酸钠0.4ml；另一只注射等量生理盐水作对照。观察两只小鼠症状变化及死亡时间。,(二)休克动物模型复制方法,1失血性休克实验,取成年家兔，称重后，耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1mlkg体重)麻醉。颈部手术分离气管、左侧颈总动脉和右侧颈外静脉，插入气管插管描记呼吸，另一侧连上事先放有肝素的输液瓶装置，并暂时关闭导管，以备放血用。从右侧颈外静脉插入5cm长的静脉导管，导管的外端用三通管连上输液管和水检压计，用来测定中心静脉压和输液，测前，阻断检压计侧管，使导管与输液瓶相通，缓慢输入生理盐水(5-10滴分)，保持静脉通畅。 在耻骨联合上方作下腹部正中切口长5cm，找出膀胱，分离双侧输尿管，插入输尿管导管，用记滴器记录每分钟尿滴数。 在右侧腹直肌旁作长6cm的纵行中腹部切口，打开腹腔后，推开大网膜，找出一段游离度较大的小肠肠袢，轻轻从腹腔中拉出，放置在微循环恒温罐流盒内，用显败镜观察肠系膜微循环。,放血前观察动物各项生理指标，包括一般情况、皮肤粘膜颜色、肛温、血压、呼吸、中心静脉压、尿量、肠系膜微循环，每组各用肝素化的注射器取2ml血(注童整射器内勿存气泡，并立即将注射针头刺入胶塞内以密封)，备查酸碱平衡和血气指标。 打开颈总动脉插管与输液瓶装置相连的侧管，放低输液瓶使血液从颈总动脉流入辖液瓶内，直至血压下降到5.32kPa时，调节输液瓶高度，控制放出的血量，使直压稳定在低水平。 维持血压在5.32kPa l5分钟20分钟，观察失血期间动物各项生理指标改变,以及肠系膜微循环改变。,观察记录,2感染性休克实验 (1)取体重250300g的大鼠，称重后腹腔注射1%戊巴比妥钠(按0.4ml/100g)麻醉。将大鼠固定于手术板上。 (2)剪去颈部皮肤被毛，颈部正中切开皮肤，钝性分离、暴露气管，作气管插管记录呼吸。 (3)分离一侧颈总动脉，用内径为0.51.0mm的塑料管向心作颈总动脉插管记录血压。 (4)作左腹侧切口，并位于阑尾末端上0.8mm1.Omm处将回肠肠袢系膜拉出体外，观察肠系膜微循环；也可提起一侧阴囊被膜，用电烧灼器切开一小口，钝性分离、拉出提睾肌观察提睾肌微循环。 (5)取尾静脉血作血抹片，观察血小板为主的微聚物。 (6)观察动物一般情况、皮肤粘膜颜色及上述各项生理指标后，用生理盐水将精制大肠杆菌内毒素稀释成40g/ml，然后在2分钟内按80gkg的剂量从尾静脉注入内毒素造成内毒素休克。注射后60分钟内密切观察大鼠的一般情况：皮肤颜色、血压、呼吸、心率。肠系膜或提睾肌微循环及血中血小板微聚物的形成。,(三)实验性高血压动物模型复制方法 复制实验性高血压模型常选用犬、描、家兔和猴等，复制方法很多，如通过神经反射、外源性儿茶酚胺类或其他体液加压物质的注射直接刺激中枢神经系统等。缩窄肾动脉致高血压是十分经典的动物模型。实验中常用的动物为大鼠、兔和犬。,将犬或家兔麻醉后，俯位固定，腹下垫一长枕使腰部顶起，从脊柱旁1.52cm处开始，右侧顺肋骨缘，左侧在离肋骨缘约两指宽的地方作4cm长的皮肤切口。逐层分离，用手指通过手术区摸到肾脏，并在肾切迹与主动脉之间找到强力搏动的肾动脉。按所需长度，小心分离一段肾动脉。选用一定的银夹或银环，（68kg犬所用的环直径为0.81.2mm，家兔用的环直径为0.50.8mm）套在肾动脉上，或者用缝线将相应直径（约为血管口径的1/41/3）的铁圈绑扎在血管上面。将缝线结扎紧后取下铁圈。如果是单侧肾动脉缩窄，则应将另一侧肾切除，后一手术在间隔1012天进行。一般肾切除手术后几天，血压开始升高，13个月后血压上升达到高峰，并可长期维持下去。,四、器官功能衰竭动物模型复制方法,(一)急性心力衰竭动物模型复制,心肌缺血灌注损伤动物模型复制 取体重200g250g的雄性大鼠，称重后用1%戊巴比妥钠溶液(0.4ml100g)腹腔注射麻醉。将动物仰卧，固定于实验用的木板上，连上心电图机，用导联记录心电图。剪去手术部位被毛，进行气管插管，待开胸后立即进行正压人工呼吸(空气通气量：2ml100g体重，频率4850次分)。 在胸骨左侧旁约0.5cm处，从第3至第5肋纵行切开，剪开心包，暴露心脏，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，以0号丝线穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针。待心电图恢复稳定10分钟后，予以结扎。结扎时将硅胶管置于结扎线与血管之间，使硅胶管压迫引起冠脉闭塞，以心电图出现ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功的指标。5分钟后松线解除结扎，恢复灌流10分钟。动态记录解除结扎后心电图，即解除结扎后立即、10秒、20秒、30秒、60秒、2分、4分、6分、8分及10分钟的心电图。观察心律正常的出现、类型(异位节律、室速、室颤)、发生的时间，有否死亡。,将家兔称重，麻醉后仰卧固定于兔手术台上。分离气管，插入气管插管，连接二导生理记录仪张力换能器，描记呼吸。分离颈总动脉，结扎远心端，近心端插入充满生理盐水的动脉插管，连接二道生理记录仪上压力换能器，描记血压。用2ml注射器抽出动脉插管内的死腔液，然后用填充有肝素生理盐水的l ml注射器取血，迅速套上带橡皮块的针头作血气分析(取血切忌与空气接触，如针管内有小气泡要立即排除)。,(二)呼吸衰竭动物模型复制,1复制窒息动物模型 （1）用弹簧夹将气管插管上端侧管所套橡皮管完全夹住，使动物处于完全窒息状态或在完全夹住的橡皮管上插2个9号针头，造成动物不全窒息8-10分钟时，取动脉血作血气分析并观察呼吸变化。 (2)立即放开弹簧夹，等10分钟，待动物恢复正常。,2复制气胸动物模型 (1)描记正常呼吸、血压曲线，接着于家兔右胸第45肋间处切开皮肤，分离肌肉，暴露胸膜。将经三通管与水检压计相连的塑料导管插入胸膜腔注入空气，造成右侧气胸，5分钟10分钟后取动脉血作血气分析，同时测定胸内压。描记呼吸、血压曲线。 （2）用5Oml注射器连接三通管，将胸腔内空气抽尽，拔出塑料导管(注意胸腔内的空气一定要抽尽)。 (3)观察10分钟20分钟，待动物呼吸、待动物呼吸、血压恢复正常。 3复制肺水肿动物模型 (1)从耳缘静脉缓慢注入油酸(0.06mlkg0.08mlkg)，于注后30分钟、60分钟取动脉血作血气分析，并观察呼吸、血压变化。 (2)出现明显的血气及呼吸变化后，处死动物，解剖观察肺变化，并测量肺系数。 (3)切开肺脏，观察有无泡沫样液体流出。,1CCI4肝脏中毒性损伤动物模型复制 四氯化碳进入动物体内后，可直接进入肝细胞，使线粒体膜的脂质溶解，从而影响线粒体的结构和功能，使酶蛋白合成减少，造成酶的破坏及释出的障碍，因而影响代谢及能量的生成，使肝细胞发生变性、坏死。采用此种动物模型可观察到急性肝炎时的糖、脂肪、蛋白质色素等方面的代谢障碍；肝脏解毒功能降低；以及迅速出现的营养不良、脂肪变性、肝坏死等形态学改变。不同剂量的CCI4及不同的给药途径可制成相应的急性中毒性肝炎或肝坏死。 常用实验动物有小鼠、大鼠、兔、猫。,（三)肝功能衰竭动物模型复制,(1)小鼠、大鼠 用CCI4 0.5ml/l00g体重作皮下注射，可诱发大鼠脂肪肝、肝硬变。用40%CCI4橄榄油O.4ml，一次性口服可诱发小鼠肝小叶中央坏死。 用CCI4 0.2mll00g体重做皮下注射，可诱发大鼠肝细胞水泡样变性、缺氧、肝小叶中央坏死。 用CCI4矿物油0.033mll00g体重做腹腔注射，可诱发大鼠脂肪肝、肝小叶中央坏死。 CCI4 0.5ml1.0ml只一次性口服，可诱发大鼠肝小叶中央坏死。 用CCI4 0.5ml10g体重一次性口服，可诱发大鼠急性中毒性肝坏死。,（2)兔 用CCI4 1.2mml/kg体重一次性口服，可诱发兔肝小叶中央坏死。 用CCI4 1.0mlkg体重一次性口服，可诱发兔急性中毒性肝坏死。 （3）猫 用CCI4 0.3mlkg体重一次皮下注射，可诱发猫肝小叶中央坏死、脂肪肝。,注意事项： 四氯化碳常配成乳化剂使用，如要配成20%乳剂，可取5ml植物油和5g阿拉伯胶，放在乳钵中研匀，再加纯CCI410ml研匀，然后加蒸馏水10ml-15ml调成乳状，最后加蒸馏水，使总量达到100ml，使用时摇匀。,2手术切除肝功能不全动物模型复制 取家兔1只，体重2kg3kg，固定于兔台，剪去腹壁正中的毛，沿上腹切口周围采用1%普鲁卡因局部麻醉。 作上腹正中切口，长约7cm8cm。打开腹腔，暴露出深红色肝脏，剪断肝与横膈之间的镰状韧带。再将肝叶向上翻，剥离肝胃韧带。 用丝线结扎肝左外叶、左中叶、右中叶和方形叶的根部，阻断血流后切除，仅保留右外叶和尾状叶。 沿胃幽门找出十二指肠，在肠壁上剪一小切口，插入小导管5cm，作荷包状缝合固定，以备灌入氧化铵溶液。分层缝合腹膜、肌层、皮肤切口。 每隔5分钟向十二指肠导管中注入复方氯化铵溶液5ml，观察呼吸、角膜反射、疼痛反射，直至家兔出现痉挛抽搐为止，计算用去的复方氯化铵溶液总量。注射复方氯化铵溶液时应防止漏入腹腔。,取杂种犬，体重为2232kg。将犬在戊巴比妥钠麻醉下进行手术。暴露一侧输尿管，插入导管收集尿液。游离肾动脉，注意勿损伤肾脏神经，将血管造影导管插入股动脉，小心用手把它向肾动脉推进，但不能妨碍肾血流，由此测定肾血流。经由一侧肾动脉按照0.75g(kg分钟)的剂量和速度注入去甲肾上腺素。注入药物30秒内，肾血流减少到零，且对侧肾血流也略减少。连续滴注去甲肾上腺素40分钟停药。停药后收集尿液，与用药前、用药后3小时的尿量比较。同时采血检查肾功能，测菊糖清除率以了解肾小球滤过率，测对氨马尿酸清除率以了解肾血流量的变化。一般用药3小时后，肾血流减少，菊糖清除率显著降低，肾小球的滤过严重抑制，动物在输注去甲肾上腺素期间，总血容量没有明显改变，而平均血压在用药开始的515分钟有短暂的升高，此模型较适用于观察药物对急性肾功能衰竭的疗效。,(四)肾功能衰竭动物模型复制,1新鲜鲩鱼胆汁致大鼠多器官功能衰竭动物模型复制 (1)用标准吸管吸取鲜鲩鱼胆汁1ml，按比重法测比重并换算毫升数。 (2)于实验前48小时灌胃380mg100g体重的鲩鱼胆汁。 (3)用1%戊巴比妥钠35mg100g体重进行腹腔麻醉，并固定于鼠台上。 (4)手术分离大鼠一侧颈动脉，取血1ml做血气、酸碱指标。 (5)切开颈动脉，将切口对准洁净的试管口，抬高鼠尾部，用试管接血6ml，2000rpm离心15分钟，分离血清以备检测胆红素、尿素氨、肌酐等。 (6)解剖动物内脏、肉眼观察肝、肾、肺和胃肠等的变化。,(五)多器官功能衰竭动物模型复制,2内毒素致家兔多器官功能衰竭动物模型复制 (1)取健康家兔，体重为2kg3kg，从兔耳缘静脉注入0.1%内毒素0.3ml/kg体重。 (2)将兔用3%戊巴比妥钠1mlkg体重作耳缘静脉注射，麻醉后固定于兔台，作气管插管、颈动脉插管，接传感器并连接多导生理记录仪。 (3)注入内毒素后60分钟、240分钟，分别记录心率、血压、呼吸和心电图，另取颈动脉血1ml(注意肝素化和隔绝空气)，用血气分析仪检测血气和酸碱指标。 (4)继续取动脉血6ml，2000rpm，15分钟离心分离血清，检测胆红素、BUN等，检测各血清值的变化。 (5)实验结束前用快速放血法处死家兔，游离气管和肺脏，取出全肺计算肺系数。肺系数=肺湿重(g)动物体重(kg)。,第三节 肿瘤动物模型,在肿瘤防治研究中，动物模型是主要的研究对象和实验材料之一。已知的肿瘤动物模型种类很多，可分为三大类：自发性肿瘤动物模型、诱发性肿瘤动物模型和移植性肿瘤动物模型。,一、发性肿瘤动物模型 自发性肿瘤动物模型(animal model of spontaneous tumor)是指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下发生肿瘤所形成的模型。自发性肿瘤动物模型多来自近交系动物，如A系和C3H系小鼠自发性乳腺癌、C58和AKR等品系小鼠自发性白血病、兔的自发性乳头状瘤等。其中以小鼠的各种自发性肿瘤在肿瘤实验研究中应用较多。,二、诱发性肿瘤动物模型 诱发性肿瘤动物模型(animal model of induced tumor)：是用致癌因素在实验条件下诱发出动物肿瘤所形成的模型。由于诱发因素和条件可人为控制，诱发率远高于自然发病率，故在肿瘤实验研究中较自发性肿瘤动物模型更为常用。,用于诱发肿瘤的动物以哺乳动物为主，啮齿类动物如小鼠、大鼠、豚鼠等应用最广，它们因种系不同对相同致癌因素的反应性也有差异，在实验时要注意选择使用。常用诱发肿瘤动物模型的实验方法有：经口给药法（如灌喂等）、涂抹法、注射法、器官灌注法、穿线法、埋藏法等。可以诱发动物肿瘤的因素很多，如放射线局部照射、各种化学致癌物(烷化剂、亚硝胺类、芳香胺类等)、生物毒素(如黄曲霉素)、细菌(如幽门螺旋杆菌)、RNA和DNA肿瘤病毒感染等，均可起动物实验性肿瘤。,下面分别介绍诱发性肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、皮肤癌模型的复制方法。,(1)肝癌 1934年Yeshida首先用邻位氨基偶氮甲苯(O-AAT)诱发大鼠肝癌获得成功，1937年Shear用O-AAT又诱发了小鼠肝细胞癌。除O-AAT外，二乙基亚硝胺(DEN)、4-二甲基氨基偶氮苯(DMAAB、DBA)、黄曲霉毒素 (AFB1)等，均能诱发实验动物形成肝癌模型。,二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌：取体重250g左右的封闭群大鼠，雌雄不限，按性别分笼饲养。除给普通食物外，并用0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为l0mgkg，每周1次，其余每天用0.025DEN水溶液放人水瓶中，任其自由饮用，约4个月后可诱发肝癌；单用0.005%DEN搀入饮水中口服8个月亦能诱发成肝癌。,4-二甲基氨基偶氮苯(DMAAB)诱发大鼠肝癌：用含0.06%DMAAB的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2不应超过1.52mgkg，46个月即可诱发肝癌。 邻位氨基偶氮甲苯(O-AAT)诱发小鼠肝癌：用含1%O-AAT溶液(即0.1ml含1mg)涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次23滴，一般涂100次,实验后78周即可出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发55的实验小鼠发生肝癌；或用2.5mgO-AAT溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每次间隔10d，也可诱发成肝癌。 黄曲霉素B1(AFBl)诱发大鼠肝癌：每日饮料中混入(0.0010.015)10-6的AFBl，连续喂6个月，肝癌诱发率达80。,(2)胃癌 建立胃癌模型常用致癌物有甲基硝基亚硝基胍(MNNG)、甲基苄基亚硝胺(MBNA)和3-甲基胆蒽(MC)等。所用的实验动物，包括：小鼠、大鼠、地鼠、犬等。,MNNG诱发小鼠胃腺癌： KM小鼠，体重1822g，以500pgml MNNG溶液灌喂小鼠，3次周，0.4ml次，12个月后增至0.6ml次，约19个月诱发出23.5(8/34)胃腺癌。或加入200500pgml的MNNG于饮水中，自由饮水，实验过程中不再给予其他饮水，19个月后诱发出16.7%(424)的胃腺癌，并有部分十二指肠腺癌和前胃乳突状瘤。,MNNG诱发大鼠胃腺癌： 纯系Wistar雄性大鼠，体重100g左右，自由饮水，加入0.01的MNND（100g/ml）隔日一次，试验过程不再给其他饮水。 用MC线结穿挂小鼠腺胃诱发胃腺癌： 取20g左右的小鼠，行无菌手术，在腺胃（胃体）粘膜穿挂含MC的线结。含MC的线结是用普遍细线，在一端打结后，将线结置于盛有MC的玻璃试管内，在酒精灯上微微加热，使MC液化渗入线结。一般MC的量为0.050.1g，可制1020根线，每条线结合MC约5mg。手术埋线后半个月左右即可形成早期浸润癌，34个月诱癌率最高，且诱发的小鼠胃腺癌组织形态与人类胃癌相似。,（3）肺癌 在实验动物身上诱发肺癌，要比诱发其他部位的肿瘤困难得多。因为呼吸道给药时，由于气管或支气管上皮纤毛运动将致癌物排出，致使诱癌率降低。为此，介绍两种必经过呼吸道给药的方法。 二乙基亚硝胺(DEN)诱发小鼠肺癌：小鼠每周皮下注射含1DEN水溶液1次，每次剂量为56mgkg。结果：DEN总剂量达868mg、观察时间为100d左右时、发癌率可达40%；DNE总剂量达1176mg、观察时间为半年时、发癌率达94，其中支气管鳞癌最为多见，约占41%。 乌拉坦诱发肺腺癌：A系小鼠(11.5月龄)较大鼠敏感，每次每只腹腔注射乌拉坦生理盐水液0.10.3ml，间隔35d再注，共注23个月，每只小鼠用量约为100mg，注射后3个月肺腺癌发生率为100，且多数为多发性，诱发的肺肿瘤部位和组织类型也与人类肿瘤相似。,（4）膀胱癌 致癌物N- 4(5 -硝基-2-呋喃)-2-噻唑基甲酰胺(FANTF)和N-丁基-N-4-羟(基)丁基亚硝胺(BHBN)可诱发大鼠、小鼠产生膀胱癌。从组织学观察，大部分肿瘤为移行上皮癌，占90以上，与人膀胱癌相类似，被认为是有用的人体膀胱癌动物模型。 FANTF诱发大鼠膀胱癌：选用250g左右的刚断奶的Fischer(F344)大鼠，用含0.2FANTF的饲料喂养，服用2536周，随机控制饮食，所有大鼠在20月龄之前死于膀胱癌。 BHBN诱发大鼠膀胱癌：在饮水中投喂0.05BHBN给雄性Wistar大鼠至12周，100%发生膀胱癌；而投喂至8周停止，在40周末时则有90发生膀胱癌。用BHBN诱发的膀胱癌织学类型为移行细胞癌(91.5)、鳞状细胞癌(3.3)、未分化癌(2.5)及肉瘤(0.3%)，这与人类患者所见的情形相似。,(5)结肠癌 大鼠自发性结肠癌很少见，一般发生率为1或更少。因此，常用大鼠诱发结肠癌模型。致癌物二甲基苄肼(DMH)和甲基硝基亚硝基胍(MNNG)均可用来诱发大鼠结肠癌。 其中前者具有致癌性强、器官选择性高和既可口服又可注射等特点，使用最为普遍。 二甲基苄肼(DMH)诱发大鼠结肠癌：选用4月龄雄性Wistar大鼠，将DMH先配成100ml中含400mg的溶液，加 EDTA（乙二胺四乙酸）27mg，用0.1molL NaOH调pH至6.5，用此溶液注射大鼠，每次剂量21mgkg,每周1次，连续21周。最后次给药后14周处死动物，结肠癌的诱发率为81100，诱发的结肠癌绝大多数为腺癌。,（6）鼻咽癌 二甲基胆蒽(MC)插管法：选体重120g左右大鼠，雌雄均可。取直径23mm的硬质塑料管在酒精灯上小火拉成锥形，每段长约3.5cm，管内填以结晶体MC，小管一端用火封闭，以防药物外溢，尖端用针刺数孔，使MC能从小孔溢出，将含有MC的塑料小管插入鼻腔，待半年以后动物自行死亡, 取其鼻咽部，10福尔马林固定，脱钙后，石蜡包埋，进行连续切片，发癌率可达60。 二乙基亚硝胺(DENA)滴鼻法诱导鼻咽癌：取120g左右大鼠雌雄均可，乙醚麻醉后，用磨平针尖的8号针头，从前鼻孔轻轻插入，针尖可达鼻咽腔，以注射器灌注1%吐温80配制33.3%DENA混悬液0.02m1(含DENA6.7mg)每周一次，共1520次。DENA停药后继续观察，至半年以上或动物自行死亡时，取其鼻咽部，10福尔马林固定，脱钙、石蜡包埋，连续切片。,（7）食管癌 甲基苄基亚硝胺（MBNA）诱发食管癌：取1月龄以上Wistar大鼠，将1% MBNA溶液加在少量的粉末状饲料中，搅拌均匀，由动物自由摄食，给药量每天0.751.5mg/kg。80100天可见食管鳞状细胞癌的组织和人类的食管鳞癌相似，但很少发生转移，给药时间越长，癌的发生率越高，一般可到80100%，大剂量给药1次即可致癌。,（8）宫颈癌 取雌性小鼠，在麻醉状况下，借助于阴道扩张器及磨钝的弯针，将0.1cm的棉纱线结穿入宫颈，使线结固定于宫颈口，线的另一端则固定于背部肌肉，缝合皮肤，挂线以后，开始连续注射青霉素23天，以防术后感染。在致癌物使用2个月内观察到轻度不典型变化 （度），在3个月后见中度不典型变化(度)，在5个月后观察到重度不典型变化(度)，22%的小鼠肯定有癌症发生，小鼠宫颈癌的发生步骤与人十分相似。,（9）皮肤癌 实验性皮肤癌的复制影响因素很多如动物的种类、致癌物及溶媒，致癌物的浓度涂抹频率及时间长短，皮肤所暴露的范围，致癌物质施于皮肤的方法，都会影响实验结果。常用诱发皮肤癌的方法是用甲基胆蒽等强烈致癌物，虽然实验间期较长，但成功率较高。 取2430g的小鼠，雌雄不限，用硫化钡溶液在背部脱毛，于脱毛部位涂抹0.5甲基胆蒽蓖麻油溶液，每