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第 26 卷增刊 1农 业 工 程 学 报Vol.26Supp.1 2010 年10 月Transactions of the CSAEOct. 2010363 脉冲放电等离子体技术提取黑木耳多糖 马凤鸣 1,2，王振宇1,2，赵海田1，吴志光1 （1哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2东北林业大学林学院，哈尔滨 150040） 摘要：为寻求一种新型的活性成分提取方法，该文使用脉冲放电等离子体提取黑木耳多糖，以脉冲放电电压、液料比 及处理时间作为影响因素，使用响应面法进行条件优化。结果表明，脉冲放电等离子体可以有效提取活性成分，最佳提 取工艺参数为: 脉冲放电电压为 40.3 kV，液料比为 140.5，处理时间为 4.1 min，多糖得率达 8.80%，其中处理时间对 得率的影响程度最大。与传统提取方法相比，脉冲放电等离子体技术具有时间短、耗能低、提取率高等优点。该研究表 明脉冲放电等离子体技术用于黑木耳多糖提取是可行的，并且为脉冲放电等离子体技术用于活性成分提取提供一定的理 论依据。 关键词：工艺，等离子体，提取，脉冲放电，多糖 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2010.z1.064 中图分类号：S225.91+2文献标志码：A文章编号：1002-6819(2010)-Supp.1-0363-06 马凤鸣，王振宇，赵海田，等. 脉冲放电等离子体技术提取黑木耳多糖J. 2010，26(Supp.1)：363368. Ma Fengming, Wang Zhenyu, Zhao Haitian, et al. High voltage pulsed discharge plasma for extracting polysaccharide from Auricularia AuriculaJ. Transactions of the CSAE, 2010, 26(Supp.1): 363368. (in Chinese with English abstract) 0引 言 脉冲放电等离子体技术是近年来发展起来的一种低 温等离子体产生技术1，该技术综合了脉冲电场、脉冲紫 外、 臭氧处理、 脉冲电晕处理各个技术的处理效应2， 具 有处理温度低、速度快、能耗低等优点3，由于其良好的 应用特征而被国内外学者广泛研究。 脉冲放电等离子体技术处理液体物料的作用方式是 将气体鼓泡充入被处理液体中，电脉冲作用到液体中的 气体上，使注入气泡被电离，导致气泡的局部放电，形 成等离子体2。该过程是一个极其复杂的过程，它不仅能 在放电时形成强电场、非平衡等离子体通道，还能伴随 强紫外光辐射；而等离子体通道中富集了离子、电子、 激发态原子、分子（O3，H2O2）和大量的活性物质（ OH， H ，O 等） ，这些复杂的放电现象能引发一系列的物理、 化学和生物反应，破坏物质的化学结构或生理结构，从 而达到杀菌的目的1。 目前，脉冲放电等离子体技术在医疗器械和食品的 杀菌领域已经显示了出了独特的优越性，对大肠杆菌等 菌种具有十分显著的钝化作用，并且具有十分显著的破 坏细胞的作用4- 11。作为一种横跨电子学、化学、微生物 学、物理学、工程技术等多门学科的交叉学科。特别是 脉冲电场提取技术已被公认为国际上研究最热门的提取 收稿日期：2009- 08- 24修订日期：2010- 06- 01 作者简介：马凤鸣（1981） ，男，山西吕梁人，主要从事物理技术在食品 加工中的应用研究。哈尔滨哈尔滨工业大学食品学院，150090。 Email： 通信作者：王振宇（1957） ，男，黑龙江哈尔滨人，教授，主要从事食 用植物极端环境营养学、 生物分离工程、 功能性食品方面的研究。 哈尔滨哈 尔滨工业大学食品学院，150090。Email： 技术的前提下。脉冲放电等离子体技术完全可以对细胞 内物质的提取等亟待解决的问题提供一种新的研究手 段，然而在这些方面的研究却微乎其微，因此有必要深 入发展和拓宽脉冲放电等离子体技术的应用范围，满足 市场对低能耗、低操作费用、高效的高新技术的要求。 黑木耳是中国珍贵的药用和食用胶质真菌,其中具有 重要生物活性的是其所含的多糖。有多项研究证实:黑木 耳多糖有抗凝血、抗血栓、增强机体免疫功能及降血脂 等多种功效12。因此，对黑木耳多糖的提取与利用就成 了首要问题。目前从黑木耳子实体中提取黑木耳多糖的 技术常用的主要有:热水浸提法、 超声波法、 微波法等13。 但是，热水浸提法存在着有效成分损失大、周期长、工 序多、提取率不高等缺点14。超声波、微波处理时间过 长，导致多糖结构发生变化,糖链断裂,使多糖萃取含量下 降。同时，这些方法有着成本高、产品安全性低等缺 点15- 17。 因此，本试验利用脉冲放电等离子体技术作为提取 手段，采用响应面法进行正交试验设计，在单因素试验 的基础上研究了影响黑木耳中多糖得率的关键因子:脉冲 放电电压、液料比、处理时间，用响应面法对提取条件 进行优化，希望为脉冲放电等离子体技术在活性成分方 面利用提供科学依据，开发一种新的提取技术。 1材料与方法 1.1试验材料 黑木耳：市售，产于黑龙江省。 主要试剂：浓硫酸、乙醇、重蒸苯酚、葡萄糖、过 氧化氢、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、乙醚，均为国产分 析纯。 364农业工程学报2010 年 1.2试验仪器 FW100 型高速万能粉碎机（北京光谱仪器有限公 司） ， T6 型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任 公司） ，TDL- 5 型台式离心机（上海安享科学仪器有限公 司） ，ALC- 110.4 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有 限公司） ， FD- 1 型真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪 器有限公司） ，R- 201 型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术 有限公司） ，TDA- 8002 型水浴锅（天津市泰斯特仪器有 限公司） ，JY92- 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技 股份有限公司)，脉冲放电等离子体处理系统（哈尔滨工 业大学自制，见图 1） 。 电容脉冲放电电路，脉冲电压 050Kvk 可调；脉冲 宽度 20 s；脉冲频率 0200Hz 可调；不锈钢电极板，极 板间距 2 mm；旋转火花隙开关电源。 图 1脉冲放电等离子体处理系统 Fig.1Schematic of pulsed discharge plasma treating system 1.3黑木耳多糖的提取及制备 黑木耳粉末浸泡脉冲放电等离子体提取离心 分离浓缩醇沉无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤脱蛋 白冷冻干燥野生黑木耳粗多糖测定多糖得率。 称取黑木耳粉末，以一定的液料比浸泡 2 h 后，以脉 冲放电等离子体进行提取处理，提取液离心分离。上清 液减压浓缩，醇沉，离心分离得多糖沉淀物。沉淀依次 用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，savage 法脱蛋白，重复 7 次（直至在 280 nm 光谱处检测不到蛋白质为止） ，冷冻 干燥，得到黑木耳多糖粗品18- 19。 1.4多糖标准曲线绘制及样品多糖得率测定 采用苯酚- 硫酸法20测定提取液中多糖得率。 多糖得率(%)=多糖质量/子实体干质量100%（1） 1.5单位质量多糖能量消耗计算 单位质量多糖提取能量消耗（J/g）=（功率处 理时间）/多糖质量 1.6脉冲放电等离子体作用条件单因素试验 使用脉冲放电电压、液料比、处理时间 3 个因素作 为单因素，进行脉冲放电等离子体提取黑木耳多糖的单 因素试验，根据试验结果设计正交试验的水平值。 1.7响应面法优化提取工艺条件 根据单因素试验结果， 以脉冲放电电压、液料比、 处理时间 3 个因素为自变量，黑木耳多糖得率为响应值， 进行 3 因素 3 水平正交试验，使用 MINITABL15 软件， 根据 Box- Benhnken 的中心组合试验设计原理，采用响应 面法对脉冲放电等离子体提取黑木耳多糖的条件进行优 化。试验因素与水平设计见表 1。 表 1响应面分析因素水平编码表 Table 1Coded levels of variables of response surface method 因素 编码水平 脉冲放电电压(X1)/kV液料比(X2)处理时间(X3)/min - 130303 040404 150505 2结果与分析 2.1单因素试验 2.1.1脉冲放电电压对得率的影响 称取 12.5 g 黑木耳粉末，以液料比值 40 浸泡 2 h， 分别在脉冲放电电压 10、20、30、40、50 kV 下脉冲放 电等离子体提取 4 min 后， 离心， 取上清液测定多糖得率。 图 2脉冲放电电压对多糖得率的影响 Fig.2Effects of discharge voltage on polysaccharide extraction 如图 2 所示，脉冲放电电压在 1040 kV 之间时， 黑木耳多糖得率随脉冲放电电压的增大而增加，当电压 增加到 40 kV 时， 多糖得率最大， 由 5.40%增加到 8.68%， 然后多糖得率呈明显的下降趋势。当脉冲放电电压增加 到 50 kV 时，黑木耳多糖的得率为 5.01%，比 40 kV 时的 多糖得率下降了 3.67%， 这可能是由于当脉冲放电压高于 50 kV 时，多糖会被降解，造成得率降低。因此，脉冲放 电电压在 40 kV 为宜。 2.1.2液料比对得率的影响 称取 12.5 g 黑木耳粉末，分别以 20、30、40、50 和 60 的液料比浸泡 2 h，在 40 kV 脉冲放电电压下处理 4 min，离心，取上清液测定多糖得率。 如图 3 所示，液料比值在 2040 之间时，黑木耳多 糖得率随液料比值的增大而明显提高，由 4.15%提高到 8.68%，在液料比值为 40 时达到最大，继续增大液料比 增刊 1马凤鸣等：脉冲放电等离子体技术提取黑木耳多糖365 值，黑木耳多糖得率呈下降趋势。因此，液料比以 40 为 宜。 图 3液料比对多糖得率的影响 Fig.3Effects of ratio of material to solvent on polysaccharide extraction 2.1.3处理时间对得率的影响 称取 12.5 g 黑木耳粉末，以液料比值 40 浸泡 2 h， 在 40 kV 脉冲放电电压下分别处理 1、2、3、4、5 min， 离心，取上清液测定多糖得率。 如图 4 所示，处理时间在 14 min 之间时，黑木耳 多糖得率随处理时间的增大而增加，由 5.75%增加到 8.68%当处理时间增加到 4 min 时，多糖得率最大，大于 4 min 多糖得率呈明显的下降趋势。当处理时间增加到 5 min 时，黑木耳多糖得率为 6.04%，比 4 min 时的多糖 得率下降了 2.64%，这可能是由于在脉冲放电压 40 kV， 处理时间大于 4 min 时，多糖被降解，造成得率降低。因 此，处理时间以 4 min 为宜。 图 4处理时间对多糖得率的影响 Fig.4Effects of discharge time on polysaccharide extraction 2.2响应面分析法对脉冲放电等离子体提取工艺优化 2.2.1响应面分析方案及结果 根据表 2 安排试验， 对试验结果回归拟合所得回归 模型如下： Y=8.81522+0.142408X1+0.142321X2+0.142321X3 2.13827X121.74065X22- 1.27000X32+0.0156389X1X2 0.0912979X1X3+0.362469X2X3 由表 3、4 可知， 决定系数 R2=98.26%，响应面回归 模型高度显著（P=0.001） ，模型失拟项（P=0.124） ，不显 著，说明该二次模型可以较好地描述各因素与响应值之 间的真实关系。 表 2响应面分析方案及试验结果 Table 2Response surface method experimental design (in coded level of three variables) and experimental results 试验号 X1 脉冲放电 电压/kV X2 液料比 X3 处理时间/ min Y 多糖得率/ % 1- 1- 104.41771 21- 104.66626 3- 1105.17507 41105.48617 5- 10- 14.89848 610- 15.37088 7- 1015.62560 81015.73281 90- 1- 15.99893 1001- 15.05464 110- 115.82956 120116.33515 130008.68027 140008.98127 150008.78412 表 3响应面分析优化后模型的系数检验 Table 3Parameter estimate of regression model of response surface method 项系数系数标准误TP 常量8.815220.192345.8330.000 X10.142410.11781.2090.281 X20.142320.11781.2080.281 X30.275020.11782.3350.067 X1X1- 2.138270.1734- 12.3340.000 X2X2- 1.740650.1734- 10.0400.000 X3X3- 1.270000.1734- 7.3260.001 X1X20.015640.16660.0940.929 X1X3- 0.091300.1666- 0.5480.607 X2X30.362470.16662.1760.082 注：R2=98.26%。 表 4响应面回归模型方差分析 Table 4Variance analysis(ANOVA) of regression model of response surface method 来源自由度平方和均方和F值P值 回归931.27943.4754931.320.001 线性30.92940.309792.790.149 平方329.79019.9300589.480.000 交互作用30.55990.186621.680.285 残差误差50.55490.11098 失拟30.50810.169387.250.124 纯误差20.04680.02338 合计1431.8343 图 57 分别为脉冲放电电压、液料比、处理时间 3 366农业工程学报2010 年 因素影响多糖得率的响应面及等高线分析图。 由图 57 可知，处理时间对脉冲放电等离子体多糖 活性成分提取得率的影响最大。脉冲放电电压和液料比 影响较小。依据回归模型的数学分析并综合响应图确定 脉冲放电等离子体提取黑木耳多糖的最佳工艺参数为： 脉冲放电电压 40.31044 kV，液料比 40.52965，处理时间 4.114719 min。回归模型预测的得率理论值为 8.84%。 取脉冲放电电压 40.3 kV，液料比 40.5，处理时间 4.1 min，试验重复 3 次。3 次平行试验的多糖得率分别为 8.98%，8.74%和 8.69%，平均得率为 8.80%，与理论预测 值相比相对误差为 0.003%，可见该模型能较好地模拟和 预测脉冲放电等离子体提取多糖的得率。 图 5Y = f(X1, X2)的响应面与等高线 Fig.5Response surface plots and contour plots of discharge voltage (X1) and ratio of material to solvent (X2) 图 6Y = f(X1, X3)的响应面与等高线 Fig.6Response surface plots and contour plots of discharge voltage (X1) and discharge time (X3) 图 7Y = f(X2, X3)的响应面与等高线 Fig.7Response surface plots and contour plots of ratio of material to solvent (X2) and discharge time (X3) 增刊 1马凤鸣等：脉冲放电等离子体技术提取黑木耳多糖367 3对比试验结果与分析 取 12.5 g 黑木耳粉末，以液料比值 40 浸泡 2 h，分 别使用脉冲放电等离子体（脉冲电压 40 kV）和超声波 （1 200 W）处理 4 min，离心，取上清液测定多糖得率。 对比试验结果如表 5 所示。经脉冲放电等离子体技 术处理后，黑木耳粗多糖溶出率高于超声波提取方法。 脉冲放电等离子体单位质量多糖能量消耗为 0.0024 J/g； 超声波单位质量多糖能量消耗为 7.2661 J/g。说明脉冲放 电等离子体技术细胞破壁效果要好于超声波法。 表 5对比试验结果 Table 5Result of comparison experiment 方法多糖得率/%能耗/(Jg- 1) 脉冲放电等离子体8.860.0024 超声波7.347.2661 另外，据相关文献报道，陈艳秋等21使用热水浸提 法提取黑木耳多糖，浸提时间为 90 min，浸提温度为 115，多糖得率为 5.48%；张钟等22采用微波法辅助提 取野生黑木耳多糖， 微波功率为 560 W、 提取时间为 35 s、 萃取时间为 3 h，多糖提取率达 7.12%，能量消耗为 15.2934 J/g； 刘大纹等23利用采用超微粉碎法和超声波协 同纤维素酶酶解提取黑木耳多糖，超微粉碎法 80水浴 条件下恒温 6 h，多糖得率为 5.79%；直接采用超声波协 同纤维素酶酶解超微粉碎的样品处理 160 min，多糖得率 为 8.64 %。朱磊等24采用响应面法对黑木耳多糖的微波 辅助提取工艺进行研究，能量消耗为 5.6800 J/g。 由以上分析可知，经脉冲放电等离子体技术处理后， 黑木耳粗多糖溶出率高于其他提取方法,能量消耗少，说 明脉冲放电等离子体技术效果明显。 4讨论 本试验首次使用脉冲放电等离子体进行黑木耳多糖 的提取试验研究，由于脉冲放电等离子体作用程度还受 到极板类型、气体种类等因素的影响。因此，关于脉冲 放电等离子体提取活性成分还需要进一步深入的研究。 此外，将脉冲放电等离子体作为辅助手段，与热水浸提 相结合使用进行有效成分提取，在以后的研究工作中， 这都是我们应该研究的方向。 另一方面，由于脉冲放电等离子具有降解有机物的 作用， 从试验结果可以看出处理时间大于 4 min 或脉冲放 电电压大于 4 kV 得率降低，都可能是由于多糖被降解， 因此，将该技术运用于活性成分降解，特别是一些热敏 活性成分的降解，可能是将来的研究方向。如将脉冲放 电等离子体运用于大分子多糖降解，利于生物吸收入体 内发挥生物活性，将大豆蛋白质水解转化为肽或者氨基 酸，可以改善大豆蛋白质的品质，提高营养价值等方面， 这些都将具有十分重要的意义。 5结论 1）脉冲放电等离子体提取黑木耳多糖的最佳提取工 艺参数为：脉冲放电电压为 40.3 kV，液料比为 140.5， 处理时间为 4.1 min。在此条件下多糖得率达 8.80%。 2）在试验范围内，处理时间对脉冲放电等离子体提 取多糖影响程度最大，脉冲放电电压和液料比影响较小。 3）脉冲放电等离子体技术较其他方法具有处理时间 少，能量消耗小等优点。 参考文献 1王翠华，李国锋，吴彦，等填充床放电等离子体反应器 对铜绿微囊藻的生长抑制J环境科学，2008，29(2)： 368374 Wang Cuihua,Li Guofeng,Wu Yan, et al. Growth inhibition of microcystis aeruginosa in packed- bed discharge plasma reactorJ. Enovironment Science, 2008, 29(2): 368374. (in Chinese with English abstract). 2Lisa Marsilia, Steven Espieb, John G. Andersona, et al. Plasmainactivationoffood- relatedmicroorganismsin liquidsJ. Radiation Physics and Chemistry, 2002, 65(4): 507 513. 3刘芳，黄海涛，黄绍松，等低温等离子体灭菌的研究进 展J环境与健康杂志，2007，24(5)：267369 Liu Fang, Huang Haitao, Huang Shaosong, et al. Research advance of low- temperature plasma sterilizationJ. Journal of Environment and Health, 2007, 24(5): 267369. (in Chinese with English abstract). 4Jason Wan, John Coventry, Piotr Swiergon, et al. Advances ininnovativeprocessingtechnologiesforMicrobial inactivation and enhancement of food safety - pulsed electric field and low- temperature plasmaJ. Trends in Food Science 2. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150090, China) Abstract: For the sake of developing new techniques of extraction.