天然稳定性同位素示踪法在生态系统食物网及其相关领域的研究.ppt

第18章.天然稳定性同位素示踪法在生态系统食物网及其相关领域的研究,中国农业大学 齐孟文,示踪依据 天然环境稳定性同位素示踪法被广泛应用于环境及生态学的研究，已成为生态系统食物网及相关研究的重要手段，所涉及领域包括：动物的食性、栖息地、迁徙、食物网、生态系统的能量流动及其系统结构与功能关系等诸多领域。在有关食物网及其关系的研究中，示踪的基本依据抱括： 1）生态系统中不同的初级生产者因光合作用途径不同而13C不同。事实上，C3作物（tree，shrubs，and forbs），C4作物（grasses），CMA作物因,光合作用途径不同引起的同位素分馏效应的差别使其不同类型作物的13C的分布是可区分和不完全重叠的（Smith &；Epstein 1971；Vogel et al.1978），类似的情况，在森林系统的树梢物和林下物间，不同生境植物种间，陆生与水生植物间也可能存着13C的差别。因此13C主可用于动物食性、对不同食物源的依赖程度，栖息地及寄生与宿主关系等分析； 2）在一定的生态系统中，食物在重组代谢过程中的同位素分馏效应基本上是一致的，即消费者的同位素变异系数相对于食物的飘移基本上是一定值，对13C其富集度的平均变化为0-1 （DeNiro and Epstein 1978）；,对15N为2.6(Owens 1987)到3.4(Minagawa and Wada 1984),营养级间 15N的飘移较大，15N一般用于确定消费者在食物链中的营养级次，和构建生态系统的食物网；3）稳定性的D和18O具有地理区位的指纹特性，当在地理上有明显差异时，可用被用于标识动植物的原产地，研究候鸟迁徙途径等。在降雨形成过程中，水汽沿地球纬度做长距离运动途中，会不断降落与重蒸发，使轻的水分子在继续运动的水汽中相对富集，结果形成地理上降水中氢和氧同位素的不同分布模式，其一般受纬度、温度梯度、海拔、水汽产生与降雨地点间的距离等因素的影响，并有季节性变化，,这种分布的差异将映射到植物上，并表现在更高的食物级别，因此可作为地理起源的原位表记。 传统的食性分析一般采用观察、胃容物及粪便分析法进行，这些方法一般不易定量且费时费力；胃容物分析只表明分析时的采食情况，不能可靠说明各生长阶段的情况；对微生物系统而言，因微生物个体小及生长的隐蔽性（cryptic growth），传统方法受到很大限制。相对传统方法，天然环境稳定性同位素示踪法为生态系统食物网的研究提供了强有力的工具，同位素的构成是机体代谢及其与环境相互作用累积效应的结果，,按照动物组织周转代谢的快慢不同，依其在不同时间段的摄食情况，通过跟踪生态系统的能量流动，可以把整个生态系中从最初级生产者的到最顶端消费者的相关系揭示出来，为从根本上研究生态系统的结构与功能提供了可能。 1.食物的食性贡献 1.1标准混合模型 在环境生态学研究中，确定混合物中各成分来源的相对贡献时，常采用线性质量平衡模型。例如，若动物只有两个食物源情况，可采用单同位素（比如13C）的质量平衡模型确定，表示为：,式中，下脚标X，Y和M代表两个食物源和动物体，f代表食物源在消费者饮食构成中所占的百分数，13C是13C的变异数，13C称为消化分馏校正系数(因同化代谢)。上式的比例系数f表示食物碳的比例，而非食物生物量的比例。考虑消化性的差异，f实际代表被同化碳的比例，而非被摄入碳的比例。 同时使用两种同位素，比如13C 和15N，可确定三个食物源，基于质量平衡的线性混合模型为：,式中，X，Y，M和f定义如上，Z是第三个食物源，为简化书写，这里令 ，余者类推。以上方程组一般是线性独立的，当方程的系数确定后，可求解每一食物源贡献的比例数f。,在应用以上模型时，应保证重要的食物源未遗漏，不同食物源的同位素构成有明显差异，但各食物源的同位素构成变异较小，最终，以两同位素为坐标变量的平面上，代表混合物（动物体）的点必须落在以由三个源（经消化分馏校正）为顶点的三角形内，假若不是，那么可能：1）重要的食物源被遗漏；2）营养分馏校正值取值不对；3）线性混合模型的假定不成立。,1.2浓度权重混合模型 标准混合模型隐含一假设，即消费者从每一食物源所获得的碳的相对比例与所获得的氮的是相同的，如果食物源中碳和氮的浓度相近，该假设成立，但更一般的情况是从每一食物源得到碳和氮元素相对比例是不同的，这时方程应修改为：,式中，13C，15N代表各食物源及混合源中C及N同位素的变异系数，该值已作消化分馏效应的校正，用上一撇表示，f是代表各食物源相应成分贡献的相对分数，下脚标的第一个字母X，Y，Z为相应的食物源，M为消费者，下脚标的第二个字母代表C、N元素或生物量B。,令Cx，CY，CZ，Nx，NY，NZ代表食物源X，Y，Z中C和N的浓度，则对于C有：,同样对于N有：,为求fX，B，fY，B和fZ，B，对以上相关方程进行代换，得： 将以上方程写成矩阵的形式有：,以上方程可以推广到n个元素和n+1个源的情况，该模型除了用于动物的食性分析外，也可用于土攘或植物水资源的分析，地球化学资源调查，土壤有机质周转和动物迁徙模式的研究。 参考文献 Donald L.Phillips(2002) Incorporating concentration dependence in stable isotope mixing models. Oecologia 130:114-125. Keywords Mixing model. Stable isotope. Carbon :nitrogen ratios. Concentration.Dietary analysis,1.3欧氏距离模型 该模型基于在欧氏空间上样品点的同位素的分析，计算捕食者P与食物Ai二者同位素之间的欧氏距离，认为食物对动物的贡献与其欧氏距离成反比，距离越小，其贡献越大，测定动物食谱中每种食物所占比例的欧氏距离模型的公式为： 式中， 为食物在捕食者食谱中所占的相对贡献， 为捕食者P与食物Ai间的同位素距离（Ben-David et al 1997）。,1.4向量关系模型 在由13C，15N构成的两维坐标平面上，若捕食者P和食物Ai分别由向量 和 表示，两向量之间的夹角称为取食角。越小，捕食向量与食物向量越靠近，捕食者P捕食食物Ai的概率越大。据此定义食物Ai对捕食者P的贡献值：,式中， 和 Z分别为捕食者P与食物Ai向量之间的取食角和欧氏距离。捕食者P与食物Ai的单位向量为： 因，,和 最后有： 食物Ai的贡献率是食物Ai在整个食谱中的相对贡献比，表达式为：,以能量流动方向为划分, 自然界的物种存在着营养级与非营养级两种关系, 营养级关系又分为同级或跨级关系。如果不存在营养级关系，那么=/2，两者一方对另一方的贡献应为零，但因分子和分母都是非负数， 实际取值大于零；当两者为同营养级时，因同位素构成相近，Zs1，s2非常小，而 非常大，但这种情况在营养级关系下是不会出现的，由此推断，Zs1，s2存在一个上界和一个下界。两个物种之间的关系可按如下判别式划分：,表.两种物种之间的关系 参考文献 : 赵亮等用稳定性同位素技术确定高寒草甸生态系统中动物营养级模型.动物学研究,2004,26(6):497-503,2.物种营养位置的计算 2.1以15N为标识变量 在生态系统中,物质及其能量生产与消费的链条联接关系中,每一物种都处在于一定的营养位置, 随着营养级水平上升高,营养元素的重同位素核素的丰度阶梯上升,由于15N的变化幅度较大,常被用于确定物种营养位置的计算,计算公式如下: 式中，TP为物种的营养级位置，T shift为一个营养级的氮同位素的富集度， 分别为消费者和初级生产者的15N。,2.2以为标识变量 在自然条件下，营养元素沿着“植物-植食性动物-肉食性动物）的食物链条传递时，其重的同位素将得到富集，反映到在13C和15N确定的向量平面上，随着营养级的升高，向量角增大。设d是食物的向量角，c是消费者的向量角，cd是消费者向量角与食物向量角的差，称为利用系数，其间的关系为： 大量的研究表明，利用系数cd是一个常数，因而某一消费者的营养级次可由下面公式确定： 式中， 是消费者的向量角， 是第一营养级的向量角。,3.应用范例 1).蔡德陵等.黄东海生态系统食物网连续营养谱的建立.中国科学C辑 生命科学,2005,35(2):123-130 样品采集 样品:浮游植物、浮游动物、悬浮体、沉积物和鱼类。浮游植物用标准小型生物网，浮游动物用标准浮游动物网，均由水底自水表垂直拖网采样。悬浮体由抽滤表层水获得，滤膜是经预先灼烧的Whatman GF/F玻璃纤维滤膜。,样品分析 采集到的浮游动物置过滤海水中1h以排空消化道，所有样品被冷冻后带回实验室。生物样品在实验室缓慢解冻后，浮游植物、浮游动物经剔除杂物或挑选优势种后过滤；悬浮体、沉积物用10%HCl处理以除去无机碳；选取适量的鱼的背部肌肉作为试样，预处理的样品均通过真空干燥后备用。样品在石英密封管经杜马斯法制成CO2和N2气体样品，送入质谱进行碳氮同位素丰度的测定。 结果讨论 基线15N和一营养级上的氮同位素富集度的,确定。浮游植物4和海水中的悬浮物是中小型浮游动物和底栖的滤食性生物的主要食物来源，浮游植物和一些能进行光合作用的细菌通过同化作用将无机物转化为有机物，它们是初级生产者。因初级生产者的15N无论在系统间还是系统内都存在着较大的时空变化，直接利用测定的15N作为计算营养位置的基线可能引入较大的误差，Vander Zanden 等人和Cabana等人建议用珠腓蚌这一类初级消费者的同位素值进行基线校正，这些食植性动物的同位素值的变异较小，实际上起到对初级生产者同位素变化的时间积分和平均的作用。本文中，选取滤食性的贻贝进行基线校正。贻贝的15N为6.05,与食植性浮游动物中华哲水蚤的(6.950.28)相近, 中华哲水蚤等素食者的饵料基本上反映了海区浮游植物的组成情况。考虑到素食性并不是绝对的，其饵食可能会有其它浮游生物，因此15N取其下限似乎更合理些。,在实验室的控制条件下（161）0C，最大摄食），用合成饵料人工饲养鱼苗（3-4cm），半年后长到10cm左右，分析表明：鱼肌肉的15N为11.8,而合成饵料的15N为9.3,两者差为2.5,这一数值被认为是一个营养级的氮同位素富集度。 黄东海主要鱼类营养位置的具体计算公式：,2).万等.利用氮和碳稳定性位素分析渤海湾食物网主要生物种的营养层次.科学通报,2005,50(7):708-712 渤海是我国主要的内海，研究者已对其食物网关系进行了大量研究，但以往的研究主要局限于用胃容物分析法确定各类鱼种的营养层次。本研究利用稳定性同位素分析法，首次研究了该生态系统从低等生物如浮游动植物到高等生物如鸟类的食物网及其主要物种的营养层次。,样品采集 样品：浮游植物、浮游动物、无脊椎动物、经济鱼类、海鸥和鸟蛋。按国标法，浮游植物采集网直径为37cm，长度为140m，网目77m；浮游动物采集网直径为31.6cm，长度为140m，网目160m;虾蟹等无无脊椎动物和鱼类由鱼网采集;海鸥由夹子捕获。,样品分析 鱼及鸟以肌肉作样品，对浮游植物、浮游动物和无脊椎动物，则取一定数量的个体。样品先被匀浆，然后冷冻干燥成干粉，取100mg，加10ml甲醇振荡过夜，离心沉淀，用10ml甲醇洗涤一次，80oC下烘干。准确称量0.5mg甲醇抽提过的样品(防止脂肪对碳同位素丰度测定的影响),装入锡制的胶囊并压实(其间不留空气),送往质谱分析。胶囊在1000-10500C下进行灼烧，产物由氦气载带通过Cr2O3和活性Cu的柱净化，样品中的碳和氮元素可完全转化为N2和CO2，经脱水，用气相色谱柱（Porapak QS）分离后，由质谱仪（THERMO Delta plus，Finnigan MAT）进行质谱分析。,结果讨论 渤海湾生物营养层次的关系模型 营养级间15N的富集度 由主要一些有摄食关系生物的15N差值，如虾（10.550.54）、蟹（10.330.64）与浮游动物(6.140.51)，梭鱼(9.971.68)与浮游动物,可确定渤海湾水生生物营养级间15N的富集度为3.8. 食物网中15N会随营养层升高而富集,生物所处的营养层次由如下公式计算: 式中,2假定为浮游动物的营养层次,3.8为营养级间15N的富集度。海欧与水生物不同，属于恒温动物并且排泄的是尿酸而不是尿素，所以捕食鱼类引起的15N的富集度,与水生物的不同，Mizutani等人指出其富集度为2.4,因此,有: 所以,鸟的营养层次关系为: 通过氮稳定性同位素确定渤海湾生物营养层次见下表,食物网的层次为四级,鱼类的营养层次为3.01-3.88,这与传统胃容量法的结果3.0-4.1基本一致,说明同位素分析的方法是可靠的。,表 渤海湾采集生物物种的样品数n，15N，13C以及计算出的营养层次（MeanSD）,3）赵亮等.用稳定性同位素技术确定高寒草甸生态系统中动物营养级模型.动物学研究,2004,26(6):497-503 食性分析 表.几种雀形目鸟类在艾虎食谱中的比例(%) 注：模型(1)为欧氏距离模型；模型(2) 向量关系模型。,4).Peggy H.Ostrom(1997) Establishing pathways of energy flow for insect predators using stable isotope ratios: field and laboratory evidence.Oecologia109:108-113 a.食物切换实验 为了估计瓢虫体内C和N周转所需的时间，进行了食物切换实验。切换实验要求所供给的两种食物的同位素构成必需可以区分，本实验中，一种食物是来自单一品种高梁上饲养的蚜虫,其13C和15N分别为-12.0和3.4;另一种是猪肝混合物（由磨成糊状的猪肝加小量的甘油、橄榄油、蔗糖、面粉，花粉和硫酸链霉素构成），其13C和15N分别为-22.7和5.9。实验过程简述如下:用蛋培养基培养瓢虫 (H. variegata),幼虫期用蚜虫饲喂，脱蛹后前4d的成虫也饲喂蚜虫,在第5d,食物被切换到猪肝,混合物,并持续饲喂25d,在实验期间补充一定量的糖水用作C源。脱蛹后第5d及后续28d内隔天取样,每次取4只,00C保存,以用进行13C和15N的分析。实验结果表明，切换实验开始时，瓢虫体的13C为最高值(-12.20.1),15N为最低值(6.30.3) , 在食物切换后，其13C和15N向以猪肝混合物为食物的预期值-22.9和8.8改变(瓢虫对食物同位素富集的校正值为-0.2和2.9)，分在6d和21d达到各自预期值的75%。13C的渐近值较预期值高3，主要受糖水碳的影响，因不能定量，在计算时未包括在内。实验表明，瓢虫体内的13C和15N对食物的改变的反应很灵敏，能在几天的尺度内给予反映，因而为确定生态系统中物质和能量的转移提供了基础。,b.同位素营养级移动 蚜虫和紫花苜蓿，蚜虫由一单一品种的紫花苜蓿地采集，分析确定蚜虫与植物间的同位素移动，结果见表。 蚜虫与其食性植物间营养级间15N移动很小，这可能是由于蚜虫对食物同化比较彻底，因而同位素分馏效应较小。结果表明瓢虫与植物间13C和15N的漂移分别是-0.8和3.3。,Table1 The13C and 15N values and estimates of trophic level isotope effects for Hippodamia variegata, aphids raised on sorghum,and pork liver from a laboratory study and for aphids and alfalfa obtained from the field.,a H refers to an aliquot of a homogenous mixture of a large sample of aphids b The reproducibility of the measurement(0.1for both15N and13C)is good estimateof the error associated with a homogenate c Aphids-plants is the average of trophic level isotope effect for aphids-sroghum and aphids-alfalfa d H.variegata-plant is the sum of aphids-plants and H.variegata-sorghum,C.能量的传递途径 实验地背景 实验农田生态系统由相互毗邻的玉米地(33200m,当年春天播种),小麦地(33200m,前一年秋天播种), 黑麦地(33200m)和一块4年的苜蓿地(100200m), 后两者被一条土路(10200m)分开。同位素采样分析的数据见表。蚜虫由田间设置的粘性板（22.514.0cm）捕获,每地块6个,在整个实验季节,每周计数10次, 捕获蚜虫在00C保存,以备分析。,table.13C and15N of vegetation at the base of the food web and ladybird beetles,食物网计算 食物网中各食物能量对瓢虫的相对贡献的质量平衡方程组为： 式中，f为各食物网基的贡献百分数，脚标代表苜蓿、小麦、玉米和瓢虫（C.maculata）,X和Y为瓢虫与食物网间同位素营养级移动13C和15N。,5).Keith A.Hobson et al(1999) Stable isotopes(D and13C) are geographic indicators of natal origints of monarch butterflies in eastern 研究背景 每年估计有80-120万只国王蝶（Monarch butterflies），由北美的东部迁徙数千公里到达墨西哥中部Transvolcanic山区的Oyamel森林越冬，但近几年，在国王蝶的产地美国和加拿大，其寄主马利筋属植物（milkweed）常被作为毒草用农药进行杀灭，而在墨西哥越冬地Transvolcanic山区，因森林砍伐和稀疏化致使栖息环境正在恶化，严重危胁到国王蝶的生存，这种情况已引起高度重视。尽管对国王蝶的研究的已开展了40多年，但对其迁徙情况尚未明，尤其缺乏越冬国王蝶群体与北美起源地联系的情报，缺乏诸如一个越冬群体只是自北美特定的产地，还是美国和加拿大蝶的混合群体这样知识，这种状况有碍对国王蝶的保护工作的开展。,该研究在于确定同位素示踪技术是否可用于探明越冬地与出生地的相互联系关系的研究。为此，假定地理上不同地区降雨中的D是可区分的，事实上，其在北美随纬度由东南到西北呈现连续梯度贫化的模式，该区域中的植物和更高营养级的生物的D作为雨水中D的镜像因而具有指纹特性。蝶翅的keratin在成虫发育阶段合成后，在代谢上是惰性的，因此同位素构成信息可示踪其起源地。 研究目标包括：1）在实验室模拟条件下，通过改变浇灌水中的D进行处理，以确定国王蝶翅膀中D和13C的模式是否同水中D，及寄主植物中的D和13C的模式相同；2）确定跨北美东部不同区域国王蝶翅膀的D和13C的模式，考查同位素变、异的分辨率是否足以确定国王蝶的原产地；3）涉及在墨西哥中13个越冬栖息地点，对国王蝶翅的keratin中D和13C的测定，结果另行发表。,室内实验 宿主植物（milkweed）在盆内进行土壤培养，处理由浇灌普通水，10lD2Ol-1，和30lD2Ol-1（丰度99.9%）构成,以产生286%同位素梯度, 在宿主植株孵化国王蝶,每株至少得到6只国王蝶，国王蝶蛹化后立刻被冷冻待分析。浇灌水，宿主植物和国王蝶样品被用于同位素分析。结果见表和图。国王蝶翅膀中的D与水,以及水所浇灌的宿主植物中的D是高度相关的(r2=0.99)；国王蝶翅膀中的氢和碳的同位素构成与其宿主植物是相似的。,Table. Carbon and hydrogen isotope results （meanSD，）For laboratory rearing experiments using three water Treatments including average fractionation between water，milkweed，and monarch butterfly wing keratin.Sample sizes given in parentheses,6)F.Gould(2002)Bacillus thuringiensis-toxin resistance management:Stable isotope assessment of alternate host use by Helicoverpa zea.PNAS,99(26):16581-16586 作为对转Bt棉花和谷物商业化许可的条件之一，为了避免抗性的发展，美国环保署要求必需要有适当种类和种植数量的非转毒素基因作物，用作害虫的庇护植物，有时要求庇护达到500：1的比例，如对Hellicoverpa zea。H.zea 是杂食性的,因此另一些作物,如高梁、西红柿、大豆，杂草以及天然植被可以作为庇护植物。在许多棉花种植区，H.zea的其它类宿主植物主要是谷物。棉花是C3作物，而谷物是C4，二者的13C值的范围不同，由两类宿主植物上孵化出的H.zea蛾子翅膀中13C不同，可以