(标准)猪繁殖与呼吸综合征病国标

中华人民共和国国家标准GB/T18089-2000猪繁殖和呼吸综合症诊断方法Diagnostic methods of porcine reproductive and respiratory syndrome 2000-04-26发布2000-10-01实施国家质量技术监督局发布前言猪繁殖和呼吸综合症（简称PRRS）是由PRRS病毒引起一种接触传染性疾病。各种年龄的猪均易感染。妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。PRRS病毒欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以LV和VR-2332为代表株，型间具有明显的抗原交叉反应性。据现有资料，我国流行的毒株为美洲型。本病几乎发生于世界各养猪国家，并于九十年代中期传入我国。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局（1996）已将本病例为B类传染病。大连动植物检疫局在国内率先开展了PRRS的研究工作，建立了具有与国际同等水平的病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。其他单位也相继建立了多种酶联免疫吸附试验等。本标准是在综合我国科研成果的基础上，参照国际兽疫局（OIE）编写的哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册（第三版，1996）编写的。其技术内容与OIE所推荐的基本一致。本标准的附录A、附录B和附录C都是标准的附录。本标准由农业部提出。本标准起草单位：中华人民共和国大连动植物检疫局。本标准起草人：孙颖杰、苏永生、潘凤城、孙延峰、简中友。中华人民共和国国家标准GB/T18089-2000猪繁殖和呼吸综合症诊断方法Diagnostic methods of porcine reproductive and respiratory syndrome 1 范围本标准规定了猪繁殖和呼吸综合症（PRRS）的诊断方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。2 诊断方法和种类和选用PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）和血清中和试验（SN）等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。其余4种方法主要用于检测PRRS病毒抗体。IPMA、IFA和间接RLISA三者特异性相似，但以间接ELISA的敏感性最高。应用这三种方法一般不易区别病毒的抗原类型，故多适用于确定病性。SN反应具有明显的抗原型别差异，因此，它既适用于确定病性，也适用于鉴定病毒的抗原类型。中和抗体出现最晚，不适合于早期诊断。本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国进出境和国内生猪PRRS的诊断方法，保证了我国对PRRS的诊断与国外的一致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用12种方法即可。3 病毒的分离与鉴定3.1材料准备3.1.1器材：96孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳（CO2）恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2m的微孔滤膜、普通光学显微镜。3.1.2试剂：RPMI1640营养液、犊牛血清、青霉素（104IU/mL）与链毒素（104g /mL）溶液、7.5%碳酸氢钠溶液等。3.1.3细胞培养物：猪原代肺泡巨噬细胞培养物（PAM）或MARC-145或HS2H细胞。PAM由无PRRS猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法见附录B。MARC-145或HS2H细胞由国家指定单位提供。3.1.4样品3.1.4.1样品的采取和送检：在发病早期，无菌地采取病猪的血清或腹水。对病死猪（如流产的死胎）和扑杀猪（如弱胎猪），应立即采限取肺、扁桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应放2530冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4保存送检。3.1.4.2样品的处理：血清和腹水处可直接使用。肺、脾和扁桃体等组织可单独使用，也可混合使用。各组织剪碎后研磨成糊状，加入RPMI1640营养液，制成10%悬液，3000g离心15min，吸取上清液，加入青霉素500IU/ml、链霉素500g /ml、庆大霉素500g /mL和两性霉素B200g /mL。怀疑有细菌污染的样品，也可用0.2m微孔滤膜过滤处理。3.2操作方法3.2.1稀释样品：取96孔细胞培养板每孔加入细胞培养液RPMI1640（含犊牛血清10%、青霉素100IU/ml、链霉素100g/ml、两性霉素B10g/ml、PH=7.2）90 l，在A1和C1孔内加入同一份已处理的样品各10L（样品10稀释）。将板轻轻摇动后，从A1和C1排孔各取10L分别移入B1和D1排孔内（样品10稀释）。除第6和第12列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀释板后加盖，置4冰箱内保存备用。3.2.2制备细胞板：已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞泥用细胞培养液RPMI1640稀释，使细胞终浓度为1106细胞/ml，或将MARC-145或HS2H细胞营养液稀释，细胞终浓度5104细胞/ml。然后，在另一块96孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液100L。按照上述操作，每板可检测20份样品，每份样品重复2个滴度。第6和第12列留作正常细胞对照（不接种样品）。3.2.3接种样品：由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液50L，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内（第一代）。细胞板加盖后，放入375%二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变作用（CPE），连续观察2d5d。CPE通常在接种后1d4d内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。3.2.4培养物盲传：根据第一代培养物CPE出现的情况（通常在接种后的第2d3d）安排盲传。盲传时，不论CPE有无，一律各取孔内混悬液25L，移入新细胞板相应的孔内。再于375%二氧化碳保温恒箱中培养2d5d,每天观察CPE。3.3结果的判断和解释在第二代培养结束时，不论是否出现CPE，对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）或间接免疫荧光试验（IFA）进行终判；只要对PRRS病毒阳性血清呈现阳性反应，则被认定为PRRS病毒分离阳性。4免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）4.1材料准备4.1.1器材：微量移液器、倒置显微镜等。4.1.2试剂4.1.2.1 IPMA诊断板的制备：见附录B。4.1.2.2 标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用清稀释至工作浓度。4.1.2.3 洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液依照附录A自行配制。4.1.3样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内。4或-30冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。4.2操作方法略。4.2.1 取已作20倍稀释的被检血清加入IPMA诊断板同一排相邻的2个病毒感染细胞孔（V+）其后的1个未感染细胞孔（V-）内每孔50L，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以血清稀释液代替血清设立空白对照，封板并于4条件下过夜。4.2.2 弃去板中液体，用洗涤液洗板3次，每孔100L，每次1min3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。4.2.3 每孔加入工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物50L，封板后放在保温盒内于37恒温箱中感作60min。4.2.4 弃去板中液体，洗涤三次，方法同4.2.2。4.2.5 每孔加入显色/底物溶液50L，封板于室恒（18024）下感作30min。4.2.6 弃去板中液体，洗涤1次，方法同4.2.2，再用三馏水洗涤2次，最后在吸水低上轻轻拍干，待检。4.3 结果判定与解释将IPMA诊断板置于倒置显微镜判读。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔（PV+）和未感染细胞孔（PV-）均应为阴性反应；标准阳性血清对照感染细胞孔（PV+）应呈典型阳性反应，未感染细胞孔（PV-）应为阴性反应；标准阴性血清对照感染细胞孔（NV+）和感染细胞孔（NV-）均应呈阴性反应；被检血清未感染细胞孔（V-）不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞浆（可能仅见于部分细胞）出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA（+）；无棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA（-）。IPMA（+）者表明被检猪的血清中含有PRRS病毒的抗体。5 间接免疫荧光试验（IFA）5.1材料准备5.1.1器材：荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。5.1.2试剂5.1.2.1 IFA诊断板的制备：见附录B。5.1.2.2 兔抗猪异硫氰酸荧光黄（FITC）结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。5.1.3 样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4或-30冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS液作20倍稀释。5.2 操作方法5.2.1 取IFA诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加100L PBS液洗一次，弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干。5.2.2 在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞孔2个及其后感染细胞孔1个，每孔100L，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS液代替血清。置37恒温箱中感作45min。5.2.3 弃去板中血清，用PBS液洗板4次，每孔100L，每次3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。5.2.4 每孔加入工作浓度的兔抗猪FITC结合物50L，在37恒温箱中感作45min。5.3 荧光显微镜检查及判定与解释荧光显微镜采用蓝紫光（激发滤板通常用BG12，吸收滤板用OG1或GG9），在5倍10倍目镜下检查。标准阳性血清对照中感染细胞孔（PV+）应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔（PV-）不应出现特异性荧光，标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔（NV+）和未感染细胞孔（NV-）均不应出现特异性荧光；被检血清对照中未感染细胞孔（CV-）不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔（NV+）出现特异性胞浆亮绿色荧光判为阳性；否则，判为阴性。6 间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）6.1 材料准备6.1.1 器材：96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿等。6.1.2 试剂6.1.2.1 PRRS病毒抗原和正常细胞对照抗原，由国家指定单位提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。6.1.2.2 兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由国家指定单位提