【精品论文】RhoROCK 信号通路对牙髓细胞迁移和分.doc

精品论文rho/rock 信号通路对牙髓细胞迁移和分化的影响研究杨惠，程立，潘红颖，邵美瑛，程然，胡涛5（口腔疾病研究国家重点实验室，华西口腔医院牙体牙髓病科，四川大学，成都，中国） 摘要：目的：研究 rho/rock 信号通路对牙髓细胞迁移和分化的影响。方法：体外收集培 养人牙髓细胞，transwell 小室实验检测 rho/rock 激活和抑制时牙髓细胞的迁移情况，观 测迁移细胞前沿的伪足形态，western blot 检测细胞分化相关蛋白 dsp 和 dmp1 的表达。结10果：rho/rock 激活和抑制时均能促进牙髓细胞的迁移，迁移细胞前沿存在丝状伪足和片状 伪足，rock 激活后 dsp 表达先降低后升高，dmp1 在各组均无明显表达。结论：rho/rock可能参与调节细胞的迁移，其对分化的作用还有待进一步的研究。关键词：牙髓细胞；迁移；分化；rho/rock中图分类号：r781.315effect of rho/rock signaling pathway on dental pulp cell migration and differentiationyang hui, cheng li, pan hongying, shao meiying, cheng ran, hu tao(state key laboratory of oral diseases, department of conservative dentistry and endodontics,20west china hospital of stomatology, sichuan university，chengdu, china)abstract: objective：to investigate the potential effect of rho/rock signaling pathway on dentalpulp cell migration and differentiation. methods: human dental pulp cells were cultivated in vitro. transwell assay was used to detect the cell migration when rho/rock was activated or inactivated. the morphology of pseudopodium was observed in the leading edge of migrating25cells. the expression of pulp cell differentiation related proteins dsp and dmp1 were estimated by western blot. results: rho/rock activation and inhibition both promoted pulp cell migration. filopodia and lamellipodia could be seen in the leading edge. expression of dsp first decreased and then increased when rock activated, and dmp1 had no obvious expression. conclusion: rho/rock might involve in pulp cell migration and differentiation.30key words: dental pulp cells; migration; differentiation; rho/rock0引言细胞迁移和分化是组织损伤修复的关键环节，细胞迁移是一个受多种信号精密调控的复 杂过程，是多种生长因子和信号通路共同作用的结果。细胞迁移主要分为以下四个过程：细35胞先在前端伸出胞质突起，形成片状伪足或丝状伪足；通过细胞底部与细胞外基质建立新的 黏附，形成成熟的黏着斑来保持胞体的稳定；黏着斑通过调节肌动肌球蛋白的聚合和解聚来 调节细胞骨架，形成应力纤维产生收缩力使胞体向前运动；胞体尾部与基质分离回缩，启动 下一个循环1。细胞分化是同一来源的细胞逐渐形成各自特有的形态结构、生理功能和生化 特征的过程。细胞分化贯穿整个机体的发生发育，是机体实现形态、功能分化的过程2 。40细胞的迁移和分化是一个相互调节的过程，两者的紧密配合完成了机体的发生发育和组 织的损伤修复。rho/rock 信号通路由于可以调节细胞微丝骨架和收缩力被认为是细胞运动基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（编号 20090181110089）作者简介：杨惠（1983-），女，主治医师，主要研究方向：牙髓生物学通信联系人：胡涛（1967-），男，教授，主要研究方向：牙髓生物学、龋病微生物学. e-mail: - 7 -的关键调节信号。研究表明 rho/rock 信号在内皮细胞的迁移过程中，参与调节肌动蛋白骨架3，rock 失活后能抑制血小板源性生长因子和溶血磷脂诱导的血管平滑肌细胞迁移4,5，进一步说明 rock 激活在细胞迁移中的正向作用，但是 rock 抑制后，在培养的心内45膜垫细胞中发现上皮细胞向间质细胞的转化及细胞的迁移均受到抑制，表明 rock 在心内 膜细胞的分化和迁移过程中具有促进作用6。也有研究发现 rock 活性下调后主动脉平滑肌 细胞运动活性增强7。这说明在不同的细胞内，rock 参与介导不同的功能。课题组前期研究发现 rho/rock 参与调节牙髓细胞的迁移，其是否同时参与调节牙髓 细胞的分化目前还不清楚，因此本实验将探讨 rho/rock 对牙髓细胞迁移和分化的影响。501材料方法1.1牙髓细胞原代培养和鉴定牙髓取自四川大学华西口腔医院外科门诊 15-25 岁患者因阻生或正畸需要拔除的健康 牙齿，且拔出后冠根完整者。经患者知情同意后用 75乙醇涂拭牙体表面，置于生理盐水 中不超过半小时，送实验室取牙髓进行原代培养。牙髓细胞利用上皮来源标记分子角蛋白55（keratin）和间充质来源标记分子波形蛋白（vimentin）进行鉴定。1.2牙髓细胞的迁移transwell 小室实验比较细胞在 tgf1、y27632 分别作用下或两者共同作用下细胞的迁 移情况，采用 dapi 染色计数迁移细胞。牙髓细胞长满瓶底的 80%时，撤血清饥饿 12 小时； y27632 组加入含 10um 的 y27632 培养基预处理 40min。预先将 transwell 小室在 24 孔板中60用无血清高糖 -mem 浸润，置于 37、5% co2 培养箱中平衡 2 小时；胰酶消化细胞，174g(1000r/min)离心 8min；弃上清，pbs 洗两次；无血清培养基重悬细胞，配成细胞悬液， 显微镜下计数；调节各组细胞密度达到一致，下室加入各种刺激因素并加入 0.2%的 bsa 维 持渗透压，放入 37、5co2 的培养箱中孵育 20h；取出 transwell 小室，棉签反复擦去上 室表面细胞，pbs 洗 2 遍，4%多聚甲醛固定 15min；pbs 洗 3 次，dapi 染色三分钟，pbs65洗 3 次，荧光显微镜下观察、计数。1.3牙髓细胞伪足形态观察牙髓细胞经胰酶消化，调节细胞浓度为 5104 个细胞，接种于六孔板中。16 小时后， 显微镜下观察细胞已经贴壁生长，用 1ml 枪尖比着直尺，垂直地在每个孔中画一条经过中心 的直线。用 pbs 洗细胞 3 次，去掉划下的细胞，加入含不同刺激因子的无血清培养基。放70入 37 度 5%co2 培养箱，培养 6 小时后取样拍照。1.4牙髓细胞分化相关蛋白 dsp 和 dmp1 的表达牙髓细胞生长密度达到 80%后，无血清饥饿 24h，加入不同的刺激因素，收集蛋白样品。 配制聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离蛋白。然后将蛋白转移到 pvdf 膜上，通过抗原抗体反应检 测目的蛋白。本实验采用鼠抗人 dsp 蛋白和鼠抗人 dmp1 蛋白检测与牙髓细胞分化密切相75关的这两种蛋白的表达情况。2结果2.1牙髓细胞原代培养和鉴定80原代培养的牙髓细胞三天后可见贴壁的组织块周围有细胞爬出，细胞呈长梭形放射状生 长。组织块周围细胞克隆性增殖迅速，五日后已有大量细胞围绕，并向组织块远方伸展（如 图 1a）。细胞在第 10 天时，相邻组织块的细胞出现汇合，铺满瓶底的 80%。传代培养至 5-6 代，细胞形态一致，呈克隆性增生的成纤维细胞形态（如图 1b），可用于后续试验。85图 1 牙髓细胞原代培养形态图。a：组织块周围见牙髓细胞爬出；b：显微镜下的牙髓细胞形态图。fig. 1 the morphology of cultured dental pulp cells. a: dental pulp cells stretched from the pulp tissue; b: the morphology of cultured dental pulp cells by microscopy.牙髓细胞来源于外胚间充质细胞，角蛋白主要表达于上皮细胞和表皮细胞，波形蛋白主 要表达于间充质来源的成纤维细胞和血管平滑肌细胞及中胚层来源的细胞。免疫组织化学结90果显示牙髓细胞角蛋白表达阴性（如图 2a），波形蛋白表达阳性（如图 2b），印证了牙髓 细胞的来源。图 2 牙髓细胞角蛋白和波形蛋白染色。a：牙髓细胞角蛋白染色；b：牙髓细胞波形蛋白染色。fig. 2 ck and vimentin staining of dental pulp cells. a: ck stainig of dental pulp cells; b: vimentin staining of95dental pulp cells1002.2牙髓细胞伪足形态我们利用该实验模拟细胞损伤修复过程中的细胞移动，研究细胞迁移前沿的伪足形态。 图中可以看出对照组细（如图 3a）胞体细长，伴有丝状伪足（黄色箭头所示）和片状伪足（红色箭头所示）；而加入 tgf1 后（如图 3b），光镜下胞体形态虽然没有明显改变，但 是胞体轮廓更加清晰，细胞主要以丝状伪足为主（黄色箭头所示）；加入 y27632 后（如图3c），细胞的胞体皱缩发亮，呈星型，胞体前端形成宽而大的片状伪足（红色箭头），尾部可见丝状的胞质突起；同时加入 tgf1 和 y27632 后（如图 3d），细胞的形态改变与加入 y27632 时相似，细胞尾部也可见丝状胞质突起，但是没有加入 y27632 改变明显，细胞同 时伸出丝状伪足（黄色将头）和片状伪足（红色箭头）。105110115120125图 3 牙髓细胞迁移前沿伪足形态。a：对照组迁移细胞前端形态；b：tgf1 刺激组细胞前端形态；c：y27632刺激组细胞前端形态；d：tgf1 和 y27632 共同刺激组细胞形态。fig. 3 the morphology of pseudopodium in dental pulp cells. a: the morphology of the cell leading edge in control group; b: the morphology of the cell leading edge in tgf1 stimulated group; c: the morphology of the cell leading edge in y27632 stimulated group; d: the morphology of the cell leading edge in tgf1 and y27632 stimulated group.2.3牙髓细胞迁移transwell 小室实验结果表明牙髓细胞在加入 tgf1（如图 4a）后，细胞迁移比对照组（如图 4d）明显增加，加入 y27632 后（如图 4b）细胞的迁移也增加。本课题组前期研究8 发现牙髓细胞在加入 lpa 刺激后，能够激活 rho/rock 信号通路使细胞迁移增加，而加入 y27632 后细胞可能通过作用于 mdia 激活 rac，使迁移细胞数甚至高于 lpa 组。在本实验 中，加入 tgf1 后，细胞的迁移明显增加，可能是激活了 rhoa（见本部分的 rho pull down 实验，tgf1 能够上调 gtp-rhoa）。而加入 y27632 后细胞的迁移也增加，分析原因可能 是当 rock 抑制后，启动了细胞的 mdia 信号通路，有研究表明29细胞在 y27632 作用下能 够激活 mdia-rac 信号通路，在本课题组研究中发现当 y27632 作用于牙髓细胞后，细胞的 mdia 表达上调。当同时加入 y27632 和 tgf1 后（如图 4c），细胞的迁移明显增加，其原 因可能是加入 tgf1 激活 rho/rock 信号通路，加入 y27632 激活 mdia-rac 信号通路，两 种效应叠加，使细胞迁移显著增加。2.4牙髓细胞分化蛋白表达dsp 和 dmp1 在牙髓细胞分化和基质矿化中发挥重要的作用，可作为牙髓细胞分化的标志之一。western blot 结果（如图 5a）显示牙髓细胞 dsp 在加入 tgf1 后表达下降，但是在 1h 和 2h 后表达显著升高，与条带密度统计结果一致（如图 5b）。但是 dmp1 在各组 均无明显表达。130135图 4 不同刺激后牙髓细胞的迁移情况。a：tgf1 刺激后牙髓细胞的迁移情况；b：y27632 刺激后牙髓细 胞的迁移情况；c：tgf1 和 y27632 共同作用后牙髓细胞的迁移情况；d：对照组细胞迁移情况。fig. 4 migration of dental pulp cells in different stimulated groups. a: cell migration in tgf1 stimulated group; b: cell migration in y27632 stimulated group; c: cell migration in tgf1 and y27632 stimulated group; d: cell migration in control group.图 5 牙髓细胞 dsp 蛋白表达。a：western blot 检测 dsp 蛋白表达；b：dsp 蛋白表达柱状图。fig. 5 expression of dsp protein in dental pulp cells. a: the expression of dsp protein by western blot; b: bar graph of the expression of dsp protein.1401453讨论研究发现抑制 rock 后细胞的收缩力、微丝骨架的装配和黏着斑均降低，导致细胞运 动性减弱9-11。本实验发现用 y27632 抑制牙髓细胞的 rock 后，牙髓细胞的迁移反而增加， 这与其他一些研究的结果相似，激活 rock 和抑制 rock 后效应的差别可能是细胞种类和 检测方法的不同12，其潜在机制还有待进一步研究。我们随后的研究发现 rock 抑制后细 胞前端形成宽大的片状伪足。在我们的实验中 y27632 抑制 rock 后细胞的迁移增强。我们 推测 y27632 作用后细胞运动性增强可能与 rac 激活有关。研究13发现在 3t3 细胞中，y27632 作用后 gtp-rac 水平升高。mdia1 能激活 rac，形成胞膜皱褶，促进细胞迁移。片状伪足的150155160165170175180185190延伸和胞膜皱褶的形成通常受到 rac 的调节，rac 通过刺激肌动蛋白的聚合和调节膜皱褶的形成产生向前推进的力量，在 y27632 阻断 rho/rock 后，可见细胞出现大量的片状伪足。 前期研究还发现13 gtp-rac 在 y27632 作用的细胞中表达增强，提示 rac 可能在 rock 抑 制后发挥作用。对照组细胞主要形成丝状伪足，出现少量片状伪足，而 rock 抑制出现很 多片状伪足，也进一步提示了 rock 抑制后的效应可能是 rac 介导的信号作用结果。salhia 等12也发现星形细胞瘤细胞在 rock 抑制后细胞运动性的增强与 rac1 的激活有关，rac1 sirna 能显著减弱该细胞的运动性。在细胞迁移过程中，rho 还能介导 mdia1 促进肌动蛋 白聚合和微管的稳定14-16。当 y27632 抑制 rock 后，tgf1 也可能通过直接激活 mdia1 信号通路来促进细胞迁移。牙髓组织损伤修复是牙髓牙本质复合体再生的关键，迁移和分化是其修复的前提。在本 实验中，为了观察在早期牙髓细胞的分化情况，我们检测了与牙髓分化密切相关的 dsp 蛋 白和 dmp1 蛋白。结果发现 dsp 蛋白表达先降低后升高，虽然差异间有统计学差异，但是 这种变化的幅度不大，蛋白表达没有出现明显的波动。而另外一种蛋白 dmp1 在我们的实 验组和对照组中没有检测到有明显的表达。将这些结果与迁移的结果对比研究我们发现，在 tgf1 刺激后，通过激活 rho/rock 信号通路，使细胞骨架出现重组，细胞迁移增加；在 加入 rock 抑制剂后，可能通过激活 rac1，使细胞形成大量的片状伪足，细胞迁移也显著 增加；但是细胞的分化指标却没有出现明显的变化，说明牙髓细胞在早期迁移的时候，其分 化可能没有明显的变化。rho/rock 信号通路参与牙髓细胞的迁移，但是其是否参与牙髓细 胞的分化还有待进一步的研究。4结论本文通过体外培养牙髓细胞，研究在 tgf1 和 y27632 作用下牙髓细胞的迁移和分化 情况以及 rho/rock 对牙髓细胞的迁移和分化的调控作用。结果发现 rock 抑制剂 y27632 作用后，牙髓细胞形成宽大的片状伪足，其迁移也显著增强，但是 dsp 蛋白的表达没有明 显变化。加入 tgf1 后，牙髓细胞的迁移也增强，细胞前端形成大量的丝状伪足，dsp 蛋 白表达先降低后升高。dmp1 在各组均无明显表达。本研究结果提示 rho/rock 可能参与 调节细胞的迁移，其对分化的作用还有待进一步的研究。参考文献 (references)1 ridley aj. rho gtpases and cell migrationj. j cell sci. 2001, 114(pt 15):2713-222 ben-tabou de-leon s, davidson eh. gene regulation: gene control network in developmentj. annu revbiophys biomol struct. 2007, 36:191.3 essler m, retzer m, bauer m, et al. mildly oxidized low density lipoprotein induces contraction of human endothelial cells through activation of rho/rho kinase and inhibition of myosin light chain phosphatasej. j biolchem. 1999, 274(43):30361-4.4 sawada n, itoh h, ueyama k, et al. inhibition of rho-associated kinase results in suppression of neointimal formation of balloon-injured arteriesj. circulation. 2000, 101(17):2030-3.5 ai s, kuzuya m, koike t, et al. rho-rho kinase is involved in smooth muscle cell migration through myosinlight chain phosphorylation-dependent and independent pathwaysj. atherosclerosis. 2001, 155(2):321-7.6 zhao z, rivkees sa. rho-associated kinases play a role in endocardial cell differentiation and migrationj. dev biol. 2004, 275(1):183-91.7 chang y, ceacareanu b, dixit m, et al. nitric oxide-induced motility in aortic smooth muscle cells: role of protein tyrosine phosphatase shp-2 and gtp-binding protein rhoj. circ res. 2002, 91(5):390-7.8 cheng r, cheng l, shao my, et al. roles of lysophosphatidic acid and the rho-associated kinase pathway inthe migration of dental pulp cellsj. exp cell res. 2010, 316(6):1019-27.9 sumi t, matsumoto k, nakamura t. specific activation of lim kinase 2 via phosphorylation of threonine 505 by rock, a rho-dependent protein kinasej. j bi