信号肽在基因工程中的应用.ppt

信号肽在基因工程中的应用,什么是信号肽？,指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列 一般有16-26个氨基酸残基，其中包括疏水核心区信号肽的 C 端和 N 端3部分 信号肽似乎没有严格的专一性。,信号肽的功能,指导分泌型蛋白在糙面内质网上合成的决定因素是蛋白质N端的信号肽。 信号识别颗粒和内质网膜上的信号识别颗粒的受体等因子协助完成这一过程。,信号肽假说,信号肽假说认为，编码分泌蛋白的mRNA在翻译时首先合成的是N 末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合。信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随即被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。翻译结束后，核糖体亚基解聚、孔道消失，内质网膜又恢复原先的脂双层结构。,蛋白质的运转离不开信号肽,跨膜运输和镶入膜内的几种主要蛋白质,新生蛋白质通过同步转运途径进入内质网内腔的主要过程,信号肽可使正在翻译的核糖体附着到RER膜上。在信号肽指引下蛋白质在细胞内的输运 核糖体是通过信号肽的功能而附着并合成分泌蛋白的。因此游离的核糖体和膜结合核糖体之间本身并无差异。,9,信号肽是作为一种附着到ER膜上的信号识别，此可能通过开始合成出的N-端头几个氨基酸的疏水功能。然后蛋白链插进膜中，信号肽埋在膜中的一种蛋白酶所剪切这时核糖体已完成翻译，蛋白已延着导肽途经穿过膜。盐冲洗过的膜不能启动核糖体的结合，它的能力又可以恢复。,11,信号肽序列,蛋白质跨膜运转信号也是由mRNA编码的。在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，这个氨基酸序列就被称为信号序列。信号序列在结合核糖体上合成后便与膜上特定受体相互作用，产生通道，允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构，因此，这种方式是边翻译边跨膜运转。,信号肽在基因工程技术与应用,13,融合gp67 信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基因在蚕体内表达,1.重组转移载体 pBacPAK-gpAPI2 的构建,pBacPAK-gpAPI2 的 ph. p、gp67 信号肽序列和 A PI2 基因的连接处序列为:,2.,重组病毒的筛选及表达产物分子量测定,3.血淋巴中表达产物含量的测定 表达产物经 SDS-PAGE电泳 ,脱色后用凝胶干燥仪干燥 ,用Bio-Rad GS-670 图像分析仪进行扫描处理。测得 CrBK-API4 感染的血淋巴上清液中表达的 API占可溶性蛋白含量的 9 %,CrBK-gpAPI2 感染的血淋巴上清液中表达的 API占可溶性蛋白含量的 7 %。血淋巴中可溶性蛋白总量测定表明:CrBK-API4 感染的血淋巴上清液中为 40mg/ mL ,CrBK-gpAPI2 感染的血淋巴上清液中为 55mg/ mL。从而得到血淋巴中表达的慈菇蛋白酶抑制剂的绝对含量:CrBK-API4 感染的血淋巴中为 3.6mg/ mL ,CrBK-gpAPI2 感染的血淋巴中为3.8mg/ mL。两者的绝对表达量差别不大。,4 . 表达的慈菇蛋白酶抑制剂的活性测定,参考文献,生 物 技 术 通 讯 堵国成。陈坚，等大肠杆菌高效表达重组蛋白策略中 国生物工程杂志，2007，27(9)：103 龙建银，王会信生物化学与生物物理进展，（）： 杨运桂，徐京宁，等生物化学与生物物理学,专有名词,RER：粗面内质网 信号识别颗粒signal recognition particle （SRP） ER；内质网 ribosome receptor 核糖体受体 SPR receptor 信号识别颗粒受体 signal peptidase 信号肽酶 Association