培养基基本成分与制作简.ppt

1,培养基基本成分与制作,2,一、引言,培养基（culture medium）是组培苗生存、发育以至形成完整植物的白色土壤，它含有试管植物发育过程中所必须的营养元素，是植物细胞组织培养中最主要的部分。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部分的组织对营养的需求也不相同，应根据培养材料的种类和培养部位选取适宜的培养基，以取得较好的实验效果。,3,二、培养基的主要成分,一般培养基都由以下几个部分组成：水；无机营养元素，如氮、磷、钾、钙、镁、硫等大量元素和硼、锰、铁、锌、钼、铜、钴等微量元素；有机成分包括碳源和含氮物质；植物生长激素；琼脂。在此基本培养基的基础上，通过添加不同种类和用量的植物激素就可以构成了分化、增殖、生根等一系列专门培养基。,4,1. 水,培养基中大部分成分是水，可提供植物所需的氢、氧，配制培养基时一般用离子交换水、蒸馏水、重蒸馏水。,5,2. 无机成分,无机成分是指植物在生长发育时所需要的各种化学元素。根据植物对无机营养的吸收量，可以把它们分为大量元素和微量元素，前者在植物的生长发育中占得比重较大，后者虽然植物吸收量较少，但却具有重要的生理作用。,6,2.1 无机大量元素( macroelement),指在培养基中含量超过100mg/L的无机元素，包括N、P、K、Ca、Mg、S等。,氮（N）,氮是细胞中核酸的组成部分，也是生物体许多酶的成分，氮被植物吸收后转化为氨基酸再转化为蛋白质，然后被植物利用。氮还是叶绿素、维生素和植物激素的组成成分。氮主要以铵态氮、硝态氮两种形式混合使用，利于细胞的生长、发育。,7,磷（P）,磷参与植物生命活动中核酸及蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量的贮存、转化与释放等重要的生理生化过程，增强植物的抗逆能力，促进早熟，组织培养过程中培养物需要大量的磷。磷常常是以磷酸盐的形式供给。,8,钾（K）,钾是许多酶的活化剂。组织培养中钾能促进器官和不定胚分化，促进叶绿体ATP的合成，促进植物的光合作用和产物的运输，能调节植物细胞水势，调控气孔运动，提高植物的抗逆能力。钾常常是以钾盐的形式供给。,9,钙、镁、硫（Ca、Mg、S）,参与细胞壁的构成，影响光合作用，促进代谢等生理活动，浓度通常在13mmol/L范围内较合适，常常以MgSO4和钙盐的形式供给。,10,2.2 无机微量元素( microelement),指在培养基中含量低于100mg/L的元素，主要有铁(Fe)、硼(B)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)、钴(Co)、氯(Cl)。微量元素对植物生长需要量很少，能够促进叶绿素的合成，促进生殖器官正常发育，参与光合、呼吸代谢过程。铁元素通常以硫酸亚铁与Na2-EDTA螯合物的形式存在培养基中，避免Fe2+氧化。,11,3. 有机成分,有机成分（organic compound）是指植物生长发育时所必须的有机碳、氢、氮等物质。主要有糖、维生素、肌醇、氨基酸等。,12,3.1 糖( sugar),糖既可作为碳源，为培养的外植体提供生长发育所需的碳骨架和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用。 一般添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中蔗糖最常用，浓度一般为2%5%。,13,一般来说，以蔗糖作碳源时，离体的双子叶植物的根生长得最好；而以右旋糖（葡萄糖）作碳源时，单子叶植物的根生长得最好。已知植物能够利用的某些其它形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖。,14,3.2 维生素( vitamin),维生素类化合物在植物细胞里主要以各种辅酶的形式参与各项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。常用的维生素有盐酸硫胺素（维生素B1）、盐酸吡哚醇（维生素B6）、烟酸（维生素B3）、生物素（维生素H）、叶酸、抗坏血酸（维生素C）等。维生素具有热易变性，易在高温下降解，可进行过滤灭菌。,15,3.3 肌醇( inositol),肌醇（环己六醇）能帮助活性物质发挥作用，使培养组织快速生长，促进胚状体及芽的形成。培养基中肌醇用量一般为50100mg/L。,16,3.4 氨基酸及有机添加剂 ( amino acid and organic addition),氨基酸可以调节培养物体内平衡，促进外植体芽、根、胚状体的生长、分化。植物组织培养中常用的氨基酸有丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸、天冬酰胺，以及多种氨基酸的混合物，例如水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）等。,17,在组织培养中还常常加入一些天然的有机物例如椰乳（CM）100200ml/L，酵母提取物0.5%,番茄汁510%，香蕉泥150200mg/L等，其有效成分为氨基酸、酶、植物激素等物质，这些天然有机物对植物组织培养并非是必需的，但可起到一定的促进作用。,18,4. 植物生长调节物质 （plant growth regulator）,植物生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要和明显的调节作用。,19,4.1 生长素 ( auxin),在组织培养中，生长素被用于诱导细胞的和根的分化。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）等。其中IBA和NAA广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长，并促进茎的增殖。 2，4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。,20,4.2 细胞分裂素 ( cytokinin),在组织培养中，细胞分裂素可以促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽，也可用于茎的增殖。常用的细胞分裂素有 激动素(KT)、6-苄基腺嘌呤(BAP)、玉米素(ZT)、噻重氮苯基脲(TDZ)等。,21,4.3 其他激素,赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)和多效唑(PP333)等生长调节物质也常常用于组织培养之中。其中低浓度赤霉素能促进矮小植株茎节伸长，还能刺激在培养基中形成的不定胚正常发育成小植株。脱落酸因植物物种不同可能会促进或者抑制愈伤组织的生长。,22,5. 琼脂（agar),液体培养基中加入琼脂可使培养基凝胶化，制成固体培养基。它有操作简便，对培养物形成支持、通气较易解决、便于观察研究等优点。琼脂本身并不提供任何营养，是从海藻得来的一种多糖物质，仅溶于热水，使用浓度一般为0.61%，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，而丧失凝固能力 。,23,6. pH值,培养的植物材料大多数要求弱酸性环境，在培养基灭菌前一般都将pH调整到5.56.0之间。 当pH高于6.0时，培养基会变硬；低于5.0时，琼脂凝固效果不好。pH 的测试常用精密pH试纸，调整通常采用1mol/L盐酸或1mol/L NaOH。,24,三、培养基的配制,1 准备工作,配制培养基所用的主要器具包括：不同型号的烧杯、容量瓶、移液管、滴管、玻棒、三角瓶、试管以及培养基分装器等。配制培养基前，要洗净备齐所用器具。 配制培养基一般用蒸馏水或无离子水。化学药剂应采用化学纯CP（三级）及分析纯AR（二级），药品的称量及定容要准确。,25,2 贮备液的配制和保存,在组织培养中，培养基的配制是经常性的工作。为了简化程序，常先配制一系列的浓缩贮备液。即将配方中可供一段时间使用的药品一次称量，配成浓溶液，用时稀释。这种浓溶液就是贮备液或母液。按药品的种类和性质分别配置，单独或几种混合保存。一般大量元素配成使用浓度10100倍的浓溶液，微量元素配成2001000倍的浓溶液。,26,在配制大量元素无机盐母液时，应把Ca2+、Mn2+、Ba2+和SO42-、PO43-错开，以免相互作用结合生成沉淀。铁盐需单独配制，往往采用硫酸亚铁与Na2-EDTA通过加热形成稳定的螯合铁，避免Fe2+、Fe3+与其它母液混合产生沉淀。,27,在配制植物生长调节物质母液时，生长素类物质（如IAA、NAA、2，4-D）等）需要先用少量95%酒精或1mol/L NaOH加热助溶后，再加水定容。细胞分裂素类物质（如KT、BAP等）需要先溶于少量1mol/L盐酸中，再加水定容。叶酸须用少量稀氨水溶解。,28,配制好的母液应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期。配好的母液最好在24冰中贮存，贮存时间不宜过长，当母液中出现沉淀或霉菌时，则不能使用。,29,3 培养基的配制,称出规定数量的琼脂和蔗糖，加水直到培养基最终体积的3/4，在恒温水浴中加热使之溶解。在制备液体培养基时则无须加热。 分别加入一定量的各种贮备液，包括生长调节物质和其他的特殊补加物。 加蒸馏水直至最终体积。,30,充分混合后，用1或a调整培养基的p值到所需值。p值测定通常采用精密pH试纸（pH5.47.0）或酸度计。 将培养基分装到所选用的培养基容器中，每个25毫米1