实验十七姊妹染色单体色差方法.ppt

实验十七 姊妹染色单体色差方法,一、实验目的,1.子解姐妹染色单体差别染色技术的原理和制作SCE标本的方法。 2.通过SCE标本的观察，掌握SCE计数方法。,二、实验原理,在DNA复制过程中，核苷的类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy uridine简称BrdUrd）或5-碘尿嘧啶核苷（5-Iodo-2-deoxy uridine简称IdUrd）可以代替核苷酸掺入新合成的DNA链，并占有胸腺嘧啶（Thymidine,T）的位置。哺乳类细胞在含有适当浓度的Brdurd的培养液中经历二个分裂周期之后，其中期染色体的两个单体的DNA双链在化学组成上就有了差别：即一条染色单体的两股DNA中的T位完全由BrdUrd代替，而另一条染色单体的两股DNA中的一股含BrdUrd,另一股则不含BrdUrd，这样的细胞经过制片和苯并咪唑荧光染料（Hoechst-33258）染色后，在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体显示强弱不同的荧光。两股DNA链都含有BrdUrd的单体荧光较强，其中只有一股有BrdUrd的单体荧光较弱。 1974年Korenberg和Freedlender改进了这一方法，单独用Giemsa染色即获得姐妹染色单体差别染色（sister-chromatid differential staining简称SCD）（图24-1）。这是因为双股都含有BrdU核苷酸的DNA链组成的染色单体，螺旋化程度较低，在热盐溶液中受光的照射后更易于水解，从而影响了与Giemsa染料的亲和力，因此染成较浅的颜色。这样根据两条姐妹染色单体所显示的深浅不同的颜色，可以区别中期染色体的姐妹染色单体。,三、实验材料,人的外周血。,四、实验器具和药品,1.用具：2mL和1mL灭菌注射器，吸管，移液管，离心管，量筒，烧杯，无菌青霉素瓶，试剂瓶，培养瓶，酒精灯，载玻片，天平，紫外灯（15W），离心机，恒温培养箱，显微镜。 2.药品配制：RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA），秋水仙素，青、链霉素，吉姆萨染液等。,五、实验步骤,1.配制培养液,在无菌条件下，用20mL的青霉素瓶分装5mL培养液，其中RPMI1640占80%，小牛血清占1520%；PHA0.2mL；青霉素100单位/mL；链霉素100微克/毫升。最后用3.5%NaHCO3调节pH至7.27.4。,2.加入BrdUrd,每5mL的培养液中加入BrdUrd 0.1mL，最终浓度为10ug/mL。,3.加入0.3mL静脉血培养,每瓶培养液中加入0.3mL静脉血，轻轻摇匀，用黑布避光，立即置37温箱中培养。,4.加入秋水仙素继续培养,培养72h左右，加入秋水仙素0.4-0.8ug/mL，继续培养4h。,5.按常规收集细胞制片,用0.075mol/L KCl或蒸馏水低渗20min，用甲醇冰醋酸31配制的固定液固定两次，每次15min，用气干法制片，一天以后将染色体制片放入7080烤箱中烘烤12h，或放在37温箱中存放备用。,6.染色体标本的差别染色方法处理,(1)碱的热溶液处理 :将染色体标本浸在88的1mol/L NaH2PO4(pH为8.0)的溶液中，处理20min，取出后立即用蒸馏水冲洗，用常规Giemsa染色5min，再用蒸馏水冲洗，干燥，观察。 (2)紫外灯照射诱发：染色体标本在37条件下搁置24小时后取出，放在4548的水浴锅上，覆盖一层2SCC溶液（0.3mol/L NaCl,0.03mol/L枸橼酸钠），15W紫外灯照射20-30min，灯管与载玻片之间距离为6厘米（照光期间防止2SCC溶液干涸）。照射完毕，用蒸馏水冲去2SCC，用3%Giemsa(pH6.8磷酸缓冲液稀释)染色510min，水洗，气干后镜检。,7. 镜检,在普通光学显微镜下观察，可见姐妹染色单体呈现鲜明的深浅不同的颜色。,人体淋巴细胞姐妹染色单体互换,图片,六、注意事项,1.培养基组成、培养液的酸碱度、培养温度或培养时间等因素略加变动，可适用于其他一些哺乳动物、鸟类或两栖类动物淋巴细胞的培养，用以观察它们的姐妹染色单体色差。 2.BrdUrd溶液最好现配现用，一次使用不完，必须有黑布避光，4冰箱保存。 3.BrdUrd在培养开始时加入，或在培养后的24小时加入均可。 4