药典版二部色谱法讲义.ppt

主要内容,色谱法的基本概念 色谱法在中国药典中的沿革 中国药典2010年版色谱法内容概况 展望,何为色谱法,色谱法是利用混合物中各组分的理化性质的差异(吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等)，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相，另一相流过此固定相叫作流动相。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，使得结构上只有微小差异的各组分得到分离。再配合相应的光学、电学、电化学和或其他相关检测手段，对各组分进行定性和定量分析的方法。,色谱法的基本概念,色谱法的基本概念,分离原理 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 排阻色谱法,分离方法 纸色谱法 薄层色谱法 柱色谱法 高效液相色谱法 气相色谱法,色谱法的基本概念,特点 分辨效力 分析效率 灵敏度 操作及应用,局限性 标准物质 化学结构,色谱法在中国药典中的沿革,V A 纸色谱法(1985) V B 薄层色谱法(1985) V C 柱色谱法(1985) V D 高效液相色谱法(1985) V E 气相色谱法(1985) V F 电泳法(1990) V G 毛细管电泳法(2000) V H 分子排阻色谱法(2000) V J 离子色谱法(2010),高效液相色谱法在中国药典二部的应用,中国药典2010年版色谱法内容概况,V A 纸色谱法 V B 薄层色谱法 V C 柱色谱法 V D 高效液相色谱法 V E 气相色谱法 V F 电泳法(1990) V G 毛细管电泳法(2000) V H 分子排阻色谱法(2000) V J 离子色谱法(2010),V A 纸色谱法,系以纸为载体，纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。,鉴别 纯度检查 含量测定,V B 薄层色谱法,系将供试品溶液点样于薄层板上，经展开、检视后所得的色谱图，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用于药品的鉴别或杂质检查的方法。,V B 薄层色谱法,仪器与材料 薄层板(增 “高效薄层板的粒径一般为57m”) 点样器 展开容器 显色剂(“碘蒸气中显色”修改为“适宜试剂的蒸气中熏蒸显色”) 显色装置 检视装置,V B 薄层色谱法,操作方法 薄层板制备 ( 110活化30分钟) 点样 (点样基线距底边2.0cm，点样直径为24mm(高效薄层板为12mm) ，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜，一般为1.02.0cm (高效薄层板可不小于5mm) ) 展开(“待展开至规定距离(一般为1015cm)”调整为“待展开至适宜的展距(如：20cm的薄层板，展距一般为1015cm；10cm的高效薄层板，展距一般为5cm左右)” 显色与检视,V B 薄层色谱法,系统适用性试验 检测灵敏度 ( 系指杂质检查时，供试品溶液中被测物能被检出的最低量。) 比移值(Rf) (除另有规定外，比移值(Rf)应在0.20.8之间。 ) 分离效能 (鉴别时，在对照品与结构相似药物的对照品制成的混合溶液；杂质检查时，杂质对照品用供试品自身稀释对照溶液溶解、用待测组分的对照品溶液溶解、供试品以适当的降解方法获得的溶液。 应显示两个清晰分离的斑点)”,V B 薄层色谱法,测定法 鉴别 (同浓度对照品溶液、供试品溶液与对照品溶液等体积混合) 杂质检查 (杂质对照品法、供试品溶液的自身稀释对照法、或两者并用 。通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量，当采用系列自身稀释对照溶液时，也可规定估计的杂质总量),烟酰胺 P856,V B 薄层色谱法,1 2 3 4 1、烟酰胺溶液 2、烟酸溶液 3、碱破坏溶液 4、混合溶液,V C 柱色谱法,吸附柱色谱 分配柱色谱,V D 高效液相色谱法,系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。,V D 高效液相色谱法,(1) 色谱柱 反相 (非极性:C18、C8、CN、NH2)(组分的出峰顺序：极性大的先出峰，极性小的后出峰。 ) 正相 (极性：硅胶)主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物(极性：固定相流动相) 离子交换 分子排阻 对映异构体,V D 高效液相色谱法,(1) 色谱柱 除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在310m之间，粒径更小(约2m)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。 使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。,V D 高效液相色谱法,(2) 检测器 选择性 紫外、荧光、电化学 通用型 蒸发光散射、示差折光,V D 高效液相色谱法,(3) 流动相 反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统(采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统)，如经使用不合适时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。 其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者(小于或等于50%)相对于自身的改变量不超过30%且相对于总量的改变量不超过10%为限，如30% 相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的10%为限 。,V D 高效液相色谱法,系统适用性试验 理论板数 分离度 重复性 拖尾因子,V D 高效液相色谱法,测定法 内标法 外标法 加校正因子的主成分自身对照法 不加校正因子的主成分自身对照法 面积归一化法,司帕沙星 P221,消旋山莨菪碱 P866,硫酸卡那霉素 P967,氨基糖苷类抗生素,蒸发光散射检测法,阿米卡星 P388,柱前衍生化法,V E 气相色谱法,系采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用数据处理系统记录色谱信号。,V E 气相色谱法,载气源 进样部分 色谱柱 柱温箱 检测器 数据处理系统,V E 气相色谱法,V E 气相色谱法,各品种项下规定的色谱条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30分钟内记录完毕。,V E 气相色谱法,测定法 内标法 外标法 面积归一化法 标准溶液加入法 (当采用顶空进样时，由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中，故可采用标准溶液加入法以消除基质效应的影响；当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。),对于生产过程中引入的有机溶剂，应在后续的生产环节予以有效去除。除正文已明确列有“残留溶剂”检查的品种必须依法进行该项检查外，其他未在“残留溶剂”项下明确列出的有机溶剂与未在正文中列有此项检查的品种，如生产过程中引入或产品中残留有机溶剂，均应按附录“残留溶剂测定法”检查并应符合相应溶剂的限度规定。（凡例 十七）,V E 气相色谱法,头孢泊肟酯 P198 残留溶剂,V F 电泳法,是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶)中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱并计算其含量的方法。,V G 毛细管电泳法,是指以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据供试品中各组分的淌度(单位电场强度下的迁移速度)和(或)分配行为的差异而实现各组分分离的一种分析方法。,盐酸头孢吡肟 P671,V H 分子排阻色谱法,是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。,头孢拉定 P195,V J 离子色谱法,系采用高压输液泵系统将规定的洗脱液泵入装有填充剂的色谱柱进行分离的色谱分析方法。注入的供试品由洗脱液带入色谱柱内进行分离后，经过抑制器或衍生系统进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。,一、离子色谱的基本原理,42,生命至上 技泽天下,43,生命至上 技泽天下,一、离子色谱技术的基本原理,44,生命至上 技泽天下,淋洗液在线发生器 不用化学试剂，只用水（RFIC） 环保：不直接接触化学试剂 使用方便：只用水和鼠标，省时省力 重现性好：消除试剂杂质的干扰、配制溶液的误差和操作误差，结果更可靠。 增加IC的应用效能，提高灵敏度和分离度，改善重现性，扩展应用，优良的不同时间和不同实验室之间的可比性。 普通等浓度泵即可作梯度淋洗，梯度淋洗和等浓度淋洗同样简单方便，延长泵的使用寿命。,45,生命至上 技泽天下,检测方式 电导 检测具有电导性化合物的通用型检测器 离子色谱最常用的检测器 安培法 在特定的条件下可对某些化合物直接进行氧化还原反应 紫外可见光度法 紫外直接吸收或可见光光度法测定选择性强可进行柱后衍生 荧光法HPLC 质谱,46,生命至上 技泽天下,一、离子色谱技术的基本原理,47,生命至上 技泽天下,一、离子色谱技术的基本原理,48,生命至上 技泽天下,一、离子色谱技术的基本原理,49,生命至上 技泽天下,样品的前处理,0.22，0.45um滤膜去除颗粒状杂质 C18预处理小柱、On-Guard RP柱去除有机分子 石墨化碳黑柱去除色素 On-Guard P柱去除土壤中腐殖酸、苯环类的化合物 On-Guard H、Na柱去除溶液中的金属离子 On-Guard Ag柱去除溶液中的Cl-离子，主要测定高氯（海水）物质中的NO2-，NO3-