腺病毒介导VEGF基因在人骨髓基质干细胞中的表达.doc

腺病毒介导VEGF基因在人骨髓基质干细胞中的表达 作者：陈滨，宋艳斌，李玉华，裴国献【摘要】 目的体外培养人骨髓基质干细胞(hBMSc)，将VEGF165基因腺病毒载体共转染hBMSc，观察其表达。方法共转染实验分为3组：VEGF165和eGFP转染组、空腺病毒载体转染组和未转染组。取重组腺病毒AdVEGF165(MOI=20 pfucell)感染hBMSe。荧光显微镜下观察eGFP的表达，判断感染效率及细胞生长情况，RTPCR检测，ELISA和Westernblot检测分别用于观察基因转染的表达。结果MOI=20 pfu的转染率已达80以上，取此值为转染滴度。提取出的总RNA质量较好。以双链cDNA为模板扩增VEGF165基因，产物经1琼脂糖凝胶电泳，均可见到549 bp(GAPDH)2条带。转染组可见VEGF165表达，空载体组和空白对照组未检测到VEGF165表达。ELISA结果显示基因转染组与转染空载体组和未转染组结果差异呈显著性(P<0.05)。Western blot显示：转染组在50 KD处出现特征性条带，而空载体组和空白对照组未见条带。结论外源性VEGF基因在人骨髓基质干细胞(hBMSc)内获得稳定表达，在本实验条件下培养的hBMSc具有典型成骨细胞的形态学特征和较强的生物学活性，向成骨细胞方向分化效率较高，细胞数量可以满足骨组织工程研究的要求。 【关键词】 骨髓基质干细胞； VEGF； 绿色荧光蛋白； 基因转染 Abstract：ObjectiveTo investigate the possibility of stable expression of VEGF65 in human bone marrow stromal cell.MethodhBMSc were divided into transfection group, empty vector group and control group, hBMSc were infected with AdVEGF165(MOI=20 pfu). The hBMSc proliferation and transfection efficiency were confirmed by fluorescence microscope.The expression of VEGF165 gene of cultured hBMSc transfected with VEGF165 gene was assayed by RTPCR, ELISA and Western blot.ResultVEGF165 gene was amplified with RTPCR.GAPDH gene(internal control) was located at 549 bp in the three groups, VEGF165 gene was located at 500 bp in transfection group but not in the other groups. ELISA assay showed that the expression had significant difference in the transfection group compared with the empty vector group and control group (P<0. 05).Westernblot assay showed specific 50 KD trace.ConclusionExogenous VEGF gene was stably expressed in hBMSc, hBMSc cultured under conditions in this experiment study showed typical morphological characteristics of osteoblast and strong biological activity.Differentiation efficiency towards osteoblast WAS high, and the cell amount could meet the needs of bone tissue engineering research. Key words：bone marrow stromal cell; VEGF; green fluorescent protein; gene transfection 来源于成人骨髓的hBMSc具有间充质干细胞的特性，有较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能，虽然数量稀少，但来源充足，取材方便安全，成骨能力确切，在特定条件下可大量扩增并向成骨细胞定向诱导分化，且自体细胞移植无免疫排斥反应，可能成为理想的骨组织工程种子细胞来源，受到了广泛的关注。目前从小动物到灵长类动物BMSc向成骨细胞定向诱导分化技术已经取得了可喜的成效，但建立hBMSc规范、安全、高效的体外培养增殖方法的研究刚刚起步，因此需要进行进一步研究。本实验在此基础上将重组腺病毒AdVEGF165转染hBMSc以探讨转染对hBMSc体内外成骨及血管化的影响。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 实验用骨髓取自早产死胎，注射器肝素化后抽取45 ml骨髓置入装有DMEM培养液的无菌50 ml离心管内，过滤，离心，去除最上面的黄色脂肪层。采用全骨髓培养法以1106cm2置于25 ml培养瓶中培养，每瓶含5 ml培养液(含青、链霉素各100 gml，体积分数为10FBS，普通高糖DMEM)，置于37、含体积分数为5的CO2湿化空气孵箱中培养。3 d后半量换液，以后每4872 h全量换液。原代培养至第810 d，细胞汇合成单层，0.25的胰蛋白酶消化细胞后传代培养。 1.2 VEGF165和eGFP基因共转染人骨髓间充质干细胞 共转染实验分为3组：VEGF165和eGFP基因转染组、空腺病毒载体转染组和未转染组。将hBMSc以1105孔的密度在六孔板中培养，使用20% FBS的DMEM在37 5 CO2培养箱中培养，24 h后取一板用于细胞计数，其余的细胞用于病毒感染或空白对照。吸去6孔板中的细胞培养基，以无血清培养基洗涤细胞一次，再加入无血清培养基100 l用于稀释腺病毒；分别以MOI=5、20、40 pfu的AdVEGF165加入到hBMSc中，每一浓度加3孔，轻轻混匀； 375CO2培养箱中培养4 h；加入含20FBS的DMEM500 l/孔，继续培养，48 h后荧光显微镜下观察感染效率及细胞生长情况；取重组腺病毒AdVEGF165(MOI=20 pfu)感染hBMSc。 1.3 RTPCR检测 提取细胞RNA， 逆转录成cDNA，以二链cDNA为模板，用VEGF165基因合成时的VE3、VE14分别为上下游引物和内参照基因(GAPDH)引物进行PCR反应。 1.4 ELISA检测 取重复感染度MOI值为20的AdVEGFl65转染hBMSc，分别取感染后1、3、5、7 d的上清，稀释10倍后用ELISA测定VEGF165的含量。分别将标本及不同浓度标准品加入相应孔中(100 l孔)，封板胶纸封住反应孔，37孵育90 min洗板4次；1.7.3除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100 l孔)，封住反应孔，37孵育30 min；洗板4次；除空白孔外，加入酶结合工作液(100 l孔)，封住反应孔，37孵育60 min；洗板4次；加入底物显色剂(100 l/孔)， 37避光孵育5 min；加入终止液(100 l/孔)，混匀后立即测量A450值，根据标准曲线计算VEGF165浓度。 1.5 Westernblot检测 配制12分离胶和5成层胶。所有实验和对照组在病毒转染后5 d，收集各组上清液，用15KD孔径透析膜透析2 h，浓缩为原体积的110，加上样缓冲液。经SOSPAGE电泳，转膜，与抗体结合后拍照记录实验结果。 1.6 统计学方法 结果以均数标准差表示，所测数据使用SPSS 13.0统计软件进行采用析因设计方差分析，各时间点内组间比较用OneWay ANOVA分析，组间多重比较用SNK法，P<0.05统计学差异显著。 2 结 果 2.1 荧光显微镜观察 转染eGFP后，细胞仍贴壁生长，呈梭形或多角形，仍分裂增殖，但增殖速度有所降低。荧光显微镜下，24 h可见有绿色荧光表达，但数量较少，强度较低，48 h可见细胞发出强烈的荧光，呈全细胞分布(图1,2)。 以未转染的同期细胞作为背景荧光，随机计数多个低倍视野(100)中相差显微镜及转换荧光观察的细胞数量，计算荧光的转染效率。比较MOI=5、20、40 pfu时转染效率，MOI=20 pfu的转染率已达80以上，取此值为转染滴度。 2.2 总RNA电泳 总RNA测浓度为1 631.1 ugl，A260A280比值为1.855。提取出的RNA经1琼脂糖凝胶电泳显示5、18、28 s 3条RNA电泳带清晰，且28 s与18 s亮度比基本符合21的理论值。表明所提取的RNA质量较好(图3)。 2.3 RTPCR检测 以双链cDNA为模板扩增VEGF165基因，经RTPCR扩增，产物经1琼脂糖凝胶电泳，3组均可见到549 bp(GAPDH)2条带。转染组可见VEGF165表达，片段大小与理论值约500 bp一致，空载体组和空白对照组未检测到VEGF165表达(图4)。 2.4 ELISA ELISA结果经析因分析显示不同转染组差别有统计学意义(F=6158.978，P<0.001)，不同时间点之间有差别(F=142.344，P<0.05)，二者有交互作用(F=647.298，P<0.001)。SNK方法两两比较显示基因共转染组与其它两组之间VEGF165蛋白含量有差别(P<0.05)，空载体转染组与未转染组之间差别无显著性意义(P>0.05)，OneWayANOVA及SNK两两比较显示基因共转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量均有差别(P均<0.05)(表1、图5)。表1 各组ELISA法测定VEGF165蛋白含量 2.5 Western blot检测 Westernblot印迹显示：转染组在50KD处出现特征性条带，而空载体组和空白对照组未见条带(图6)。 图1 hBMSc转染48 h荧光显微镜(200) 图2 hBMSc转染48 h荧光显微镜(400) 图3 hBMSc细胞总RNA琼脂糖电泳图 图4 VEGF165基因扩增产物电泳图 图5 图6 hBMSc VEGF165蛋白的Western blot鉴定 3 讨 论 骨组织工程研究近年来取得了许多令人振奋的成果，但要应用于临床修复骨缺损尚有不少有待解决的问题，种子细胞的研究是其中的关键环节。目前研究的骨组织工程种子细胞主要来自骨组织、骨膜、骨髓和骨外组织。由于骨组织和骨膜来源有限、取材不便，骨外组织的成骨性能和机制不完全清楚，均限制了其临床应用。而hBMSc来源充足，取材方便安全；便于培养和基因修饰，成骨能力确切，且自体细胞移植无免疫排斥反应，因此，hBMSc是理想的骨组织工程种子细胞来源，近年来已引起了广泛的关注1，2。 VEGF作为特异内皮细胞分裂素，能够刺激体外培养的内皮细胞的增殖。VEGF由于具有强效的血管生成作用，用以促进骨组织工程体内血管化的研究日趋广泛和深入35。 本实验使用构建的带有VEGF165的重组腺病毒感染原代培养的hBMSc，较低剂量(MOI=20 pfu)的腺病毒即可获得大于80的感染率；通过RTPCR检测VEGF165基因表达，能见到500bp的阳性条带。ELISA检测培养液中分泌的VEGF165蛋白，感染细胞培养上清中VEGF165的表达时间在2周左右，在转染后第7 d达到高峰；转染后VEGF165浓度显著高于未感染的对照组；Westernblot检测可见约50KD大小的阳性条带。荧光显微镜下观察到eGFP并利用eGFP示踪转染效率。感染腺病毒后的hBMSc生长良好，形态学无明显改变，未发现细胞变圆或脱落。本实验证实了构建的AdVEGF165感染哺乳动物细胞后具有分泌VEGF165的能力，并获得了转VEGF165基因hBMSc，为下一步转基因细胞复合支架材料在体内成骨和再血管化动物实验提供移植细胞。 实验研究结果显示重组腺病毒在较低的MOI(20 pfu)即可感染>80的hBMSc，并且高水平地分泌目的蛋白，因此在腺病毒载体介导的基因治疗中，hBMSc是一种理想的细胞平台。 通过本实验条件下培养的hBMSc具有典型成骨细胞的形态学特征和较强的生物学活性，向成骨细胞方向分化效率较高，细胞数量可以满足骨组织工程研究的要求。本实验证实了构建的AdVEGF165感染哺乳动物细胞后具有分泌VEGF165的能力，并获得了转VEGF165基因hBMSc。【参考文献】 1 王开友，张鲁平，王 颖，等血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响J中