焦化作业工人淋巴细胞HSP70表达及作用.doc

焦化作业工人淋巴细胞HSP70表达及作用【摘要】 目的 探讨热应激蛋白70（HSP70）在焦炉工人外周血淋巴细胞的表达水平及其意义。方法 用微核试验和碱性单细胞凝胶电泳技术（彗星试验）检测淋巴细胞的染色体畸变和DNA损伤情况 ，用蛋白印迹（western blot）法检测淋巴细胞HSP70表达水平。结果 外周血淋巴细胞微核率和彗星尾长在高暴露组显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；HSP70的表达水平在高暴露组、低暴露组和对照组分别为1.120.36,1.340.83,0.890.40，低暴露组明显高于对照组（P<0.05）；高暴露组工人的外周血淋巴细胞HSP70的表达水平与彗星尾长呈负相关（r=-0.416,P=0.03）。结论 焦炉作业环境可诱发外周血淋巴细胞HSP70蛋白表达，较高水平HSP70的表达对细胞DNA损伤具有保护作用。 【关键词】 焦炉工人热应激蛋白(Heat Stress Proteins,HSPs)是生物体内一种高度保守的蛋白质，热应激蛋白70（Heat Stress Protein70,HSP70）是热应激蛋白家族中最保守和最重要的一族，在机体细胞耐受形成、机体免疫调节、基因调控、细胞增殖分化、肿瘤发生发展等过程中发挥重要的生物学功能1。有报道显示，多环芳烃也可能影响HSP70的表达，但结论不一2，3，其表达与多环芳烃引起的DNA损伤间的关系尚不清楚。本研究主要通过测定焦炉工人外调血淋巴细胞的染色体畸变和DNA损伤以及HSP70表达水平的变化，探讨以多环芳烃为主要暴露因素的焦化作业工人外周血淋巴细胞HSP70的表达特征以及在DNA损伤中的作用，为焦炉工人肺癌的早期诊断和预防及生物标志物的研究提供科学依据。1 对象与方法11 对象 选取某焦化厂焦炉作业工人49名为研究对象。工龄5年以上，年龄3045岁，均为男性。按工作性质及环境监测结果，分为高暴露组30人（炉顶工、炉侧工）、低暴露组19人（炉底工）；选取距该焦化厂2km处的疾病预防控制中心31名男性工作人员为对照组，工龄、年龄相仿均无有毒有害作业接触史。12 方法 （1）问卷调查：用由职业医学专家设计的统一调查表，按照统一的方法及标准，进行面对面询问调查。调查内容包括一般情况、身体状况、既往史、遗传史、职业史、生活环境、用药情况、营养调查、生活习惯等。（2）环境监测：采用个体采样方法进行采样。分别选取炉顶、炉侧、炉底和对照区工人各2名，随身携带HSF513型个体采样器（美国Gilian公司），流量2L/min，连续采样6h，每个工作区重复测定2次。采用Varian-Prostar高效液相色谱仪（美国Varian公司）检测苯并（a）芘B(a)p浓度。用干球温度计测定工人作业场所温度。（3）微核试验：取肘静脉血1ml，用甲基纤维素法制片，4冰箱甲醇固定5min,Giemsa染色1015min，油镜下观察。计数1000只形态完整的淋巴细胞微核数，以表示。（4）碱性单细胞凝胶电泳（彗星试验）：参照文献4方法。按文献5方法分离淋巴细胞，制备单细胞悬液与等量质量浓度为1%的低熔点琼脂糖混合，包埋在磨砂玻片上制成凝胶板。经裂解、解旋、电泳、中和及脱水后以溴化乙锭（EB）进行染色，在荧光显微镜（日本Nikon公司）590nm波长的激发光下进行观察，每份样品记数50个细胞，用Comet IMI10软件测量尾长6。（5）蛋白印迹（Western-blotting）法：静脉采血，肝素抗凝，分离淋巴细胞，采用总蛋白定量试剂盒（美国Bio-Rad公司）进行总蛋白定量，调节蛋白浓度一致。其中一抗用兔抗人HSP70（美国Stressgen公司），4过夜，然后在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤3次，每次15min；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（美国KPL公司），室温振荡1h，PBS洗涤3次，每次15min，电化学发光（ECL）发光剂（英国Amersham公司）显色。结果扫描保存，用Gelpro32分析软件进行定量分析。HSP70相对表达值的计算均以对照的blot积分吸光度值为基准，用其余各组blot积分吸光度值与对照的blot积分吸光度值之比值表示。13 统计分析 应用SPSS100软件进行方差分析和相关分析。2 结果21 研究对象的一般情况 某焦化厂焦炉作业工人49名。其中，高暴露组30名，平均年龄（3973174）岁，平均工龄（1924386）年；吸烟者23名，占78%；饮酒者14名，占44%；低暴露组19名，平均年龄（3942203）岁，平均工龄（1672635）年，吸烟者15名，占79%；饮酒者9名，占46%。无任何有毒有害作业接触史的对照组31名，平均年龄（3948216）岁，平均工龄（1813519）年；其中吸烟者25名，占80%；饮酒者12名，占40%。所有被调查者均为男性，统计分析显示，3组在年龄、工龄、吸烟、饮酒方面差异无统计学意义（P>005）。22 作业场所环境监测结果 炉顶、炉侧、炉底工作区的B(a)p浓度分别为（035002），（010000），（00450007）g/m3，分别为对照（002000）g/m3的175,5,225倍；作业场所环境温度分别为131,88,13,78。23 淋巴细胞微核率、DNA损伤情况及HSP70表达（表1） 高暴露组的微核率和彗星尾长均显著高于对照组（P<005）；低暴露组HSP70表达水平明显高于对照组（P<005），而高暴露组的HSP70表达与对照组间差异无统计学意义（P>005）。表1 各组淋巴细胞微核率、DNA损伤结果及HSP70表达水平（略）注：与对照组比较，*P<00524 淋巴细胞彗星尾长和HSP70相关分析 在高暴露组，淋巴细胞彗星尾长与HSP70表达水平呈负相关（r=-0416,P=0038）；在低暴露组和对照组无明显相关关系（r分别为0013,0092，P>005）。3 讨论在炼焦过程中，工人暴露于高温和焦炉逸散物（Coke Oven Emission,COE）等多种有害环境中，焦炉逸散物可诱发焦炉工人遗传物质损伤7，8，其中多环芳烃为主要遗传毒物，与焦炉工人肺癌危险性的增高有关。HSP70是与职业损伤保护作用最为密切的应激蛋白之一，HSP70含量的增加，有利于抵抗外来刺激，保护机体细胞免受损伤。有研究表明，高温及焦炉逸散物中一氧化碳，二氧化硫、苯、粉尘等均可影响机体HSP70表达9，10。本次研究发现，在低暴露组淋巴细胞HSP70的表达明显增高，而在高暴露组又有下降的趋势，与高雅娟3的研究结果一致。推测HSP70的表达下降可能与高剂量B(a)P的抑制作用有关。通过进一步分析发现，在高暴露组，淋巴细胞HSP70水平与DNA损伤（彗星尾长）呈明显的负相关（r=-0416,P<005）,提示较高水平HSP70的表达对细胞具有保护作用，减轻DNA损伤。但其机制尚不清楚。因此，从职业应激的角度来讲，控制多环芳烃特别是B(a)P暴露，将有利于调节机体HSP70的表达水平，增强机体对职业有害物质损伤的耐受，从而更好地提供细胞保护作用。机体HSP70表达水平也可作为监测B(a)P暴露和机体细胞损伤的辅助指标。【参考文献】 1 郑金平，祝寿芬.热休克蛋白与抗肿瘤免疫及其应用J.山西医科大学学报，2003，34(4)：354-358.2 杨进波，肖成峰，杨晓波，等.苯并a芘对内皮细胞增殖活性的影响及热应激蛋白70表达关系的研究J.卫生研究，2003，32(2)：92-94.3 高雅娟，陈胜，肖成峰，等.苯并(a)芘代谢产物作用下人胚肺细胞热应激蛋白70表达与DNA损伤J.中华劳动卫生职业病，2000，18(6)：321-323.4 Singh NP,MoCory MT,Tice RR,et al.A simple technique for quantitation of low level of DNA damage in individual cellsJ.Exp Cell Res,1988,175:184-191.5 沈关心，周汝.现代免疫学实验技术M.2版.武汉：湖北科学技术出版社，1998：377-390.6 朱志良，庄志雄，黄钰，等.单细胞凝胶电泳图象分析系统的研制与应用J.中华劳动卫生职业病，2001，19(4)：298-300.7 Marczynski B,Rihs HP,Rossbach B,et al.Analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2deoxyguanosine and DNA strand breaks in white blood cells of occupationally exposed workers:comparison with ambient monitoring,urinary metabolites and enzyme polymorphismsJ.Carcinogenesis,2002,23:273-281.8 Leng S,Cheng J,Pan Z,et al.Associations between XRCC1 and ERCC2 polymorphisms and DNA damage in peripheral blood lymp