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恒河猴CD1d基因的克隆及其组织表达差异性分析 作者：张萍, 周慧芳, 孙正华, 邵晓丽, 张华堂, 徐小宁【摘要】 目的: 克隆非人灵长类疾病动物模型恒河猴的CD1d基因并检测其在不同组织中的表达差异情况。方法: 提取恒河猴血液及各组织的RNA, 以反转录得到的cDNA为模板, 用特异性引物扩增CD1d; 以管家基因GAPDH为内参, 用半定量RTPCR的方法对CD1d的组织表达差异性进行分析。结果: 成功扩增了恒河猴CD1d基因的编码区序列; 首次用半定量RTPCR的方法检测了CD1d mRNA在恒河猴部分组织中的表达情况, 发现其表达水平存在明显的组织差异性, 其中, 在肝脏、 脾脏和心脏中的表达水平较高, 在血液、 小肠和肺中次之, 在脑中表达最少。结论: 研究结果为今后表达恒河猴CD1d蛋白并制备其四聚体进而研究恒河猴NKT细胞在众多疾病中的作用奠定了基础; 组织表达差异的研究结果提示其在相关疾病的发生发展过程中可能扮演着重要的角色, 具体作用还有待深入研究。 【关键词】 CD1d; NKT细胞; 恒河猴; 组织分布 Abstract AIM: To amplify the CD1d and analyze its tissue distribution in Rhesus macaque. METHODS: Extracting total RNA from different tissues of Rhesus macaque. CD1d amplification was carried using specific primers and tissue distribution was analyzed by semiquantification RTPCR, using the housekeeping gene GAPDH as an internal control. RESULTS: The CD1d coding region was obtained in this experiment and tissue distribution was analyzed: a highest level of CD1d expression was detected in heart, liver and spleen, lower level in blood, lung, small intestine and stomach, and least in brain. CONCLUSION: The successful amplification of CD1d is useful to produce antiCD1d antibody and CD1dtetramer to study NKT cells in Rhesus macaque. The expression profile of CD1d mRNA in Rhesus macaque is in accordance with the tissue distribution and the functions of NKT cells in other species. These results will provide important insights for future research on the relationship of CD1d/NKT cells and their roles in different tissues. KeywordsCD1d; NKT cells; Rhesus macaque; Tissue distributionCD1家族是一类非经典的抗原递呈分子, 包括CD1a、 b、 c、 d和e 5个成员, 其中CD1 a、 b、 c和e属于第组, CD1d属于第 组。在灵长类中两类CD1分子均有表达, 但在小鼠等啮齿类动物中仅表达CD1d, 称为CD1d 11。CD1家族成员在进化中表现的非常保守。与经典的抗原递呈分子MHC结构类似, CD1d分子也包括胞膜外区（ 13）、 跨膜区和胞质区, 并通过重链3结构域与2m非共价结合形成异源二聚体发挥抗原递呈的功能; 与MHC不同的是, CD1d递呈的是脂类抗原, 而非肽类抗原。作为抗原递呈分子, CD1d可以将外来或自身的脂类抗原递呈给CD1d限制性的NKT细胞。NKT细胞是一类数量很少但很重要的免疫细胞, 在细胞免疫和体液免疫中均起重要作用2。鉴于NKT细胞表现出的CD1d限制性, 承载GalCer（一种从海绵中提取的鞘糖脂）的CD1d四聚体已经成为检测和认定NKT细胞的关键性标记之一3, 因此, 克隆并表达功能性的CD1d已经成为研究NKT细胞的重要环节。 目前, 许多物种的CD1d基因序列已经得到了公布, 其编码区长度在不同物种中稍有差别, 人的CD1d基因编码区全长有1 008 bp, 恒河猴为1 014 bp, 小鼠CD1d 为1 011 bp。尽管如此, 不同物种间CD1d的同源性及功能上均表现了高度的保守性。有研究表明, CD1d分子主要表达在脾细胞、 树突状细胞（DC）和胃肠道上皮细胞上。Canchis等4曾通过免疫组化染色方法检测到人的CD1d在小肠、 肝脏、 胰脏、 肾脏、 胃以及皮肤等组织中均有表达。Kasai等5结合原位杂交及免疫组化方法发现在大鼠的脾脏、 胸腺、 肝脏、 肺、 心脏、 肾脏、 小肠等组织中均有CD1d 1的表达。但尚未见到关于恒河猴的CD1d组织表达差异情况的详细报道。本试验中, 我们对人类疾病发生和治疗等研究中被广泛应用的非人灵长类动物模型恒河猴的CD1d分子进行了克隆和研究。成功克隆了恒河猴的CD1d编码区序列, 并首次用半定量RTPCR的方法检测了部分组织中CD1d的表达情况, 为今后研究CD1d/NKT细胞的分布及其在不同组织中的功能特点给出了提示。 1 材料和方法 1.1 材料 恒河猴各组织总RNA由昆明动物研究所比较基因组学研究组提供; rTaq聚合酶 (DR001A)、 DNA Marker DL 2 000 (D501A)、 pMD19T（D102A）载体、 及其他生化常用试剂购自TaKaRa公司; 大肠杆菌DH5为中科院昆明动物研究室免疫生物学实验室制备并保存; RNAprep培养细胞总RNA提取试剂盒 （DP430）、 琼脂糖凝胶回收试剂盒 （DP21402）、 pfu高保真聚合酶 （EP10101）、 TIANscript MMLV逆转录酶 （ER10404）购自Tiangen公司; iCyclerTM Thermal Cycler PCR仪购自BioRad公司; Sal I （ER0641）和BamH I （ER0051）内切酶购自Fermentas公司。 1.2 方法 1.2.1 组织cDNA模板的获得 取10 L总RNA(约5 g), 按TIANscript MMLV逆转录酶的说明书进行反转录: 加入2 L dNTP (10 mol/L)和2 L oligo (dT)引物(10 mol/L), 混匀后70反应5 min; 冰上冷却, 加入1 L DTT, 4 L 5First Strand Buffer, 混匀, 42反应2 min; 加入1 L反转录酶 MMLV (200 U), 42反应50 min; 最后95放置5 min终止反应即得到第1链cDNA。 1.2.2 基因的扩增、 质粒的构建、 提取及鉴定 根据GenBank中恒河猴CD1d序列（NM_001033114）设计引物（表1）, 利用恒河猴血液的cDNA作模板进行扩增; 同时用管家基因GAPDH作为参照进行CD1d基因在各组织中表达差异性的半定量分析。用pfu高保真酶进行CD1d扩增的条件为: 50 L反应体系, 96预变性4 min, 扩增30个循环（95变性30 s, 55退火30 s, 72延伸2 min）, 最后72充分延伸10 min。扩增完成后将产物进行加A处理: 50 L产物中加2 L dNTP和1 L rTaq, 72反应40 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测, 得到预期长度的片段后割胶回收, 然后连入pMD19T载体, 转化入DH5感受态, 菌液涂到含Amp的LB平板上, 37过夜培养, 随机挑取长出的克隆摇菌, 12 h后提质粒; 提出的质粒用Sal I和BamH I进行双酶切鉴定, 鉴定正确的克隆送去测序, 进一步确认所得到的产物是恒河猴的CD1d基因。 1.2.3 恒河猴CD1d mRNA的组织表达差异性分析 以管家基因GAPDH为参照, 用半定量RTPCR的方法检测恒河猴不同组织中CD1d mRNA的表达水平。表1 扩增人和恒河猴的CD1d全长基因及GAPDH片段的引物 2 结果 2.1 恒河猴的CD1d基因的扩增 以人和恒河猴的血液cDNA为模板, 用如表1中设计的特异性引物扩增人和恒河猴的CD1d基因编码区, 经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测发现我们得到的片段长度为1 000 bp左右, 与预期结果相符（图1）。 2.2 重组质粒的鉴定 PCR产物经割胶回收后连入pMD19T载体, 转化入DH5感受态, 涂含Amp的LB平板, 挑取长出的克隆摇菌, 12 h后提质粒并用Sal I和BamH I进行双酶切鉴定, 经鉴定发现所提的重组质粒中确实含有1 000 bp左右的插入片段（图2）。 为进一步确认所得到的片段确为恒河猴CD1d基因, 我们将初步鉴定正确的克隆送出测序。测序结果显示, 我们得到的片段为1 014 bp, 经BLAST序列比对显示该序列与GenBank中恒河猴的CD1d序列一致编码336个氨基酸, 用EditSeq软件预测其蛋白的相对分子质量（Mr）约为37 861, 说明我们成功获得了恒河猴CD1d的编码区序列, 为今后表达该蛋白和研究该分子的功能奠定了基础。 2.3 恒河猴CD1d mRNA的组织表达分布情况的初步分析 以恒河猴血液及各组织总RNA反转录得到的cDNA为模板, 用管家基因GAPDH (669 bp)为参照对不同组织中CD1d（1 014 bp）的表达水平进行了检测（图3）, 结果表明, 检测的各组织中均有CD1d mRNA的表达, 但以心脏、 肝脏和脾脏中表达最多, 小肠、 血液、 肺和胃中的表达相对较少, 脑中CD1d的表达水平最低。 3 讨论 Canchis等利用免疫组化和原位杂交的方法检测了人和大鼠中的CD1d在各组织中的表达情况4, 5, 而恒河猴CD1d的组织表达谱至今还没有研究报道。本试验中, 我们利用半定量RTPCR的方法对恒河猴CD1d mRNA在不同组织中的表达情况进行了检测。结果发现, CD1d在心脏、 肝脏和脾脏中表达水平最高, 血液、 小肠、 肺和胃中相对较少, 脑中CD1d的表达水平最低, 这种表达模式与以往关于CD1d/NKT细胞的研究比较吻合。众所周知, 肝脏承载着机体的新陈代谢和固有免疫等重要功能。研究证明, 肝脏中NKT细胞的比例是最多的, 而且CD1d/NKT细胞在抵抗HBV感染和发病、 肝细胞肿瘤免疫等方面都发挥着重要的作用6, 因此, 我们推测恒河猴肝脏中CD1d高表达的现象可能与NKT细胞在肝脏中抗病毒感染等免疫功能相关, 这给我们一定的提示, 有助于进一步研究肝脏NKT细胞的功能, 也提示我们可以利用CD1d限制性制备针对NKT细胞的相关疫苗来防治肝脏肿瘤和病毒感染性疾病。NKT细胞在自体免疫反应和免疫耐受等疾病中也有重要影响, 研究表明, 脾外周B细胞高水平表达的CD1d分子及其活化的NKT细胞可以抑制1型糖尿病的发生7。本实验的结果也验证了在恒河猴脾组织中能检测到高表达的CD1d, 借此结果, 我们可以进一步研究脾中的NKT细胞与1型糖尿病的关系, 从而找到治疗1型糖尿病的方法。另外, 研究发现, 巨噬细胞表达的CD1d所活化的NKT细胞会聚集到心脏的发炎部位8, 而本研究中我们又证明恒河猴的心脏中CD1d的表达水平较高, 可以推测其与心脏相关疾病的免疫是密切相关的。 CD1d和NKT细胞对于机体抗感染及抵抗病毒感染等具有重要作用, 但其机理和具体的分子机制尚不明确, 需进一步的研究和补充。本实验中得到了恒河猴CD1d在不同组织中的表达差异情况, 与以往的研究结果有很强的相关性, 提示我们可以以恒河猴为动物模型深入研究其CD1d分子与NKT细胞的关系和相互作用, 并研究NKT细胞在不同组织中的免疫功能, 进而为相关疾病的治疗, 抗病毒感染及抗肿瘤免疫等研究提供基础和依据。 致谢: 感谢中国科学院昆明动物研究所比较基因组学实验室提供的恒河猴组织RNA; 感谢试验过程中李德敏老师提供的帮助和建议。【参考文献】 1 Brossay L, Kronenberg M. Highly conserved antigenpresenting function of CD1d moleculesJ. Immunogenetics, 1999, 50(3): 146-151.2 Taniguchi M, Seino K, Nakayama T. The NKT cell system: bridging innate and acquired immunityJ. Nat Immunol, 2003, 4(12): 1164-1165.3 Li D, Chen N, McMichael AJ, et al. Generation and characterisation of CD1d tetramer produced by a lentiviral expression systemJ. J Immunol Methods, 2008, 330(1-2): 57-63.4 Canchis PW, Bhan AK, Landau SB, et al. Tissue distribution of