压力超负荷性肥大心肌细胞AT1和AT2mRNA表达的动态变化.doc

压力超负荷性肥大心肌细胞AT1和AT2 mRNA表达的动态变化【摘要】 目的：观察压力超负荷性肥大心肌细胞表面AT1和AT2受体mRNA表达的动态变化. 方法：构建压力超负荷性心肌肥大模型，于不同时间点急性分离心肌细胞. 采用RTPCR法观察肥大心肌细胞中AT1和AT2 mRNA表达的动态变化. 结果：随着大鼠心肌肥厚程度的逐渐加重，于术后4 wk起，AT1与AT2 mRNA的表达水平较之假手术组均逐渐升高，8 wk时继续升高. 主动脉缩窄12 wk组AT1的表达水平与8wk组无显著性差异，但AT2的表达水平从0.4380.088进一步升高至0.5800.066，且差异有显著性（P<0.05）. 各时段假手术对照组间心肌细胞中AT1与AT2的表达水平均无明显变化. 结论：在压力超负荷性心肌肥大过程中，心肌细胞AT1与AT2 mRNA的表达呈现动态的变化过程. 表达增多的AT2受体可能会在随后心力衰竭的发生中发挥一定作用. 【关键词】 心肌细胞 受体 血管紧张素II 1型 受体 血管紧张素II 2型 0引言 目前已发现细胞表面主要存在着血管紧张素（Ang）的两种受体，即型受体（AT1）及型受体（AT2）. 已知AT1介导了几乎所有Ang的生物学效应1，而AT2的功能至今尚不完全清楚. 目前认为，AT2与胚胎发育、细胞分化、凋亡等生物过程有关，且在某些方面具有与AT1相拮抗的作用. AT2可以减轻或逆转心脏纤维化以及血管重塑2，从而对抗AT1介导的促纤维化作用；AT2可以引起血管舒张3，而这也与AT1引起的血管收缩效应相反. 成年期AT2的表达水平低下，在某些病理条件下, AT2及AT1的表达水平将会发生变化. 由于这两型受体可能存在拮抗作用，因而在不同疾病条件下二者表达水平的变化将会对心脏的功能和结构起重要的调节作用. 目前，有关心肌肥大过程中心肌细胞上Ang受体动态变化的报道不多. 我们以压力超负荷性肥大心肌细胞为实验对象，观察在细胞肥大过程中其表面AT1和AT2受体mRNA表达的动态变化及与心肌肥大之间的相互关系，以期进一步深入理解两型受体在心肌肥大发生中的作用及其机制. 1材料和方法 1.1材料雄性SD大鼠36只， 体质量220250 g（西安交通大学实验动物中心). Ang，collagenase，protease及BSA（Sigma公司）. Trizol及Taq酶（Promega公司），dNTPs及100 bp DNA Ladder（华美生物工程公司）. 引物由上海康成生物技术有限公司合成. 其它试剂均为进口或国产分析纯. 1.2方法 1.2.1压力超负荷性心肌肥大模型的构建将实验动物随机分为2组各18只，腹主动脉缩窄组于左肾动脉上方小心分离长约3 mm的腹主动脉，套以内径为0.8 mm的银夹造成缩窄；假手术组除不以银夹缩窄腹主动脉外，其余操作同腹主动脉缩窄组. 术后分别饲养4 wk（6只）、8 wk（6只）及12 wk（6只）. 1.2.2心肌细胞的分离及心肌肥大指数测定采用胶原酶Langendorff法对心脏进行逆行灌流, 待灌流结束首先测取左心室质量(包括左心室游离壁和室间隔)，计算左心室质量与体质量比值(LV/BW). 而后获取含有左心室游离壁和室间隔的肥大心肌细胞. 由于心肌细胞的体积和质量较成纤维细胞、微血管内皮细胞等大的多，因而经50 g温和离心1 min后，在置换上清液的同时梯度恢复溶液中Ca2+的浓度. 此过程重复34次后，基本去除所含非心肌细胞4. 提取部分心肌细胞, 使用目镜测微尺测量心肌细胞横径（TDM）. 高倍镜下（1040）随机选取20个视野, 计算其中杆状心肌细胞横径，取其均值为该例左心室心肌细胞横径（LVTDM）. 1.2.3RTPCR一步法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增. 条件为：94变性1 min, 退火1 min. 72延伸1 min，共30个循环，而后于72再延伸5 min. 引物序列、产物长度如下所示. actin：正义链5 CCTGTACGCCAACACAGTGC 3，反义链5 ATACTCCTGCTTGCTGATCC 3， 211 bp；AT1 ：正义链5 CAGCCGTCATCTACCGAAAC 3，反义链5 AGGAAAGGGAACACGAAGC 3, 142 bp；AT2：正义链5 ATCTGGCTGTGGCTGACTT 3, 反义链5 AGCATATTTCTCAGGTGGG 3，362 bp. 以actin作为内参照，用二者凝胶成像后的灰度值与actin相比，代表其相对表达水平. 统计学处理：数据以xs表示，GraphPad Prism统计软件分析，不同时间点的LV/BW，LVTDM，AT1和AT2 mRNA的表达变化分析采用双因素方差分析，各组间相互比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1左心室质量/体质量及心肌细胞横径大鼠腹主动脉缩窄术后4，8，12 wk时LV/BW， LVTDM与其同时点假手术组相比均显著增高(P<0.05). 且随时间的延长，腹主动脉缩窄术后LV/BW和LVTDM呈明显递增关系(P<0.01，表1).表1左心室质量/体质量及左心室心肌细胞横经 2.2RTPCR与假手术组相比，随着大鼠心肌肥厚程度的加重，AT1与AT2 mRNA的表达水平于术后4 wk起逐渐升高，8 wk时继续升高. 12 wk组AT1 mRNA的表达水平(0.5050.059)与8 wk组(0.4680.094) 比较虽有升高的趋势，但无统计学意义；而AT2 mRNA的表达水平从0.4380.088进一步升高至0.5800.066，差异有显著性. 各时段假手术组心肌细胞中AT1与AT2 mRNA的表达水平均无明显变化（P>0.05，图1, 2). 3讨论 目前的资料表明，AT2受体的作用较为复杂有时甚至是相互矛盾的. 研究结果提示AT2在细胞和组织中的作用与当时的特定环境密切相关5. 因此，分离并观察压力超负荷性肥大心肌细胞AT1与 AT2表达的动态变化，对于研究其在压力超负荷性心肌肥大过程中的作用是非常必要的. 有关资料显示：正常成年大鼠心肌细胞AT2处于较低水平，心肌肥厚时AT2表达增加，AT1表达增加或降低的幅度趋缓6；心肌梗死后AT2与AT1(主要是AT1)均明显上调7. 我们的结果表明：正常情况下，成年大鼠心肌细胞上AT1与AT2 mRNA均处于较低水平. 随着大鼠心肌肥厚程度的加重，AT1 mRNA的表达水平于术后4 wk起逐渐升高. 术后8 wk明显升高，在12 wk继续保持较高水平，但8 wk组与12 wk组相比无统计学差异. 但AT2的表达水平从4 wk起升高，8 wk时继续升高，而12 wk时进一步升高. 结合此阶段大鼠心肌细胞的病理改变主要以肥大为主，提示此时Ang II可通过细胞膜上表达逐渐上调的AT1促进细胞的重塑. 与表达上调并逐渐达到顶峰的AT1相比，AT2的上调幅度较大并有继续增高的趋势. 但此时AT2受体将发挥何种作用，目前尚无定论. 有研究表明AT2对肥大的心肌细胞具有保护作用. 心肌梗死后，阻断AT1的同时活化的AT2在AT1阻断剂的治疗过程中发挥着重要作用，这表明AT1阻断剂的作用部分是由活化的AT2介导的8；在成年肥大的大鼠心脏中，抑制AT2将使左室对Ang II的促生长作用更为敏感9；而过度表达AT2将有助于保护心肌梗死重塑过程中转基因小鼠的左室功能10. 但也有实验证实AT2对心功能也可有不利影响11-12,从而引起不断进展的泵功能衰竭、心律失常及心脏重塑. 有关AT2在压力超负荷性肥大心肌细胞中的作用，我们的初步研究结果表明：在肥大心肌细胞中，Ang II通过AT2的介导促进TNF和IL1的生成及释放，说明AT2与心肌重构过程中炎症的发生有关，而这可以进一步引起心功能的失常和心衰的发生.总之，我们的结果表明：压力超负荷性心肌细胞的肥大过程伴随着细胞表面AT1与AT2表达的动态变化. AT2受体表达程度的增加可能与随后的心肌改建及心力衰竭的发生有关.【参考文献】 1 RegitzZagrosek V, Fielitz J, Fleck E. Myocardial angiotensin receptors in human hearts J. Basic Res Cardiol, 1998,93(Suppl 2):37-42.2 Wu L, Iwai M, Nakagami H, et al. Effect of angiotensin II type 1 receptor blockade on cardiac remodeling in angiotensin II type 2 receptor null mice J. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2002,22(1):49-54.3 Carey RM, Wang ZQ, Siragy HM. Role of the angiotensin type 2 receptor in the regulation of blood pressure and renal functionJ. Hypertension, 2000,35(1 Pt 2):155-163.4 李予蓉,商立军,范风云. 成熟心肌细胞的分离与培养方法J. 第四军医大学学报,2000,21(6): s153.5 Schneider MD, Lorell BH. AT2, judgment day: Which angiotensin receptor is the culprit in cardiac hypertrophy J. Circulation, 2001,104:247-248.6 Oliviero P, Chassagne C, Kolar F, et al. Effect of pressure overload on angiotensin receptor expression in the rat heart during early postnatal life J. J Mol Cell Cardiol, 2000,32(9):1631-1645.7 Zhu YZ, Zhu YC, Li J, et al. 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