低氧诱导因子1α在大鼠脑缺血耐受中的表达.doc

低氧诱导因子1在大鼠脑缺血耐受中的表达【摘要】 目的 探讨脑缺血耐受中低氧诱导因子1（HIFl）的表达。方法 84只Wistar大鼠随机分成对照组 （SS+SS组，4只），假手术组（SS+MCAO组，40只）和缺血预处理组（IP+MCAO组，40只）。线栓法阻塞大脑中动脉建立缺血预处理模型，分别于预缺血后1、3、7、14、21 d再缺血2 h，然后取脑经苏木精伊红染色后光镜下进行病理观察，免疫组化方法检测脑组织HIF1蛋白的表达。结果 IP+MCAO组中1、3、7 d的HIF1蛋白表达水平与SS+MCAO组中相应时间点比较，差异具有显著性（t=2.4499.898，P0.05）。结论 HIF1在脑缺血耐受中表达上调，可能是导致脑缺血耐受的分子机制之一。 【关键词】 低氧诱导因子1 缺血预处理 缺血低氧 脑 大鼠 ABSTRACTObjectiveTo investigate the expression of hypoxia inducible factor1 (HIF1) in the brain ischemic model of rats.MethodsHealthy Wistar rats (n=84) were randomly divided into three groups, the shamsurgery group (SS+SS，n=4），the sham and middle cerebral artery occlusion (MCAO) group (SS+MCAO,n=40) and the ischemic preconditioning and MCAO group (IP+MCAO,n=40). A rat model of focal ischemic preconditioning was established via occlusion of middle cerebral artery. At day 1, 3, 7, 4, and 21 after the preconditioning, another two hours of ischemia were given to each experimental animal. The pathology was evaluated by HE staining. The volumes of infarct area were measured, and the expression of the HIF1 detected via immunohistochemical technique.ResultsThe levels of HIF1 expression in rats of IP+MCAO group at day 1, 3, and 7 after the preconditioning were significantly higher than those of the SS+MCAO groups (t=2.449-9.898，P<0.05）.ConclusionThe expression of HIF1 is upregulated, which may be one of the molecular mechanisms in the brain ischemic tolerance. KEY WORDShypoxia inducible factor 1; ischemic preconditioning; hypoxiaischemia, brain; rats 近年研究显示，短暂性脑缺血对神经细胞起保护作用，可抵御其后发生的严重脑缺血，即诱发了脑缺血耐受（IT）1，对其作用机制的探索已成为近年脑血管病研究的热点问题。本实验采用线栓法制备脑缺血耐受模型，通过神经功能评分、苏木精伊红（HE）染色观察病理学改变等对模型进行评估，并通过免疫组化方法检测脑缺血耐受过程中低氧诱导因子1（HIFl）的表达，探讨其在脑缺血耐受机制中的作用。 1 材料和方法 1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠84只，体质量250300 g。随机分成3组。缺血预处理组（IPMCAO组，40只）：预缺血10 min后按再灌注不同时间（1、3、7、14、21 d）分为5个亚组；假手术组（SS+MCAO组，40只）：分按前述时间点5个亚组；对照组（SS+SS组，4只）。 1.2 模型的制备 缺血预处理参照文献2,3方法进行。再缺血的处理按再灌注的不同时间在规定时间点再次麻醉大鼠，将埋在皮下的线栓推进（18.52.0）mm ，再次阻断大脑中动脉造成MCAO，重新结扎ECA近心端，缝合皮肤，2 h后将留在皮外的线栓退出至ECA，形成第2次再灌注，完成再缺血处理。 1.3 实验方法 IPMCAO组预缺血10 min后，分别于再灌注1、3、7、14、21 d后阻塞大脑中动脉2 h，再灌注22 h 后处死；SS+MCAO组假手术代替预缺血，在假手术后按前述不同时间点阻塞大脑中动脉2 h, 再灌注22 h后处死；SS+SS组两次均为假手术。 1.4 神经功能缺损评分 参照BEDERSON 等45分制法进行评分。评分累积1分以上认定为造模成功。 1.5 脑组织病理观察 每组随机选取4只大鼠，心脏灌注生理盐水、40 g/L 多聚甲醛各约200 mL，断头取脑，取前囟后36 mm部位组织，40 g/L 多聚甲醛后固定,脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚5 m。HE染色后镜下观察组织病理学变化。 1.6 HIF1蛋白检测 采用SABC法。SABC试剂盒、兔抗鼠HIF1单克隆抗体（一抗）购自武汉博士德生物工程有限公司。大鼠水合氯醛麻醉后，心脏依次灌注生理盐水、40 g/L多聚甲醛各约200 mL，断头取脑，取前囟后36 mm部位组织，多聚甲醛后固定4 h，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚5 m。每只动物取3张切片，常规脱蜡至水。体积分数0.03的H2O2灭活内源性酶，抗原热修复，滴加1200工作浓度的HIF1单克隆抗体。4 过夜后，依次滴加生物素化二抗、试剂SABC，37 各孵育30 min，DAB显色，镜下控制反应时间。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。参照文献5的方法进行观察。 1.7 图像分析 采用Simple PCI显微图像分析系统进行图像分析，测量免疫组化染色的平均吸光度（A）值。 1.8 统计学处理 采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理，检测结果以s表示。各组同一时间点之间比较采用t检验，组内不同时间点比较采用方差分析。 2 结 果 2.1 神经功能缺损评分 SS+SS组神经功能评分为0。IP+MCAO组3、7 d神经功能评分均低于SS+MCAO组，差异具有统计学意义（t=4.025、2.683，P0.05）。 SS+MCAO组中各时间点间比较差异无显著性；IP+MCAO组中3 d与其他时间比较，差异具有显著性（F=3.55,P0.05）。见表1。表1 各组动物不同时间点神经功能缺损评分比较 2.2 病理学观察 2.2.1 大体改变 缺血侧大脑表面呈不同程度的饱满、苍白等脑水肿征象。 2.2.2 光镜观察 SS+SS组神经细胞的数量及形态分布正常。SS+MCAO组与IP+MCAO组海马区均表现不同程度的损伤改变，如细胞数减少、形态肿胀，细胞排列紊乱。梗死灶中心区组织明显稀疏，神经细胞出现脱失及变形，胞核固缩、溶解，失去完整结构。梗死灶周边区神经元、神经胶质细胞肿胀，甚至胞核固缩、浓染，并可见胶质细胞浸润。IPMCAO组梗死灶中心区较SS+MCAO组明显减小，周围区结构完整的神经细胞明显增多，组织水肿程度减轻；海马区细胞数量减少不明显，排列相对规整（图1、2）。 2.3 HIF1的检测 光镜下HIF1阳性细胞为胞核或胞浆呈棕褐色或棕黄色。SS+SS组偶尔见少量HIF1蛋白表达。 IP+MCAO组与SS+MCAO组可见较多的HIF1阳性表达细胞，主要分布于皮质、海马、纹状体及室管膜细胞等，神经元与胶质细胞均有表达（图3、4）。IP+MCAO组1、3、7 d的HIF1蛋白表达水平与SS+MCAO组相应时间点比较，差异具有显著性（t=2.4499.898，P0.05）。见表2。 表2 各组HIF1蛋白的表达 3 讨 论 脑缺血耐受是指给予短暂的亚致死性缺血后诱导脑的内源性保护机制,从而对后续长时间缺血损伤产生耐受及自身保护作用1。HIF1是近年发现的一种转录因子，由、两个亚基组成 ，既是调节亚基，又是活性亚基，O2对 HIF1 活性调节主要通过对该亚基的影响实现。低氧时 HIF1 两个亚基形成二聚体，可与许多靶基因的低氧反应元件结合，介导机体的低氧反应，在低氧诱导的基因表达中起到关键作用69。近年许多研究表明，HIF1与脑缺血关系密切，在缺血低氧性脑损伤中发挥重要作用。SHARP等10研究结果显示,局灶性脑缺血发生 7.5 h 后,mRNA编码的HIF1、GT1及一些糖酵解酶在梗死周边区开始诱导出现,19及24 h时其表达被进一步上调。BERGERON等11研究也认为,在急性局灶性脑缺血时HIF1及相关基因表达上调促进了梗死灶周边血管网的重塑和糖酵解,有助于缺血脑组织的存活。 本研究采用文献2,3方法，先后两次线栓堵塞大脑中动脉，建立缺血再灌注模型，通过大鼠神经功能评分、脑组织病理学变化来证实脑缺血耐受的产 生。本文结果显示，预缺血后37 d时间内，IP+MCAO组大鼠神经功能缺损评分明显低于SS+MCAO组，同时苏木精伊红染色显示，IP+MCAO组大鼠脑组织的缺血程度、范围及脑水肿程度均较SS+MCAO组轻。因此， 10 min的预缺血可以诱导脑缺血耐受，具有神经保护作用。 目前，对预缺血诱导产生脑缺血耐受的最佳时间窗尚无定论，CHEN等12的研究显示，分3次给予每次10 min的局灶性预缺血所诱导的脑缺血耐受最早出现于再灌注2 d以后,并可持续57 d。本实验结果显示，通过预缺血10 min，能产生较明显的缺血耐受，这与BARONE等13的观察结果基本一致。同时，IP+MCAO组HIF1表达自3 d开始上调，持续到7 d，后逐渐降低，本文结果与前述脑缺血耐受产生的时间窗基本吻合，提示HIF1可能在脑缺血耐受的产生过程中发挥重要作用。 从表达分布上看，HIF1主要表达于梗死周边区缺血半暗带的神经细胞及部分血管内皮细胞管壁。由于半暗带脑血流量的减少降低了该区域氧的供应，从而诱导HIF1的转录激活及相关靶基因的表达。SHARP等14研究结果显示，在局灶性脑缺血中HIF1表达区均出现血流量下降现象，提示脑缺血后HIF1表达区域即是梗塞周围慢性低氧的区域。 总之，本实验表明 HIF1表达与脑缺血耐受形成密切相关。局灶性缺血预处理后再次严重缺血可使HIF1表达上调，促进其靶基因的转录，对机体形成一定的保护作用。HIF1的表达上调可能是脑缺血耐受形成的重要分子机制之一。 【参考文献】 1KITAGAWA K, MATSUMOTO M,TAGAYA M, et al. “Ischemic tolerance” phenomenon found in the brainJ. Brain Res, 1990,528(1):2126. 2LONGA E Z, WEINSTEIN P R, CARLSON S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ. Stroke, 1989,20（1）：8991. 3王炳高，袁新颜，王守彪， 等. 线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的改进. 青岛大学医学院学报， 2005，41（1）：7374. 4BEDERSON J B, PITTS L H, TSUJI M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurological examination. Stroke, 1986,17:472476. 5边立忠，李琴，刘成玉 ，等. 大鼠脑缺血再灌注免疫组化结果观察方法的改进. 齐鲁医学杂志， 2004,19(6)：519520. 6DIGICAYLIOGLU M, LIPTON S A. Erythropoietinmediated neuroprotection involves crosstalk between Jak2 and NFkappa B signaling cascadesJ. Nature, 2001,412(6847):641647. 7SEMENZA G L. HIF1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxiaJ. Appl Physiol, 2000,88(4):14741480. 8KAUR B, KHWAJA F W, SEVERSON E A, et al. Hypoxia and the hypoxiainduciblefactor pathway in glioma growth and angiogenesisJ. Neurooncol, 2005,7(2):134153. 9WANG V, DAVIS D A, HAQUE M, et al. Differential gene upregulation by hypoxiainducible factor1 alpha and hypoxiainducible factor2alpha in HEK293T cellsJ. Cancer Res, 2005,65(8):3299. 10SHARP F R, BERGERON M, BERNAUDIN M. Hypoxia inducible factor in brainJ. Adv Exp Med Biol, 2001，502：273. 11BERGERON M, GIDDA