IgG刺激诱发的小胶质细胞Toll样受体4表达及细胞因子分泌.doc

IgG刺激诱发的小胶质细胞Toll样受体4表达及细胞因子分泌 作者：吴瑞, 刘玲, 彭正午, 段小莉, 王百忍, 靳亚平, 邝芳【摘要】 目的: 了解在体外培养条件下免疫球蛋白G (IgG) 刺激对小胶质细胞表达Toll 样受体4（TLR4）和分泌细胞因子的作用。方法: 用不同浓度的IgG (2 mg/L、 20 mg/L、 200 mg/L)及脂多糖（LPS）（10 mg/L）刺激原代培养的大鼠小胶质细胞, 24 h后以免疫荧光染色观察TLR4的表达, ELISA法检测培养上清中肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素（IFN）的含量。结果: IgG直接作用于体外培养的小胶质细胞后, 以剂量依赖的方式引起TLR4的表达和TNF的分泌, 但未检测到IFN含量的变化。作为阳性对照的LPS引起了小胶质细胞TLR4表达, 并诱导了TNF及少量IFN的分泌。结论: 同种IgG刺激可使体外培养的小胶质细胞大量表达TLR4, 可能通过MyD88依赖途径导致炎性细胞因子分泌。结果提示至少在中枢神经系统的固有免疫反应中, TLR4可能发挥识别病原体之外的蛋白分子, 例如IgG的作用。 【关键词】 小胶质细胞; 免疫球蛋白G; Toll样受体4; 肿瘤坏死因子; 干扰素AbstractAIM: To investigate the effects of immunoglobulin G（IgG） on the expression of tolllike receptor 4 (TLR4) and secretion of cytokines in microglial cells in vitro. METHODS: Cultured primary rat microglial cells were stimulated with different concentrations of rat IgG (2 mg/L, 20 mg/L, 200 mg/L) and lipopolysaccharide (LPS) 10 mg/L for 24 h, respectively. The TLR4 expression in the microglial cells was examined by immunofluorescence staining and tumor necrosis factor (TNF) and interferon (IFN) levels in the culture medium were assayed by ELISA. RESULTS: IgG stimulation induced a significant TLR4 expression and TNF secretion in cultured microglial cells in a dosedependent manner, while IFN was not detected in the same medium samples. As a positive control, LPS caused increases of TLR4 expression and both IFN and TNF production in the microglial cells. CONCLUSION: TLR4 expression could be induced in microglia in vitro by nonpathogenic protein, IgG from the same species. Therefore, congeneric IgG stimulation might lead to proinflammmatory cytokine production, probably via MyD88dependent pathway. This finding suggests that TLR4 may play more roles than pathogen recognition of innate immune reactivity, at least in the central nervous system.KeywordsMicroglia; Immunoglobulin G; Tolllike receptor 4; Tumor necrosis factor; Interferon固有免疫（innate immunity）是生物体在进化过程中获得的具有普遍性的防御机制, 是宿主对抗病原侵袭的第一道防线, 在获得性免疫（adaptive immunity）系统被活化前发挥抗感染作用1。Toll 样受体4（TLR4）是革兰氏阴性细菌胞壁产物脂多糖（LPS）的特异性识别受体, 对病原体识别有重要作用2。中枢神经系统（central nervous system, CNS）因被血脑屏障（Bloodbrain barrier, BBB）保护、 缺乏淋巴系统及没有免疫细胞而被认为是“免疫特免区”, 但脑内很多疾患的发生发展中均伴有免疫反应。研究发现, TLR4 mRNA 广泛表达在中枢神经系统, 如脑膜, 脉络丛和室周器官3, TLRs也表达于小胶质细胞, 如人的小胶质细胞也表达TLR44, 在中枢神经系统的细菌或病毒的识别和免疫应答的产生过程中起关键作用5。 肥大细胞、 T细胞和IgG在某些生理或病理条件下可以通过BBB渗入脑内6。我们以前的研究发现, 静脉注射肾上腺素引起的动物一过性高血压可使BBB开放, 血液循环中的内源性IgG可因此进入脑内, 并被小胶质细胞吞噬7。据报道, TLR4在CNS主要表达在小胶质细胞上而不是寡突胶质细胞或者神经元8; 而且体外培养的小胶质细胞在LPS作用下可以被激活而释放IL1、 TNF 以及其他多种炎性分子9。那么非特异性IgG在进入CNS后是否会引起炎症反应、 是否通过小胶质细胞表面模式识别受体TLRs活化而产生固有免疫应答目前仍不清楚。为此, 我们在体外培养条件下观察了IgG刺激后小胶质细胞TLR4的表达以及细胞因子的分泌情况, 以探讨TLR4是否参与IgG引起的小胶质细胞的反应机制。1 材料和方法1.1 材料新生1 d SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供。LPS（E.coli 0127: B8）购自美国Sigma公司。纯化的大鼠 IgG购自北京中山公司。小鼠抗大鼠TLR4购自英国Abcam公司, 兔抗大鼠Iba1购自日本Wako公司, Alexa 488 结合的驴抗小鼠IgG和Alexa 594结合的驴抗小鼠IgG购自美国Molecular Probes公司。大鼠TNF和IFN ELISA 试剂盒购自晶美生物公司。1.2 方法1.2.1 小胶质细胞的分离培养新生1 d 鼠10只, 无菌条件下剪开颅骨, 取出脑组织, 分离皮层至含DHanks液的培养皿中反复冲洗以去除血污, 在解剖显微镜下轻轻剥去脑膜和血管, 用DHanks液洗12次。剪碎组织块至12 mm, 加入体积比组织块总量多3050倍的0.125 g/L 胰酶, 37下消化25 min, 加入含100 mL/L胎牛血清的完全DMEM培养液终止消化78 min, 吸出组织至另一含100 mL/L胎牛血清的完全DMEM培养液的离心管, 吹打制成单细胞悬液, 静置, 收集上清液, 接种于细胞培养瓶中, 置于37、 50 mL/L CO2培养箱, 培养1012 d。取出, 将培养瓶放在260 r/min的摇床上振摇1 h, 收集上清, 离心, 沉淀细胞, 再以完全DMEM重悬细胞, 接种于24孔板（孔中铺有多聚赖氨酸包被好的玻片）, 37 50 mL/L CO2培养箱培养。1.2.2 细胞处理将接种于24孔板的小胶质细胞于37、 50 mL/L CO2培养箱继续培养23 d, 加入IgG（终浓度分别为2 mg/L、 20 mg/L、 200 mg/L）, LPS（终浓度10 mg/L）作为阳性对照。IgG和LPS均以不含血清的DMEM配成, 并以同样的不含血清的DMEM做空白对照。作用24 h后收集上清液, 同时取细胞爬片做免疫荧光染色。1.2.3 免疫荧光染色以 40 g/L多聚甲醛固定细胞爬片, 室温, 20 min, 0.01 mol/L PBS洗3次, 每次5 min。以10 g/L 的小牛血清白蛋白（BSA）封闭, 室温, 30 min。0.01 mol/L PBS洗5 min3。抗大鼠TLR4抗体（1100）和抗大鼠Iba1抗体（1800）混合后孵育, 室温过夜。0.01 mol/L PBS洗5 min3, Alexa 594结合的驴抗大鼠IgG (1800)和Alexa 488 结合的驴抗大鼠IgG（1400）混合孵育, 室温避光3 h, 用以结合上述抗大鼠抗体, 再用Hoechest 33258 室温衬染细胞核20 min。以上两步骤间均用0.01 mol/L PBS充分漂洗3次, 每次10 min, 然后用50%甘油PBS溶液封片, 于Olympus FV1000共聚焦显微镜下观察结果。1.2.4 双抗夹心ELISA法测细胞培养上清中TNF和IFN水平收集上清液, 按照试剂盒说明检测TNF和IFN水平, 呈色后以酶标仪450 nm测定吸光度, 数据经换算成浓度（xs）后以SPSS软件进行单因素方差分析, P<0.05时差异有统计学意义。2 结果2.1 小胶质细胞的纯化经免疫荧光染色鉴定, 收集到的小胶质细胞纯度>90%（小胶质细胞标志物Iba1的免疫荧光染色, 图1 A）。2.2 TLR4免疫荧光染色同种IgG直接作用于体外培养的小胶质细胞24 h后, 细胞中可见可大量表达的TLR4免疫阳性产物(图1D、 E、 F箭头所示黄色标记), 分布于胞膜和胞浆。而且随着IgG浓度增加, 表达TLR4的小胶质细胞数量有增加的趋势, 其形态也发生改变, 胞体增大, 并向外伸出一些伪足, 呈煎鸡蛋型。LPS阳性对照组的小胶质细胞也表达TLR4(图1C箭头所示), 但细胞形态改变不大, 与空白对照组(图1B)的细胞相似。2.2 细胞因子含量变化在LPS阳性对照组的胶质细胞的培养上清中检测到有微量的IFN分泌（数据未显示）, 而在不同浓度IgG刺激的各组小胶质细胞培养上清中均未能检测到IFN。IgG刺激小胶质细胞分泌TNF与空白对照组相比显著升高（P<0.05）: IgG 2 mg/L组为(146.6726.5) ng/L, IgG 20 mg/L组为(291.3310.7) ng/L, IgG 200 mg/L组为(386.3356.77) ng/L。LPS组为（580.722.01）ng/L, 空白组为（230.324.9）ng/L（图2）。与空白对照组相比, IgG 20 mg/L、 200 mg/L刺激组明显增高, 差异极显著（P<0.01）, 且TNF分泌量与IgG的浓度有剂量依赖倾向（图2）。3 讨论 TLR4炎症信号通路的激活不仅导致轻微的炎症反应, 而且刺激机体产生并释放大量细胞因子抵抗感染10。脑室内注射LPS, 标志神经胶质细胞激活的一些分子如MHC、 TLR2和TLR4 的表达则增加11。本研究在体外培养的小胶质细胞中加入LPS得到类似的结果, 即LPS刺激可引起TLR4表达, 表明在该培养条件下, 小胶质细胞仍可通过模式识别分子发挥固有免疫应答作用。我们进而在相同的实验系统, 以不同浓度的纯化的大鼠IgG刺激小胶质细胞, 发现刺激后其形态明显改变, 同时表达TLR4。另外, 我们发现TLR4在培养的小胶质细胞并非仅仅表达在细胞膜上, 这与Bsibsi等4指出的TLR3和TLR4特异性定位于体外培养的人细胞内的小囊泡, 但在脑组织中的小胶质细胞表面却未检测到TLR4表达的结果相一致, 提示非病原原性蛋白分子也可引TLR系统的反应。 根据TLR4的MyD88依赖性信号通路12, TLR4激活导致衔接分子Mal和MyD88通过TIRTIR结构域相互作用募集到受体, 接下来IRAK4和MyD88相互作用, 导致IRAK1的连接和磷酸化。磷酸化的IRAK1从复合体上分离下来结合TRAF6, 后者反过来又激活泛素依赖通路中的TAK1, TAK1再激活IKK复合体和MAPK通路, 最终分别激活NFB和AP111, 使NFB游离并移位到细胞核中, 结合到靶向的DNA, 促使TNF及IL1、6、8、12等多种炎症因子基因转录。Toll样受体相关的干扰素活化子(TRIF接头蛋白, 也称为TICAM1, 包含TIR结构域的接头分子)负责MyD88非依赖型途径。TRIF可以直接结合TRAF6, 使TAK1以一种不依赖于IRAKs的方式活化, 然后导致IKK复合体的活化; TRIF也可先结合到受体相互作用蛋白1(RIP1), 然后结合TRAF6导致IKK复合体的活化; TRIF还可以和TANK结合激酶1(TBK1)/IB激酶(IKK)相互作用, 使干扰素调节因子3(IRF3)活化, 并转移到细胞核, 结合到它的靶向基因, 最终产生干扰素。本实验结果显示, LPS刺激导致TNF分泌显著增加, 但IFN分泌没有明显增加, 表明MyD88依赖性通路可能被激活, 与文献报道一致; 但IgG作用下小胶质细胞也表达TLR4, 随IgG浓度增加TNF分泌也显著增加, 而IFN测不出, 提示IgG 刺激倾向于激活MyD88依赖性信号通路。 与LPS刺激不同的是, IgG作用后小胶质细胞形态改变明显（细胞增大, 大量伪足出现）, 可能是因为小胶质细胞的吞噬作用所引起, 不排除IgG Fc受体的作用; 另外, 产生TNF、IFN水平也有差别, 提示TLR4或许并非参与该反应的唯一受体; 或者IgG激活TLR4的具体方式与LPS有差别。这些推论有待进一步研究。 总之, 本研究结果显示, 体外培养条件下, 同种IgG刺激可使小胶质细胞大量表达TLR4, 并在刺激浓度高时导致炎性细胞因子TNF而不是IFN的分泌。该结果初步提示, 小胶质细胞可以通过TLR4的活化对IgG产生反应, 并以剂量依赖方式激活MyD88依赖途径产生炎性因子。该途径可能参与CNS适应性免疫应答的启动。【参考文献】 1梁泉, 薛承锐. Toll 样受体4 的研究进展J. 天津医科大学学报, 2006, 12(1): 150-153.2韩黎, 记蕾, 孟玉芬, 等. 病原真菌感染与Toll样受体J. 微生物学报, 2006, 33(4): 851-855. 3Chakravarty S, Herkenham M. Tolllike receptor 4 on nonhematopoietic cells sustains CNS inflammation during endotoxemia, independent of systemic cytoinesJ. J Neuroscience, 2005, 25(7): 1788-1796.4Bsibsi M, Ravid R, Gveric D, et al. Links Broad expression of Tolllike receptors in the human central nervous systemJ. Neuropathol Exp Neurol, 2002, 61 (11) : 1013-1021.5Aravalli RN, Peterson PK, Lokensqard JR. Tolllike receptors in defense and damage of the central nervous systemJ. J Neuroimmune Pharmacol, 2007, 2(4): 297-312.6Yoshimi K, Woo M, Son Y, et al. IgGimmunostaining in the intace rabbit brain: variable but significant staining of hippocampal and cerebellar neurons with antiIgGJ. Brain Research, 2002, 956(1): 53-66.7Kuang F, Wang BR, Zhang P, et al. Extravasation of Bloodbrin barrier during adrenalineinduced transient hypert