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破膜剂 试剂手册BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒手册（目录号554714）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop含有莫能菌素的蛋白质转运抑制剂）（目录号554715）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（含布雷菲德菌素A的BDGolgiPlug蛋白质转运抑制剂）（目录号555028）Ficoll是Amersham Biosciences AB的注册商标。 Hypaque是Amersham Health AS的注册商标。 BD流式细胞仪是1流激光产品。 仅供研究使用。 不用于诊断或治疗程序。 2016年Becton，Dickinson和公司。 版权所有。 本出版物的任何部分不得以电子，机械，磁性，光学，化学，手册或其他方式以任何形式或通过任何方式复制，传播，转录，存储在检索系统中或翻译成任何语言或计算机语言， 未经BD Biosciences事先书面许可。 购买不包括或携带任何权利转售或转让本产品作为独立产品或另一产品的组成部分。 未经Becton，Dickinson和Company明确书面许可，严禁使用本产品以外的许可使用。2016BD，BD徽标和所有其他商标均为Becton，Dickinson和Company的产权。目录BD Cytofix / Cytoperm固定/渗透试剂盒BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiPlug蛋白质运输抑制剂）警告和注意事项1. 一般程序 A.刺激细胞1.使用BD GolgiStop的程序 蛋白质转运抑制剂（含有莫能菌素）2。 使用BD GolgiPlug 蛋白质转运抑制剂的程序（含布雷菲德菌素A）B.方案：细胞表面抗原和细胞内细胞因子的多色染色1收集细胞2.阻止Fc受体3.细胞表面抗原染色4.固定和渗透细胞5.备选固定和渗透方案6细胞内细胞因子染色C.流式细胞分析。D. 染色控制1. 阳性染色控制2. 阴性染色控制 a. 同种型对照b.配体阻断控制。c. 未标记的抗体阻断控制。解决方案样品数据备选方案全血活化和细胞内染色。预期结果解决方案参考文献 BD Biosciences提供三个试剂盒，以简化细胞的固定和透化，用于细胞质内细胞因子的免疫荧光染色。 BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒提供固定/透化溶液和渗透/洗涤溶液。 BD Cytofix / Cytoperm Plus Fixation / Permeabilization Kit（含有BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）提供了这两种溶液加上含有莫能菌素的蛋白质转运抑制剂，用于处理新鲜移植或培养的细胞，以促进胞质内细胞因子的积累。 BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（含有BD GolgiPlug蛋白质转运抑制剂）提供了两种溶液，另外还有一种含有布非司定A的蛋白质转运抑制剂。这些试剂盒提供足够的两种染色200个细胞样品的溶液。BD Cytofix / Cytoperm 固定/渗透试剂盒（目录号554714）该试剂盒能够使细胞固定和透化，其是用荧光染料共轭荧光标记的抗细胞因子抗体染色细胞内细胞因子所必需的。 该试剂盒提供两种试剂，固定/渗透溶液和BD Perm / Wash 缓冲液。 细胞固定和透化后，用BD Perm / Wash 缓冲液洗涤细胞并稀释抗细胞因子抗体进行染色。注意：用BD Perm / Wash 缓冲液稀释抗细胞因子抗体很重要，而不是用标准染色缓冲液，以保持细胞内染色的细胞处于透化状态。试剂盒成分： 固定/渗透溶液（125mL） BD Perm / Wash 缓冲液，10X浓缩物含有胎牛血清（FBS）*和皂角苷（使用前在蒸馏水中稀释1:10）（100mL）注1：虽然固定/渗透溶液和BD Perm / Wash 缓冲液含有防止污染的成分，建议使用无菌移液器除去溶液，使用后立即关闭瓶子。注2：BD Perm / Wash 缓冲液作为包含FBS *的10 *储备溶液。 该产品的颜色可能因批次而异，并且可能含有可见的沉淀物。 颜色变化和/或沉淀物不影响产品性能。 BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂）（目录号554715）除了固定/渗透溶液和BD Perm / Wash BD Cytofix / Cytoperm中包含的缓冲液固定/渗透试剂盒，BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒提供含有莫能菌素的BD GolgiStop蛋白转运抑制剂。BD GolgiStop离体添加到体外或体内刺激的细胞阻断其细胞内转运过程。这导致大多数细胞因子蛋白在高尔基复合体中的积累，从而增强细胞因子染色信号（见图2-4）。BD GolgiStop试剂，至少能处理1升细胞密度高达210 6个细胞/ mL的培养细胞。试剂盒成分：固定/渗透溶液（125 mL）BD Perm / Wash缓冲液，10 X浓缩液含有FBS *和皂角苷（使用前在蒸馏水中稀释1:10）（100mL）BD GolgiStop蛋白转运抑制剂含有莫能菌素（也作为单独组分出售;目录号554724）（0.7mL）注意：BD Perm / Wash缓冲液是包含FBS的10 X储备溶液。该产品的颜色可能因批次而异，并且可能含有可见的沉淀物。颜色变化和/或沉淀物不影响产品性能。 *所有血清蛋白的来源均来自美国农业部检查的位于美国的屠宰场BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/渗透试剂盒（BD GolgiPlug蛋白质转运抑制剂）（目录号555028）除了固定/渗透溶液和BD Perm / Wash BD Cytofix / Cytoperm中包含的缓冲液固定/渗透试剂盒，该试剂盒提供了另一种蛋白质转运抑制剂BD GolgiPlug，含有brefeldin A.参见图2-4。BD GolgiPlug试剂，至少能处理1升细胞密度高达210 6个细胞/ mL的培养细胞。试剂盒成分：固定/渗透溶液（125 mL）1.BD Perm / Wash缓冲液，10 X浓缩物含有FBS *和皂苷（稀释1:10在蒸馏水中使用前）（100mL）2. BD GolgiPlug蛋白质运输抑制剂含有布雷菲德菌素A（也作为单独成分出售;目录号555029）（1mL）注意：BD Perm / Wash缓冲液是含FBS *的10 *储备溶液。该产品的颜色可能因批次而异，并且可能含有可见的沉淀物。颜色变化和/或沉淀物不影响产品性能。 警告和注意事项1. 危险BD Cytofix / CytopermTM缓冲液（固定和渗透溶液;组分51-2090KZ）含有4.2甲醛（w / w）。危险说明吸入有害。造成皮肤刺激。造成严重的眼睛损伤。可能导致皮肤过敏反应。怀疑造成遗传缺陷。可能导致癌症。接触途径：吸入。可能引起呼吸道刺激。防范说明穿防护服/眼睛防护。戴防护手套。不要吸入雾/蒸气/喷雾。如进入眼睛：用水小心冲洗数分钟。去除隐形眼镜，如果存在并且容易做到。继续冲洗皮肤刺激或皮疹发生：求医/咨询。2. Danger BD GolgiStopTM蛋白质转运抑制剂（组分51-2092KZ）含有99.61乙醇（w / w）和0.26莫能菌素，mononatriumsalz（w / w）。危险性说明高度易燃的液体和蒸气。造成严重眼刺激。防范说明：远离热源/火花/明火/热表面。禁止抽烟。戴防护手套/防护眼睛。穿防护服。如果在皮肤（或头发）上：立即脱掉所有受污染的衣服。用水淋浴冲洗皮肤。如进入眼睛：用水小心冲洗数分钟。去除隐形眼镜，如果存在并且容易做到。继续冲洗按照地方/地区/国家/国际规定处置内装物/容器。 一般程序A. 细胞刺激已经报道了用于刺激产生细胞因子的细胞的各种体外方法.1-6多克隆激活剂可用于诱导和表征细胞因子产生细胞。这些包括以下内容：佛波酯和钙离子载体或离子霉素，植物血凝素，葡萄球菌肠毒素B和针对TCR / CD3复合物亚单位的单克隆抗体（有或没有针对共刺激受体如CD28的抗体）。注意：据报道，单独使用PMA的细胞活化导致小鼠T细胞表面的CD4的表达瞬时丧失。据报道，用PMA和钙离子载体一起活化细胞引起CD4表达的更大和持续的降低，（Cell activation with PMA and calcium ionophore together has been reported to cause a greater and more sustained decrease in CD4 expression）以及小鼠胸腺细胞和小鼠和人外周T淋巴细胞中CD8表达的降低.1. 使用BD GolgiStop蛋白质运输抑制剂（含有莫能菌素）的程序。每6 mL细胞加入4ulBD BD GolgiStop并彻底混匀。建议BD GolgiStop不要在细胞培养中保持超过12小时。注意：建议进行动力学研究测定每个实验系统的最佳孵育时间。2. 使用BD GolgiPlug蛋白质转运抑制剂（含布雷菲德菌素A）的程序BD GolgiPlug含有在4下为固体的DMSO。使用前请务必在室温下解冻。每1 mL细胞培养物加入1uL BD GolgiPlug，并彻底混匀。建议BD GolgiPlug不要在细胞培养中保持超过12小时。注意：建议进行动力学研究以测定每个实验系统的最佳孵育时间。B. 方案：细胞表面抗原和细胞内细胞因子的多色染色1. 收细胞活细胞群体可以从体内刺激的组织或用蛋白质转运抑制剂处理的体外刺激培养物制备。细胞应该从含有BD GolgiStop或BD GolgiPlug的培养基中脱出来，然后重新悬浮在染色培养基中，计数并转移到塑料管或微孔板中进行免疫荧光染色。在染色和存储过程中细胞应避光保护。2. 嵌合Fc受体阻断Fc受体的试剂可用于减少非特异性免疫荧光染色a. 在小鼠系统中，对于FcII/ III受体（BD Fc Block？;目录号553142）特异的纯化的2.4G2抗体可用于阻断由Fc受体介导的荧光染料共轭荧光标记的抗体的非特异性染色。用Fc Block阻断小鼠Fc受体，在100l染色缓冲液中用1gBD Fc Block / 106细胞预培养细胞悬液，在4下15分钟。然后可以将细胞洗涤并用特异于感兴趣的细胞表面抗原的荧光染料共轭荧光标记的抗体染色，该抗体应该在染色缓冲液中适当稀释。b. 可以将来自相同物种的10正常人血清或过量的不相关纯化Ig的细胞和用同型作为免疫荧光染色的抗体来预先阻断人细胞上的Fc受体。3.细胞表面抗原染色a.在50L染色缓冲液中用适量的针对细胞表面抗原如CD3，CD4，CD8，CD14或CD19（30分钟，4）特异性的荧光染料共轭荧光标记的的单克隆抗体。 注意：此时可以进行不同细胞表面抗原的多色染色，适当调节补偿最亮荧光信号。识别细胞表面标记的一些抗体可能不结合固定/变性抗原.因此，建议染色细胞表面抗原时细胞是活的，未固定的细胞进行固定/透化和染色细胞内细胞因子。改变细胞在染色细胞表面抗原之前固定的程序需要经验地鉴定合适的抗体克隆。 b.用染色缓冲液（例如，250L/微孔板洗涤，每管用1mL洗涤）洗涤细胞2次，并通过离心（250 * g）沉淀。4.固化和渗透细胞a.彻底重悬细胞，每孔（或250L管）加入100L固定/渗透溶液，4下，20分钟。 注意：在添加固定/渗透溶液之前可以通过涡旋来避免细胞聚集。b.在1X BD Perm / Wash缓冲液中洗涤细胞两次（例如，用于在管中染色的1mL /孔洗涤缓冲液和微孔板中染色的洗涤终体积250L）和沉淀。注意：在洗涤过程中，必须保持BD Perm / Wash缓冲液中，以保持细胞透化。5.备选固定和渗透方案 1. 为后续细胞内染色，固定和储存细胞。 a.细胞的固定和储存 1.在4下用4多聚甲醛溶液重悬100L细胞，10-20分钟（或1mL / 107细胞进行本体固定）。 2.在染色缓冲液中洗涤细胞2次。 3.将细胞悬浮在染色缓冲液中，在4下可储存细胞72小时；或在90FCS / 10DMSO中储存细胞，在-80下储存更长时间。 b.渗透固定细胞 1.对于冷冻细胞，洗2 次除去DMSO。对于4的细胞，沉淀并除去染色缓冲液。 2.在BD Perm / Wash缓冲液中重悬细胞15分钟。 3.通过离心沉淀。 4.细胞内细胞因子染色。6. 细胞内细胞因子染色 a.在50含有预定的最佳浓度的荧光染料共轭荧光标记的抗细胞因子抗体或适当的阴性对照的LBD Perm / Wash缓冲液中彻底重悬固/透化细胞。在黑暗中4孵育30分钟。b.用1X BD Perm / Wash缓冲液洗涤细胞2次（每次用1mL洗涤染色管子和在微孔板中每孔终体积250L），并在流式细胞术分析前重悬于染色缓冲液中。C.流式细胞分析用细胞表面染色做对照，设置PMT电压和补偿。基于同型或阻断对照和未染色细胞设置象限标记。注意：来源于人PBMC的活化的细胞因子产生细胞的频率可以针对取决于供体的特定细胞因子而广泛变化。来自一个供体的冷冻保存细胞可用于纵向研究。 对于正确的流式细胞分析，通过该方法染色的细胞应通过光学显微镜和/或流光散射图检查，以确认其分散良好。为了群体频率测量有统计学意义，在流式细胞术分析过程中应该获得足够大的样本量。可以在数据再分析时产生双变量点图或概率轮廓图，以显示各个细胞的细胞表面抗原和细胞内细胞因子蛋白质的共表达水平的频率和模式。D.染色控制1. 阳性染色控制 BD Biosciences荧光染料共轭标记的抗细胞因子抗体的技术数据表提供了体外培养系统的具体实例，可检测在特定时间点诱导细胞产生细胞因子的频率。通过这些方法刺激的细胞可用作实验系统的阳性对照。细胞活化方案的特别重要的参数包括蛋白质转运抑制剂的使用和多个时间点的检查。免疫组织化学染色的发表报告和ELISPOT分析也可以提供关于产生细胞因子的细胞的不同实验方案的有用信息。2. 阴性染色控制 建议使用以下三种对照中的至少一种来区别特异性染色与人工染色。未染色细胞和同种型对照或阻断控制的组合是最佳的。科研人员可以选择最适合其研究需要的染色控制。细胞内细胞因子染色技术和阻断对照的使用由C.Prussin和D.Metcalf.6详细描述。a.同型对照用匹配的没有相关特异性的同型对照染色。1.将细胞沉淀重悬于50L含有与抗细胞因子抗体相当的同种型对照抗体浓度的BD Perm / Wash缓冲液2.在4下孵育30分钟。3.使用上述程序洗涤细胞进行细胞内染色。b.配体阻断控制用重组细胞因子预阻断抗细胞因子抗体。1.用至少50L 4的BD Perm / Wash缓冲液将含有细胞因子的荧光染料标记的抗体稀释至适当浓度，30分钟。2.在50l预封闭标记的抗细胞因子抗体中重悬固定/透化细胞（在BD Perm / Wash缓冲液中），并在4下孵育30分钟。3.使用上述程序洗涤细胞进行细胞内染色。C.未标记的抗体阻断对照用未标记的抗体预孵育细胞。1.BD Perm / Wash缓冲液含有未标记的抗细胞因子抗体，在25L该液中固定/透化细胞，稀释至适当的浓度，并在4下孵育30分钟。2.孵育后，在25L BD Perm / Wash缓冲液中以最优浓度添加荧光染料标记的抗细胞因子抗体，（最终体积50L），并在4温育30分钟。3.使用上述程序洗涤细胞进行细胞内染色。方案：染色缓冲液不含Mg2 +或Ca2 +的Dulbeccos PBS（DPBS）1热灭活FCS0.09（w / v）叠氮化钠将缓冲液pH调至7.4-7.6，过滤（0.2微米孔隙膜），并在4下储存样品数据图1. BD Cytofix / Cytoperm溶液对细胞光散射特性、细胞表面抗原染色和细胞内细胞因子染色的影响。图A和B分别显示新鲜未经处理的小鼠脾细胞和Ficoll分离的人外周血单核细胞的向前光散射和侧光散射图。图C和D显示了用固定/渗透溶液处理后的相同细胞（在图A和B中）的向前光散射和侧光散射图。图E和F分别是用抗CD4和抗CD8染色的小鼠和人细胞的实例，随后用固定/渗透溶液孵育。图G和H分别是在BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂的存在下在培养物中被激活的小鼠和人细胞的实例。用PE-anti-CD4或PE-Cy5anti-CD3染色，然后用固定/渗透溶液孵育。然后用于细胞内IL-2（小鼠）和IFN-（人）染色。图2.蛋白质转运抑制剂对细胞内细胞因子染色信号的影响。在有（右图）或没有（左图）2M莫能菌素（又名BDGolgiStop蛋白运输抑制剂）的情况下，用PMA（50ng / mL）和钙离子载体A23187（250ng / mL）刺激PMBC 6小时。收集细胞，用PE-Cy5抗人CD3（目录号555334）染色，固定，透化，随后用PE抗人IL-2（目录号554566;顶图），PE抗 - 人类TNF（目录号554513;中图）或FITC抗人IFN-（目录号554551;底图）。图3. 比较BD GolgiPlug和BD GolgiStop对活化的小鼠脾细胞内细胞因子积累的影响。通过给该小鼠细胞内细胞因子染色来评估IL-2和TNF的产生，在有蛋白质运输抑制剂BD GolgiPlug或BD GolgiStop条件下，用固定的抗CD3（25g/ ml）+可溶性抗CD28（2g/ ml）活化该小鼠脾细胞4小时，在这种情况下，BD GolgiPlug和BD GolgiStop在诱导IL-2和TNF积累方面相当有效。图4. 比较BD GolgiPlug和BD GolgiStop对再活化的纯化小鼠CD4 +细胞对细胞内细胞因子积累的影响。在BD GolgiPlug或BD GolgiStop存在下，将活化的小鼠CD4 +细胞用PMA（10ng / mL）加离子霉素（250ng / mL）再刺激5小时，并对所列细胞内细胞因子染色。在这种情况下，BD GolgiPlug更有效地诱导TNF积聚，而BD GolgiStop更有效地诱导IL-4和IL-10的积累。Ficol-hypaque分离液纯化人类PBMC vs 全血图5.相同供体中，活化的PBMC或活化的全血染色时，可检测到产生细胞因子的细胞频率是相当的将来自三个供体中每一个纯化的人PBMC（左图）和全血（右图），在2M BD GolgiStop的存在下，用PMA（50ng / mL）和离子载体A23187（1g/ mL）活化5小时，固定，透化并用PE-抗人IL-4（目录号554485; 0.06g）和FITC-抗人IFN-（目录号554700;0.25g）染色，根据BD Biosciences细胞内细胞因子染色方案（标准或全血法）。备选方案激活和全血细胞内染色1.用IMDM稀释全血1：1。混合好2.将细胞活化剂或丝裂原加入稀释的血液（例如，50ng / mL PMA Sigma，目录号P-8139 +1g/ mL钙离子载体A23187 Sigma，Cat.No.C-7522或PMA +1M离子霉素Sigma，目录号I-0634 - 终浓度）。3. 添加蛋白质转运抑制剂：BD GolgiPlug 蛋白质转运抑制剂（目录号555029）1L溶液/ 1mL稀释血液（又名布雷菲德菌素A，1.0g/ mL终浓度）或BD GolgiStop蛋白质转运抑制剂（目录号554724）0.7L溶液/ 1mL稀释血液（又名莫能菌素，2.0M终浓度）。涡旋混合。等分成12 X75 mm塑料管，200L /管。在37的5CO 2中孵育4-6小时。必须研究最佳孵育时间，孵育时间不应超过24小时。5.加2 mL 1 X BD PharmLyse （目录号555899），涡旋，在室温下在黑暗中孵育10分钟。6.旋转5分钟，500 X g。7.吸出上清。用染色缓冲液洗1 X。以500 g旋转5分钟。吸出上清。8.在100L染色缓冲液中重悬细胞沉淀，该缓冲液中含有最佳浓度的细胞表面抗原特异性的荧光染料共轭标记抗体（如FITC-，PE-，PE-Cy5-抗CD3，CD4，CD8，CD14等）的。在黑暗中室温孵育15分钟。在染色缓冲液中洗1 X。旋转5分钟，500 g。吸出上清。9.加500L固定/渗透溶液固定和渗透细胞。在黑暗中和在室温条件下涡旋和孵育20分钟。旋转5分钟，500 g。吸出上清。10.加入2 mL BD Perm / Wash缓冲液洗涤细胞。在黑暗中和在室温条件下孵育10分钟。旋转5分钟，500g。吸出上清。11.在100L BD Perm / Wash缓冲液中重悬细胞沉淀，该缓冲液中含有最佳浓度的荧光染共轭标记的抗细胞因子抗体，该抗体用于细胞内染色，（例如0.25g/试验）。请参阅技术数据表，了解抗体特异性推荐浓度。在黑暗中和室温下染色30分钟。12.加2 mL BD Perm / Wash缓冲液洗涤细胞。旋转5分钟，500g。吸出上清13.将细胞沉淀重悬于500L PBS / 2多聚甲醛溶液（涡旋，同时加入PBS / PFA）。14.流式细胞仪分析。预期结果 用PMA /离子霉素激活正常人血液 5小时，通常可检测到产生的IL-2，IL-4，IFN-和TNF表达细胞的频率（淋巴细胞门）。 用LPS激活正常人血液6小时，通常可检测到产生IL-1，IL-6，IL-8和MIP-1表达细胞的频率（单核细胞门）。注意：不同供体之间典型的细胞因子 - 生产细胞频率有差异。解决方案染色缓冲液不含Mg2 +或Ca2 +的Dulbeccos PBS（DPBS）1热灭活FCS0.09（w / v）叠氮化钠调缓冲液pH至7.4-7.6，过滤（0.2微米孔隙膜），并在4下储存IMDM（BioWhittaker-目录号12-726Q）是有利于维持培养中全血细胞活力的细胞培养基。 参考文献 1.Assenmacher，M.，J. Schmitz和A. Radbruch。 1994.流式细胞术测定活化的鼠T辅助淋巴细胞中的细胞因子：干扰素-和白细胞介素-4表达细胞中白细胞介素-10的表达。欧元。 J.Immunol。 24：1097年至1101年。2. Elson，L.H.，T.B.Hampman，D.D.Metcalfe和C.Prussin。细胞因子产生的流式细胞术分析鉴定人CD4 + CD27-淋巴细胞亚群内的Th1，Th2和Th0细胞。 J.Immunol。 154：4294-4301。3. Sander，B.，J. Andersson和U. Andersson。 1991.通过免疫荧光和多聚甲醛皂苷程序评估细胞因子。免疫。 Rev. 119：65-93。4. Vikingson，A.，K. Pederson和D. Muller。 1994.通过流式细胞术计数产生IFN-的淋巴细胞，并与IFN-的定量测量相关。 J.Immunol。冰毒。 173：219-228。5. Jung，T.