《植物的人工繁殖》PPT课件.ppt

第2讲 植物的人工繁殖,上节课回顾 两个思考题 1.什么是细胞工程？ 2.细胞工程包含哪几个主要研究内容,例子1：兰花组织培养,名贵兰花达摩兰：以 禅宗“一花开五叶，结果 自然成”的诗意命名。 在台湾，早期达摩兰量少， 求种者多，非常昂贵；有 人曾以一盆爪艺达摩交换 台中市一栋高楼。 兰花是第一个组织培养成 功产业化的植物。珍稀而 名贵的达摩兰等名贵兰花， 如今已成市井之花。一株 不过百元。,例子2：土豆：“第二面包“，“植物之王”，热量低于谷 类粮食，是理想的减肥食物，和玉米、小麦、水稻、 燕麦被称为世界五大粮食作物。 欣赏一个视频：脱毒植物的培育 /u52/v_Mjk5Mzg5NjE.html 问题： 1.传统途径存在的问题？为什么要采用组织培养？ 2.什么是组织培养？原理是什么？ 3.优点与应用有哪些？,本节主要内容 1。组织培养再生植物 2。人工种子 本节重要问题 1。细胞全能性、细胞分化与脱分化 2。激素在细胞分化中的调节作用 3。植物经组织培养的再生途径,一理论知识回顾 生殖、细胞全能性、细胞分化、脱分化,1.有性生殖（Sexual reproduction）：是两个配 子融合为一，成为合子或受精卵，再发育成为新 一代个体的生殖方式。 2.无性生殖（Asexual reproduction）：不涉及性 别、没有配子参与、没有受精过程的生殖都属于 无性生殖（Asexual reproduction）。许多高等 植物的营养器官（例如根、茎、叶等），在脱离 母体后能发育成完整的植株，这种繁殖方式也称 为营养生殖。, 3.细胞全能性(totipotency)：是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。 细胞全能性学说：1902年，德国植物学家哈伯兰德 (Haberlandt)提出了细胞全能性学说，预言植物细胞具有全 能性。 植物细胞全能性：细胞全能性首先在植物中被证实，1958年 ，史都华德（Steward）等利用胡萝卜根韧皮部组织培养出 了完整的新植株，证明高度分化的植物营养组织仍保持着发 育成完整植株的能力，能以无性繁殖方式繁殖后代。 动物细胞全能性：动物细胞核移植实验证明，胚胎细胞及高 度分化的体细胞具有全能性。1997年克隆羊多莉的诞生为揭 示动物细胞全能性做出了重大贡献。, 4.细胞分化（Differentiation）：是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。 时间上的分化：是指一个细胞在不同的发育阶段可以形成 不同的形态和功能； 空间上的分化：是指同一种细胞由于所处的环境或部位不 同可以形成不同的形态和功能。细胞分化能力的强弱称为 发育潜能。 形态发生（Morphogenesis）：是指通过细胞增殖、分化和 行为塑造组织、器官和个体形态的过程。细胞分化与形态 发生是相互联系在一起的。 细胞分化的实质：是基因的差异表达（Differential expression），是奢侈基因按照一定顺序表达的结果。, 奢侈基因（Luxury gene）：又称组织特异性基 因（Tissue-specific gene），是在各种组织中进 行不同的选择性表达的基因，与各类细胞的特殊 性有直接关系。 持家基因（House-keeping gene）：是维持细胞 的基本结构和最低限度功能所不可少的基因，例 如：编码组蛋白、核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖 酵解酶等基因。这类基因在所有类型的细胞中都 表达。, 5.脱分化（Dedifferentiation）：又称去分 化，是指分化细胞失去特有的结构和功能 变为具有未分化细胞特性的过程，即分化 的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重 新获得分裂能力的过程。 脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生 无组织结构、无明显极性的松散的细胞团 ，称之为愈伤组织（Callus）。 需要采用人工诱导技术诱导体细胞的脱分 化。不同生物的细胞脱分化能力不同，决 定了组织培养再生的难易。,植物人工繁殖技术 目地：为克服自然有性生殖的不足，满足对优 良植物的大量需求 手段：通过无性繁殖技术实现植物快速繁殖。,植物人工繁殖的方法： 组织培养、人工种子、胚胎培养等,一、植物组织培养再生植物 植物组织培养（Plant tissue culture）是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。,思考题： 为什么植物组织培养能实现植物大规模繁殖？与传统繁殖途径的优点在哪里？,（一）植物组织培养的优点, 1.周期短，便于人工控制培养条 件。繁殖速度快，经济效益高。 2.占用空间小，不受地区、季节 限制。 3.繁殖珍稀、濒危苗木和突变体 ，是优良品种培育的有效途径。 4.利于保持原来品种的特性。,（二）植物组织培养的应用 1.无性系快速繁殖：例如一株兰花一年可以繁殖到400万株。 2.种苗脱毒：可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等。 3.新品种选育 （1） 利用培养变异，筛选优良 突变体。 植物离体培养，能够明显提高突变率，并且会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、植株形态、生育期、耐性等等。可以从中选择优良突变体，培育新品种。 （2）利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性。 有些植物远缘杂交，能正常受精，但受精胚往往败育。此种情况下，可以将幼胚在败育前进行离体培养，以获得缘远杂种植株。 （3）利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。 野生种往往有许多优良性状，如抗干旱、抗病虫害、耐涝、耐瘠薄、耐盐碱、抗冻等特性。但大部分野生种与栽培种杂交不亲和，严重影响了野生种优良遗传基因的应用。利用细胞融合，可以克服这种杂交不亲和性，获得体细胞杂种，使野生种的利用成为可能。 （4）倍性育种,4.离体种质保存 随着地球不断开发、生态环境破坏，种植资源日趋枯竭，大量有用基因损失。利用组织培养法，低温保存（-196）或试管保存，为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望。 5.在遗传、生理生化和病理等研究上的应用。如光合作用、植物营养问题、植物抗病性等等。,（三）植物组织培养技术,1.生物条件 外植体（Explant）主要指用于离体培养的植物或组织切段。 因素： 不同植物品种 同一品种不同取材部位、发育阶段。 一般：生长点、幼嫩组织,2.物理条件：培养环境、 组织培养室 无菌环境，人工控制温度、 光照、湿度等培养条件。 需要一定的设备、器材和 用具。, 3.化学条件：培养基 （1）无机盐 培养基中无机盐的浓度通常在25mmol/L左右。 根据添加量多少分为大量元素（浓度大于0.5mmol/L）和微量元素(浓度低于0.5mmol/L)。 大量元素：主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁。氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核酸和酶的主要成分。 微量元素：主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼等。这些微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要，并参与生物过程的调节,（2）有机物,常用的有机物：糖类、氨基酸、维生素、醇类等。 糖类：是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为碳源，又可以维持渗透压。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%3%。 氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。, 维生素：以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上不足，通常需加入一至数种维生素。常用的维生素包括：盐酸硫胺素（Thiamine,VB1）、盐酸吡哆醇Pyridoxin,VB6）、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长。Vc有防止组织变褐的作用。 肌醇：对糖类的相互转化有促进作用。能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。 腺嘌呤：是合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌呤能促进细胞合成分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成。,植物激素(Phytohormone)：是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。能影响生长和分化。 在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，主要由激素控制。 植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后，影响DNA、RNA和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能。,生长素(auxin),生长素是由色氨酸通过一系列中间产物形成的。 在植物组织培养中，生长素主要用来刺激细胞分 裂和诱导根的分化。 常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。 IAA活力较弱。NAA起动能力要比IAA高出3-4倍。IBA是促进发根能力较强的生长调节物质。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 2，4-D起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成。,细胞分裂素（Cytokinin）, 细胞分裂素大多是嘌呤族衍生物，自然状态下分裂素主要在根中形成，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成分裂素。 分裂素的生理作用主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大。多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。 主要有激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-苄基腺嘌呤。,激素配比,（4）培养基及分类,几种常用的培养基,培养基的配制,培养基母液的配制 大量元素母液：即是含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量较高，一般配制成10倍浓度的母液。 在使用时，每配制成1000mL培养液，吸取100mL母液。在配制母液时，要先将各个组分单独溶解，然后按照一定的顺序一边搅拌，一边混合，特别要注意将钙离子（Ca+）与硫酸根、磷酸根离子错开，以免生成硫酸钙或磷酸钙沉淀。 微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量低， 一般配制成100倍浓度的母液。在使用时，每配制1000mL培养液，吸取10mL母液。,铁盐母液：由于铁离子与其他无机元素混在一起放置时，容易生成沉淀，所以铁盐必须单独配制成铁盐母液。铁盐一般采用螯合铁（Fe-EDTA）。通常配制成100倍（或者200倍）浓度的铁盐母液，在使用时，每配制1000mL培养液，吸取10mL（或者5mL）铁盐母液。 维生素母液：是各种维生素和某些氨基酸的混合液。一般配制成100倍浓度的母液。在使用时， 每配制1000mL培养液，吸取10mL母液。,植物激素母液：各种植物激素单独配制成母液。一般浓度为100mg/L 。使用时根据需要取用。由于大多数植物激素难溶于水，需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中，再加水定容到一定的浓度。它们的配制方法如下： 2,4-D (2,4-二氯苯氧乙酸)母液：称取2,4-D 10mg， 加入2mL 95%乙醇，稍加热使之完全溶解，（或者用2mL 1mol/L的NaOH溶解后）加蒸馏水定容至100mL。 IAA（吲哚乙酸）母液：称取IAA 10mg，溶于2mL 95%乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL。 IBA（吲哚丁酸），GA（赤霉酸）母液的配制方法与此相同。 NAA（萘乙酸）母液：称取NAA 10mg ，用2mL 热水溶解后，定容至100mL。 KT（激动素）母液：称取KT 10mg， 溶于2mL 1mol/L 的 HCl中，用蒸馏水定容至100mL。BA（苄基腺嘌呤）母液的配制方法与此相同。 玉米素母液：称取玉米素10mg， 溶于2mL 95%的乙醇中，再加热水定容至100mL。,4、植物组织培养的基本步骤 （1）培养材料的采集 植物具有全能性的细胞：受精卵；发育中的分生组织细胞；雌雄配子及单倍体细胞。 用哪一部分器官最适于作为组培的材料来源:器官的生理状态和年龄；取材季节、离体材料的大小、取得离体材料的植株质量等。 快速繁殖：常用茎尖（长度0.5cm）； 脱毒苗：茎尖分生组织（长度小于0.1mm）；,（2）培养材料的消毒 先将材料用自来水洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。 在无菌环境中将材料放入70%的酒精中浸泡30-60s。 再将材料移入漂白粉饱和液或0.1%升汞中消毒。 无菌水冲洗34次。,常用的消毒剂：,下表列出了目前常用的灭菌消毒剂。其使用浓度和处理时间，应根据外植体的情况及其对灭菌剂的敏感性而定。,（3）制备外植体,接种时外植体的大小和形状取决于实验目的（茎、叶、根、花、果实、种子或其中某种组织切块0.5cm，茎尖、胚、胚乳按组织单位切离） （4）接种和培养 接种 封口 温度和光照 增殖：新梢形成后，继代，把新梢分株或切段转入增殖培养基中进行增殖。,（5）根的诱导,生根是获得完整植株的一个关键。通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植。 促使试管苗生根的方法通常有两种： 1、在固体培养基上诱导生根: 当试管苗长到23厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定） 。 2、浸泡的方法: 将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。,（6）炼苗和移栽 试管苗的生长环境 无菌 异养 弱光 恒温,芦荟的植物组织培养过程,1 2 3 4 5,6 7 8 9,10 11,5、植物组织培养再生植株的途径,以胡萝卜为例,器官发生途径,体细胞胚发生途径,体细胞胚（Somatic embryo）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。 体细胞胚发生途径：是指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。体细胞胚起源于非合子细胞，因此不同于合子胚。,（1）器官外植体直接发生途径,体细胞胚胎发生途径1