[临床医学]03、酶药本、中医和全科11级.ppt

第 三 章 酶 Enzyme,生物化学于分子生物学教研室 2012年09月19日,前 言 Intraduction,一、酶的研究历史,19世纪 60年代 ，L. Pasteur提出发酵是酵母细胞活动结果的“活力论”； 1878年， Khne: 提出“Enzyme”名词，来源希腊文，意为 “在酵母中”； 1897年， E. Bchner成功用酵母提取液实现发酵，获得了1907年的诺贝尔化学奖。,（一）酶的发现发酵机制的探讨：,（二）酶的化学本质一类特殊蛋白质：,（三）酶促动力学的研究,（四）酶概念的突破核酶的发现,（二）酶的化学本质一类特殊蛋白质：,1926年 J. B. Summer：首次从刀豆中提取得到脲酶结晶，并证明其化学本质是蛋白质，1946年的诺贝尔化学奖。,（三）酶促动力学的研究,1982年，Thomas Cech从四膜虫发现 rRNA 的自身催化作用，并提出了核酶（ribozyme）的概念。,（四）酶概念的突破核酶（ribozyme）的发现,四膜虫,二、酶的概念,酶（传统概念）是由活细胞合成的，对其特异底物（substrate）起高效催化作用的蛋白质。,酶与疾病 蚕豆病、白化病 酶与诊断 肝炎（GTP）、心肌病（LDH） 酶与治疗 尿激酶、链激酶、胃蛋白酶,三、酶的重要性,或核糖核酸。,现代概念,本章知识点 框架,想象力比知识更重要， 因为知识是有限的，而想象 力概括着世界的一切，推动着进步，并且是知识进化的源泉。 严格地说，想象力是科学研究中的实在因素。,Albert Einstein,深 刻 启 示,学习思维 善于思维 养成思维的习惯,重 要 理 念,概念清晰 联系前后 分析比较 综合归纳,学 习 方 法,第 一 节 酶的分子结构与功能,（ The Molecular Structure and Function of Enzyme）,一、酶的分子组成（辅助因子） 二、酶的活性中心（催化功能部位） 三、同工酶（功能相同，结构不同一组酶）,主 要 内 容,重要的概念：,一、酶的分子组成 常含有辅助因子,单纯酶（simple enzyme）： 仅由氨基酸残基构成的酶 结合酶（conjugated enzyme): 由蛋白质（酶蛋白）和非蛋白质（辅助因子）两部分组成,（一）结合酶的分子组成,（二）辅助因子,（三）金属酶和金属激活酶,辅助因子组成：,（二）辅助因子,Mo6+ 黄嘌呤氧化酶 Fe3+/Fe2+ 细胞色素酶、过氧化氢酶类、过氧化物类 Cu2+/Cu+ 细胞色素氧化酶、酪氨酸酶 Zn2+ 碳酸酐酶、羧肽酶 Mg2+ 各种激酶类、核酸酶 Mn2+ 精氨酸酶、超氧化物歧化酶 Na+ 质膜 ATP 酶 (也需K+和Mg2+) K+ 丙酮酸激酶 (也需Mg2+和Mn2+ ),金属离子为辅助因子的某些酶,金属离子 酶,金属酶和金属激活酶：,金属离子与酶紧密结合，提取中不易丢失。如：羧肽酶（Zn2+）和黄嘌呤氧化酶（ Mo+6 ）,金属离子是酶活性所必需，但不与酶蛋白直接结合，却通过底物相连接。如：各种激酶和核酸酶（Mg2+）,金属激活酶（metal activated enzyme）,金属酶（metallenzyme）,辅助因子的重要作用：,辅基（prosthetic group） 与酶蛋白结合紧密, 不能被透析（或超滤）方法除去； 辅酶（coenzyme） 与酶蛋白结合疏松, 可以被透析（超滤）方法除去。,辅酶和辅基：,二、酶的活性中心（active center） 是酶分子执行催化功能的部位,指能与底物特异地结合，并将底物转化为产物的特定空间结构区域（三维结构，裂缝，或凹陷）。 辅助因子参与酶活性中心的组成。,（一）概念：,（二）必需基团（essential group）,指多肽链上间接或直接与酶催化活性相关的某些氨基酸残基的功能基团。,（二）必需基团（essential group）,类型：,结合基团（binding group） 催化基团（catalytic group）,活性中心内必需基团,活性中心外必需基团：,结合底物或辅酶使之与酶形成复合物。,影响底物中某些化学键稳定性，催化底物转变成产物。,不参与活性中心组成，但维持其空间构象所必需，作为调节剂结合所必需。,酶的活性中心示意图,一些酶活性中心的氨基酸残基,酶 残基总数 活性中心主要残基 牛胰核糖核酸酶 124 His12、His119、Lys41 溶菌酶 129 Glu35、 Asp52、 Asp101、Trp108 牛胰凝乳蛋白酶 245 His57、Asp102、Ser195 牛胰蛋白酶 238 His46、Asp90、Ser183 木瓜蛋白酶 212 Cys25、His159 弹性蛋白酶 240 His45、Asp93、Ser188 枯草杆菌蛋白酶 275 His46、Ser221 碳酸酐酶 258 His93-Zn-His95 His117,胰凝乳蛋白酶活性中心,195(Ser-羟基),57(His-咪唑基),102(Asp-羧基),溶菌酶的活性中心,溶菌酶的活性中心是一裂隙，可以容纳肽聚糖的6个单糖基（A，B，C，D，E，F），并与之形成氢键和van derwaals力。催化基团是Glu35、Asp52；Asp101和Trp108是结合基团。,三、同工酶（isoenzyme，isozyme） 是催化相同反应，但一级结构不同的一组酶,催化相同化学反应，但酶蛋白分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 由不同基因或等位基因编码的多肽链，或由同一基因转录生成的不同mRNA翻译的不同多肽链组成的酶蛋白。 非翻译后修饰生成的多分子形式。,特点：,同工酶分布，可存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞部位； 同工酶使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征； 同工酶可用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。,意义：,（一）乳酸脱氢酶（LDH）：,（二）肌酸激酶（creating kinase，CK） ：,（二）肌酸激酶（creating kinase，CK） ：,肌酸激酶的结构特点（二聚体）：,第 二 节 酶的工作原理,（ The Mechanism of Enzyme Action ）,一、酶反应特点； 二、酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率。,主 要 内 容,反应前后质和量不变 催化热力学允许的反应 加速可逆反应的进程，不改变反应的平衡点,一般催化剂的特点:,一、酶反应特点,酶反应具有极高的效率 酶反应具有高度的特异性 酶促反应具有的可调节性 酶促反应无副反应 酶促反应的温和条件,酶催化剂的特点:,（一）酶促反应具有极高的效率,酶的催化效率通常比无催化剂反应高 108 1020 倍，比一般催化剂高1071013倍。,酶的催化效率可用酶的转换数表示：,酶的转换数（turnover number）是指在酶被底物饱和的条件下，每个酶分子每秒钟将底物转化为产物的分子数。,部分酶的转换数,一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并产生一定的产物的特性。,（二）酶反应具有高度的特异性 （专一性，specificity）,一种,一种,一定,一类,一定,一定,1、 绝对特异性（absolute specificity）：,作用于一种特定结构的底物，进行专一反应，生成一种特定结构的产物。,绝对特异性、相对特异性、立体异构特异性,作用于一类化合物或一种化学键的不太严格的选择性质。,2、相对特异性（relative specificity）：,如： 蛋白水解酶、脂肪酶和磷酸酯酶等,如： L-乳酸脱氢酶： L-乳酸 L-氨基酸氧化酶： L-氨基酸 延胡索酸酶： 反丁烯二酸 几何异构体,光学异构体,仅作用于底物特定的立体异构体进行反应。,3、立体异构特异性（stereo-specificity）：,1、酶和代谢物的区域化分布 2、多酶体系、多功能酶和同工酶等 3、代谢物对酶活性的抑制和激活 4、酶活性的调节：变构调节、共价修饰和酶 原激活 5、酶含量的调节：诱导、阻遏和降解,（三）酶促反应具有的可调节性,二、酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率 酶催化作用机理,（一）酶比一般催化剂更有效地降低反应活化能,（二）酶-底物复合物的形成有利于底物转变成过渡态,（三）酶的催化机制呈多元催化作用,化学反应速率的依赖因素： 分子间碰撞频率 有效碰撞分子（活化分子）的百分数 活化能与活化分子 活化分子 指在反应瞬间，达到或超过一定能量水平 （即反应能阈），可发生反应的分子。 活化能（activation energy） 活化分子所具有高出 平均水平的能量，或底物分子从初态转变到活化态所需 的能量。 能阈 分子发生化学变化所需的最低能量。,酶促反应高效率的热力学基础,酶促反应活化能的改变,例如：过氧化氢分解反应 2 H2O2 2 H2O + O2 反应所需的活化能 无催化剂 75312 J（18000 cal） 胶态钯 48953 J （11700 cal ） 过氧化氢酶 8368 J （2000 cal ）,（二）酶和底物的结合有利于底物形成过渡态,底物与酶活性部位的结合基团有效结合，转化为过渡态，并释放结合能，以降低活化能是酶发挥催化作用的关键； 底物与酶结合是可逆的、非共价结合，通过多种机制实现其催化功能。,底物与酶结合形成中间产物的特点：,E-S复合物,1、诱导契合作用使酶与底物密切结合 诱导契合假说（induced-fit hypothesis）,指酶与底物接近时，结构相互诱导、变形、适应，继之结合的过程。 酶变构利于与底物结合，底物变形使之处不稳定过渡态，与活性中心结合最吻合，易受酶催化。,羧肽酶的诱导契合模式,Tyr248,Arg145,Glu270,2、 邻近效应与定向排列（ proximity effect & orientation arrange）使诸底物正确定位于酶的活性中心,指酶在反应中将诸底物结合到活性中心，使它们相互接近并形成有利于反应的正确定向关系。,酶,A,B,邻近，又定向,邻近，不定向,底物的“邻近”和 “定向”效应示意图,酶,A,B,不邻近，不定向,酶活性中心多呈疏水“口袋”，使底物分子脱溶剂化（desolvation），排除周围大量水分子对酶与底物分子功能基团间的干扰性吸引和排斥；防止水化膜的形成，利于底物与酶分子的密切接触和结合，这种现象称为表面效应。,3、表面效应（surface effect）使底物分子去溶剂化,表面效应 疏水性“口袋”效应,（三）酶的催化机制呈多元催化作用 （multielement catalysis）,有多种催化机制同时介入，包括：一般酸- 碱催化作用和共价催化作用（亲核催化作用、亲电子作用），共同完成酶促反应，被称为多元催化作用； 酶促反应高效率的重要原因。,1、一般酸- 碱催化作用 （general acid-base catalysis）,酶是两性解离的蛋白质分子，其活性中心有些基团可为质子供体（酸），有些基团可为质子受体（碱），参与质子转移，以提高反应速率（达102105倍）的催化机制。,酶活性中心广义酸碱基团,例如： 溶菌酶的底物为细菌胞壁肽聚糖中的6个单糖基的糖链，其活性中心的催化基团Glu35-COOH（在非极性环境）为质子供体（酸），在反应中质子与中D、E位两个糖基构成糖苷键的O原子结合，使之断裂；并在D位糖基C1形成正碳离子，Asp52-COO- （在极性环境）对此起稳定作用；最终H2O参与糖链断裂，产生缺口，达到溶菌作用。,2、共价催化作用（general acid-base catalysis）,酶活性中心与底物通过瞬间共价键形成中间物，将底物激活加速反应，进一步使之转变生成产物和游离酶的催化机制。 共价催化作用具有亲核、亲电子过程；前者促使形成共价键，后者从反应中心吸收电子。 如：蛋白酶、肽酶、脂酶和一些酰基转移酶等。,1、亲核催化作用： 酶活性中心的一些基团，如羟基、巯基和咪唑基等被称为“亲核基团”，分别带有多电子的原子如O、S和N，可提供电子去攻击底物上相对的亲电子原子（如羰基碳），即所谓的亲核攻击。 如，凝乳蛋白酶：Ser195-OH起亲核催化作用， 2、亲电催化作用： 酶活性中心的亲电基团与富含电子的底物形成共价键，引起的催化反应，是亲电子催化的反过程。,例如： 胰凝乳蛋白酶活性中心催化基团Ser195-OH中的O原子有非配对电子对能发挥亲核作用，在反应中攻击底物肽键中羰基的C，导致肽键的断裂，形成一个不稳定的中间产物酰基化酶，后者易将酰基转移给水完成水解作用 。 在胰凝乳蛋白酶催化反应中，His57-咪唑基接受质子，起“碱”催化作用，故催化机理实为多元催化作用。,酶分子的功能,第 三 节 酶促反应动力学,（Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction）,酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素（包括：底物浓度、酶浓度、温度、 pH、抑制剂、激活剂等）。 酶促反应速率：单位时间内底物减少或产物增加的量，常用初速度来衡量。 初速度（率）：指反应刚开始，各影响因素尚未发挥作用时反应速度，也即反应进程曲线为直线部分反应速度。,概念：,一、底物浓度对反应速率的影响 呈矩形双曲线,零级反应,（一）米曼氏方程式（Michaelis-Menten equation） 揭示单底物反应的动力学特性,1、米-曼氏方程解释：,（二）Km与Vmax是有意义的酶促反应动力学参数,（三）Km值和Vmax值可以通过作图法求取,反应是单底物反应； 测定的反应速度为初速度，产物生成极少，逆反应可忽略； S超过E，S的变化在测定初速度的过程中可不计单底物； 稳态（steady state）。,2、米-曼氏方程成立条件：,3、推导方程（略）,1、Km值为1/2Vmax时的底物浓度。,（二） Km与 Vmax是有意义的酶促反应动力学参数,2、k2k3 时，Km可表示酶对底物的亲和力 大小， 两者成反比关系。,3、 Km值是酶的特征性常数 之一，为10-610-2 mol/L；同底物，不同酶Km值不同；同一酶不同底物， Km值不同。 只与酶结构、底物和反应环境（如：温度、pH、离子强度）有关，与酶浓度无关。,Vmax = K3 ES = K3 Et ,4、 Vmax 是酶完全被底物饱和时（ES=Et）的反应速度，与酶浓度呈正比。,5、 动力学常数 k3 称为酶的转换数 （turnover mumber)：,Vmax = K3 Et K3 =Vmax / Et ,（三）Km值与 Vmax值可以通过作图法求取,-（ 1/Km）,斜率 = Km / Vmax,双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）,例题,Neurospora crassa 的 D-丝氨酸脱氨酶需要 磷酸吡哆醛作为辅酶。催化反应： CH2OH CHNH2 COOH CH3CO COOH + NH3,求丝氨酸脱氨酶对丝氨酸的表观米氏常数。,丝氨酸10- 5（mol/L） 20分钟生成丙酮酸（mol/L） S 1/S v 1/v 0.20 5.0 0.150 6.66 0.40 2.5 0.200 5.00 0.85 1.17 0.275 3.64 1.25 0.80 0.315 3.17 1.70 0.58 0.340 2.94 2.00 0.50 0.350 2.86 8.00 0.125 0.360 2.78,解2、1/v 对1/S作图法：,在实验中测得下列数据：,求丝氨酸脱氨酶对丝氨酸的表观米氏常数。,3,5,1,4,6,7,二、酶浓度对反应速率的影响 底物足够时呈直线关系,特点：当SE，使酶被底物饱和时，反应速度与酶的浓度变化成正比关系。,三、温度对酶促反应速率的影响 具有双重性,特点：1、最适温度（optimum temperature) 酶促反应 速度最快时的温度。 2、最适温度非特征性常数，它与反应时间有关。,四、pH酶促反应速率的影响 通过改变酶和底物分子解离状态,特点：1、最适pH（optimum pH）酶活性最高时的pH。 2、最适pH非特征性常数，受S、缓冲液种类与浓度、 以及酶纯度影响,某些酶的最适 pH 值,酶 最适 pH 胃蛋白酶 1.8 过氧化氢酶 7.6 胰蛋白酶 7.7 延胡索酸酶 7.8 核糖核酸酶 7.8 精氨酸酶 9.8,五、抑制剂对酶促反应速率的影响 可逆或不可逆地降低速率,抑制作用: 直接或间接地影响酶的活性中心， 使酶活性降低或丧失的现象。 抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变 性的物质。,抑制剂以共价键与酶活性中心的必需基团结合，使酶失活；且不能用透析、超滤等方法除去抑制剂使酶恢复活性。,（一）不可逆抑制作用（irreversible inhibition）,R-O O R-O O R-O X R-O O-E,P + E-OH P + HX,有机磷化合物 羟基酶 磷酰化酶(失活) （农药） （胆碱酯酶）,例1： 羟基酶的抑制,巯基酶 路易士气,例2： 巯基酶酶的抑制,（二）可逆抑制(reversible inhibition),抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低或丧失, 结合是可逆的, 能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。,可逆抑制类型：,1、竞争性抑制（competitive inhibition）,竞争性抑制作用过程：,竞争性抑制的动力学方程:,竞争性抑制的底物浓度曲线,竞争性抑制的特征曲线：,竞争性抑制的特点：,I与S分子结构相似； Vmax 不变，表观Km增大； 抑制程度取决于I与E的亲和力 ，以及I和 S的相对浓度比例。,例如：,2、非竞争性抑制 （non-competitive inhibition）,非竞争性抑制作用过程：,非竞争性抑制的底物浓度曲线,非竞争性抑制的动力学方程:,非竞争性抑制的特征曲线：,非竞争性抑制的特点：,I与S分子结构不同； Vmax 减小，表观Km不变； 抑制程度取决于I大小。,例：,质子化的叔胺（R3NH+）对乙酰酯酶的抑制,3、反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）,反竞争性抑制作用过程：,反竞争性抑制的底物浓度曲线,反竞争性抑制的动力学方程:,反竞争性抑制的特征曲线：,反竞争性抑制的特点：,I 与 S分子结构不同，I只与ES结合 Vmax 和表观Km都减小； 抑制程度取决于 I 和 ES 二者的浓度。,例：,氰化物或肼对芳香硫酸酯酶的抑制,六、激活剂可加快酶促反应速率,（一）激活剂（activator）:,（二）分类：,必需激活剂（essential activator） 酶促反应不可缺少，否则将测不到酶活性。 如：Mg 2+ 对己糖激酶 非必需激活剂（non-essential activator） 不存在时，酶仍有一定活性，但可提高酶催化活性。 如： Cl- 对唾液淀粉酶,（二）分类：,第 四 节 酶 的 调 节,（The Regulation of Enzyme）,概述,一、调节酶实现对酶促反应速率的快速调节,（一）变构酶通过变构调节酶的活性,一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合（非共价结合），使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。,变构调节（allosteric regulation）:,1、概念 受变构调节的酶 2、结构特点：多亚基（偶数） 催化亚基（活性中心） 调节亚基 变构部位（allosteric site） 或调节部位（regulatory site）,变构酶（allosteric enzyme）：,蛋白激酶 A 的变构激活,在其它酶的催化下，酶蛋白分子肽链上特定基团与某种化学基团发生可逆性共价结合，从而改变酶的活性的过程。,（二）酶的化学修饰调节是通过某些化学基团与酶的共价结合与分离实现的,1、共价修饰或化学修饰调节的概念 （ covalent modification regulation & chemical modification regulation）,概念：,2、共价修饰基团类型：,磷酸化与脱磷酸化 乙酰化和脱乙酰化 甲基化和脱甲基化 腺苷化和脱腺苷化 SH与SS互变,2、共价修饰基团类型：,由激素启动磷酸化的级联机制,（三）酶原的激活使无活性的酶原转变成有催化活性的酶,胰蛋白酶原的激活过程,胰蛋白酶原,消化道肠激酶启动的酶原激活级联效应,酶原与酶原激活的生理意义,保护组织器官本身免受酶的水解破坏 保证酶在特定部位与环境发挥催化作用 酶原可视作酶的储存形式,二、 酶含量的调节包括对 酶合成与分解速率的调节,（一）酶蛋白合成可被诱导或阻遏 转录水平,诱导作用（induction）和诱导剂（ inducer ）,阻遏作用（repression）和阻遏剂（repressor）,如： 胆红素诱导血红素加氧酶合成，促进胆红素生成。,溶酶体蛋白酶降解途径（不依赖ATP的降解途径，无选择性蛋白降解） 约40% 非溶酶体蛋白酶降解途径（又称依赖ATP和泛素的降解途径，选择性蛋白降解） 60%,（二）酶降解的调控与一般蛋白质降解途径相同,第 五 节 酶的命名与分类 （ The Naming and Classification of Enzyme）,一、酶可根据其催化的反应类型予以分类,1、氧化还原酶类（oxidoreductases） 2、转移酶类（transferases） 3、水解酶类（hydrolases） 4、裂解酶类（ lyases，或裂合酶） 5、异构酶类（isomerases） 6、合成酶类（syntheases）或连接酶类（ligases）,根据酶反应的类型，酶可分为六大类：,二、每一种酶均有其系统名称和推荐名称,习惯命名： 由发现者命名，常以底物名、反应性质及酶的来源命名 系统命名：1961年国际酶学委员会（Enzyme commission，简称 EC） 确定: 每一个酶由下列三种表示 1、系统名称（systematic name）： 底物名+反应性质（底物名之间用“：”隔开） 2、分类编号：E.C.+ 四个数字 分别代表：类、亚类、亚-亚类、亚-亚类中“序号” 3、推荐名（recommended name）： 选一个习惯名（实用、简单）,二、每一种酶均有其系统名称和推荐名称,举 例,一些酶的分类与命名,第 六 节 酶与医学的关系 （The Relation of Enzyme & Medicine）,一、酶和疾病密切相关,（一）酶的质、量与活性的异常均可引起某些疾病,疾病的发病机理直接或间接与酶表达异常或酶活性受到抑制相关； 疾病可引起酶的异常，这种异常又使病情加重； 激素代谢障碍或维生素缺乏可引起酶的异常； 酶活性受到抑制多见于中毒性疾病。,（二）酶的测定有助于对许多疾病的诊断,1酶活性测定和酶活性单位是定量酶的基础 2血清酶对某些疾病的诊断具有更重要的价值,（三）酶和某些疾病的治疗关系密切,许多药物可通过抑制生物体内的某些酶来达到治疗目的，如磺胺类药物抑菌作用。 通过阻断