课件：病毒的发现特点和定义.ppt

第七章,病 毒,第一节 概述,病毒的发现 病毒的特点和定义,病毒的发现,18代埃及王朝时代（1500年BC），浮雕刻有一条萎缩腿的祭司脊髓灰质炎。 古希腊哲学家亚里斯多德早在公元前四世纪描述狂犬病症状。 公元前23世纪，我国和印度都记载过天花。 17世纪西欧的郁金香热花叶病毒使花瓣呈美丽的杂色。,病毒的发现,此后，许多学者陆续发现了各种植物病毒、动物病毒和细菌病毒（噬菌体）。,病毒的发现 人类初步认识病毒的存在，是在19世纪末期。 1886年，德国的A.Mayer在荷兰发现烟草上出现深浅相间的绿色区域烟草花叶病毒。随后证实其具有传染性。 1898年，荷兰学者M.W.Beijerinck独立进行了烟草花叶病病原体的研究，首次提出其病原是一种“传染性的活性液体”或称“病毒”，从此病毒学的历史被揭开。,病毒的发现,1935年美国的Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)TMV，认识有了大突破。 接着，Bawden等进一步揭示了TMV的化学本质并不是纯蛋白，而是核蛋白。 1940年德国的Kausche等首次在电镜下观察到TMV的杆状外形。,一、病毒的特点和定义,病毒的特点 病毒的定义,病毒的特点 形体极其微小，电镜下才能观察。 没有细胞构造。 其主要成分是核酸和蛋白质。 每一种病毒只含有一种核酸(DNA或RNA)。 既无产能酶系，也无蛋白质合成系统。 在宿主细胞协助下，通过核酸的复制和核酸蛋白质装配的形式进行增殖。 在宿主的细胞内营专性寄生。 在离体的条件下，能以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶。 对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感。,病毒的定义,病毒是一种生物实体，其基因组是能利用细胞的合成系统在活细胞内复制，并合成能将病毒基因组转移到其他细胞中去的特殊颗粒的核酸分子（DNA或RNA）。,第二节 病毒学研究的基本方法,病毒的分离与纯化 病毒的测定,一、病毒的分离与纯化,标本的采集与处理 标本接种与感染表现,标本的采集与处理 足够量的活病毒 采集标本的种类 确定最适采集时间 标本处理的方法：加抗菌素除菌等方法。 标本处理后应立即接种，数小时内可置50%中性甘油内4保存，较长时间冻存标本最好置-20以下或干冰保存。,标本接种与感染表现 标本接种于何种实验宿主以及选择何种接种途径主要取决于病毒的宿主范围和组织嗜性，同时应考虑操作简单、易于培养、所产生的感染结果容易判定等要求。,噬菌斑,将噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即为噬菌斑。,噬菌斑(plaque),下层培养基,双层培养基,敏感菌+上层培养基,噬菌体稀释液,培养,噬菌斑,噬菌斑,敏感菌菌苔,噬菌斑(plaque),概念：噬菌斑是指在宿主细菌的菌苔上，噬菌体使菌体裂解而形成的空斑。,Localized areas of cellular destruction and lysis caused by virus infection are called plaques,应用：1、噬菌体定量计数 2、噬菌体的鉴定,空斑和蚀斑,在动物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑，称为蚀斑。因为受肿瘤病毒感染。,蚀斑（空斑）,若动物病毒标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区，即蚀斑（空斑）。,枯斑,植物病毒接种敏感植物叶片可产生坏死斑，称为枯斑。,枯斑,包涵体（inclusion body）,在病毒感染寄主细胞时，对被感染细胞进行染色，则可观察到细胞内有明显区别的大小不等的颗粒状结构体，这些结构体总称为包涵体。,包涵体,包涵体可分为两类。 一类是在细胞内增殖的病毒颗粒及集落，如腹股沟淋巴肉芽病毒和天花病毒的包涵体。 另一类是由于病毒感染后，在细胞产生的一种反应生成物，例如由狂犬病病毒而引起狗脑神经细胞中的包涵体。,包涵体,包涵体有的在细胞质中，腹股沟淋巴肉芽瘤、天花、狂犬病等。 有的在细胞核内，特称为核包涵体。,包涵体,是病毒的聚集体;,是病毒的合成部位;,是病毒蛋白和病毒感染有关的蛋白质,病毒纯化,病毒纯化的标准 病毒纯化的方法,病毒纯化的标准,病毒纯化有二个标准： 由于病毒是有感染性的生物体，所以纯化的病毒制备物应保持其感染性。 由于病毒具有化学大分子的属性，病毒毒粒具有均一的理化性质，所以纯化的病毒制备物的毒粒大小、形态、密度、化学组成及抗原性质应具有均一性表现。,病毒纯化的方法,根据病毒的基本理化性质建立纯化的方法： 毒粒的主要化学组成是蛋白质，鉴于病毒的高蛋白含量，故可利用蛋白质提纯方法来纯化病毒，如盐析、等电点沉淀、离子交换等。,毒粒是由许多大分子组成，离心时它们比细胞蛋白沉降更快，而且许多病毒都有较高的浮密度，所以超速离心技术广泛地用于病毒纯化。一般可在10000100000g的离心场中12h沉降。,病毒纯化的方法,病毒的测定,病毒的物理颗粒计数（电镜下直接计数） 病毒的感染性测定,病毒的感染性测定,病毒的感染单位：能够引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量(IU)。 病毒的效价：待测样品中所含病毒的数量，通常以单位体积(ml)病毒悬液的感染单位数目来表示(IU/ml)。,噬菌斑数=试样中噬菌体数,第三节 毒粒的性质,毒粒的形态结构 毒粒的化学组成,一、毒粒的形态结构,病毒的大小和形状 毒粒的壳状结构,病毒的大小和形状,大小：病毒的大小常用纳米（nm、 109）来度量，病毒大小从10300nm之间，通常大小在100nm左右。 绝大多数病毒是能通过细菌滤器。 须用电镜才能观察到其具体形态和大小。,球状球状病毒（或多面体病毒）。动物病毒多为球状。 杆状杆状病毒（包括棒状或线状）。植物病毒多呈杆状。 蝌蚪状蝌蚪状病毒。细菌病毒也即噬菌体多呈蝌蚪状。,病毒的大小和形状,Fig. 1B: Sizes and Shapes of Viruses (Animal DNA Viruses),Tobacco mosaic virus (TMV),形状,病 毒 大 小,牛痘苗病毒,传染性浓泡皮炎病毒,腮腺炎病毒,T偶数病毒,疱疹病毒,大蚊病毒,流感病毒,烟草花叶病毒,腺病毒,多瘤病毒,脊髓灰质炎病毒,1微米,典型病毒粒子的构造,衣壳(capsid),核心(genome),衣壳粒(capsomere),衣壳,核酸,包膜（envelope）,糖蛋白,核衣壳(nucleocapsid),毒粒的壳状结构,病毒粒子的基本结构,capsid,core,envelope,spike,nucleocapsid,病毒粒子(virion)成熟的（结构完整）、具有侵染力的单个病毒，又称病毒颗粒(virus particle)。,Capsomere or capsomer,三类典型形态的病毒,螺旋对称的代表-烟草花叶病毒(TMV) 二十面体对称的代表-腺病毒 复合对称的代表-T偶数噬菌体,病毒的对称性,三类典型形态的病毒： 廿面体对称的结构(球状) 螺旋对称的结构(杆状) 复合对称的结构(蝌蚪状) 大肠杆菌的T偶数噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是病毒中复合对称的代表。,病毒粒子的对称体系,螺旋对称,二十面体对称,复合对称,(A) Filamentous (B) Complex (C) Eicosahedral (D) Enveloped,RNA or DNA,Protein Coat (Capsomers),Lipid envelope,螺旋对称的病毒粒子,Tobacco Mosaic Virus,二十面体对称病毒粒子,Adenovirus,二十面体对称,刺突tail pins,Phaga, bacterioohaga,95nm,95nm,head,neck,tail（24环）,尾丝(tail fibers),65nm,有囊膜的病毒粒子,Fig. 4: Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by Budding,Transmission Electron Micrograph of HIV-1 Budding from a Host Cell,二、毒粒的化学组成,病毒的核酸 病毒的蛋白质 其它化学成分（脂质、糖类等）,一种病毒只含有一种核酸（DNA或RNA）。 植物病毒绝大多数含DNA；少数含RNA； 动物病毒一部分含DNA，一部分含RNA； 细菌病毒普遍含DNA，含RNA的极少。 病毒的核酸类型极为多样化： 病毒的DNA与RNA均有单链和双链： dsDNA ssDNA dsRNA ssRNA,病毒的核酸,病毒DNA分子有线状和环状之分。 病毒核酸有正链（）和负链（）的区分： 规定：将碱基序列与mRNA一致的核酸单链定位正链，将碱基序列与mRNA互补的核酸单链定位负链。因此，就病毒核酸链的单与双以及正和负有以下6 种类型： ()DNA大部分DNA病毒 ()RNA动物呼肠孤病毒 （）DNA 大肠杆菌X174噬菌体 （）RNA所有单链RNA病毒大部分植物病毒 （）DNA腺病毒 （）RNA 流感病毒,病毒的核酸,DNA，RAN之分,单、双链（single strand,ss/double strand,ds）之分,环状，线状之分(闭合,开放),正负链之分,病毒的蛋白质,构成病毒外壳,保护病毒核酸免受核酸酶及其他理化因子的破坏,病毒蛋白还构成了病毒组成的酶.,决定病毒感染的特异性,与易感细胞表面存在的受体具特异亲合力,促使病毒粒子的吸附,决定病毒的抗原性,并能刺激机体产生相应的抗体,其它化学成分,脂类 糖类,原核生物病毒-噬菌体,植物病毒,人类和脊椎动物病毒,昆虫病毒,第四节 病毒的复制,一、病毒的复制周期,一步生长曲线 以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，或高倍稀释病毒-细胞培养物，或以抗病毒抗血清处理病毒-细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。,一步生长曲线,从一步生长曲线中，可以获得病毒增殖的两个特征性数据：潜伏期和裂解量。,潜伏期和裂解量,潜伏期：是毒粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间。 裂解量：是每个受染细胞所产生的子代病毒的平均数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期效价之比。,二、病毒的增殖过程,病毒无生长过程，也不以二分裂方式繁殖，只由病毒核酸指令宿主细胞复制大量病毒核酸，继而合成大量病毒蛋白质，最后装配成大量子病毒，并自宿主细胞中释放出来。,病毒的增殖过程,病毒的种类繁多，增殖时不同的病毒在细节上有所不同，现以研究最清楚的噬菌体为例作重点说明，噬菌体的增殖一般可以分为五个阶段：吸附 、侵入 、增殖 、装配和释放 。 原核生物病毒-噬菌体,The lytic life cycle consists of the following steps: AdsorptionPenetrationReplicationMaturation Release。,The Lytic Life Cycle of Lytic Bacteriophages,由于绝大多数噬菌体为蝌蚪形，现以E.coli T4为例，介绍蝌蚪形噬菌体的结构：,大肠杆菌T4噬菌体构造,偶数噬菌体的形态构造,噬菌体(bacteriophage,phage),吸附,指病毒以其特殊结构与宿主细胞表面的特异受体发生特异性结合的步骤。 两者发生偶然碰撞后，尾丝的尖端与宿主细胞表面的特异受体接触（尾丝的氨基酸与受体上的羧基形成化学键），就可触发颈须把卷紧的尾丝散开，附着在受体上，从而使刺突、尾板固着于细胞表面。,吸附(adsorption),吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。,吸附(adsorption),影响因素：噬菌体数量；阳离子；温度。,侵入,病毒或其一部分进入宿主细胞的过程。 吸附后，基板从尾丝中获得一个构型刺激，促使尾鞘中的144个亚基发生复杂的移位，并缩成原长的一半，由它把尾管推出并插入到细胞壁和膜中。在这一过程中，尾管端所携带的少量溶菌酶有助于局部细胞壁中肽聚糖的溶解。核酸进入，衣壳留在细胞壁外。从吸附到侵入时间很短。,侵入(penetration),收缩的尾鞘（1/2环）,The bacteriophage binds to receptors on the bacterial cell wall.,The bacteriophage injects its genome into the bacteriums cytoplasm,Fig. 2: Penetration,Fig. 1: Adsorption,双链DNA的复制: ()DNA ()DNA 单链DNA的复制: +DNA DNA +DNA 双链RNA的复制: RNA +RNA RNA +RNA复制: +RNA -RNA +RNA -RNA复制: -RNA +RNA -RNA 逆转录病毒单链RNA的复制: +RNA (-)DNA () DNA +RNA肿瘤病毒,病毒核酸的复制,左图：病毒核酸链接 入寄主核酸链 右图：病毒核酸复制,病毒核酸的复制,病毒核酸的转录,含DNA的病毒:DNA mRNA +DNA病毒:+DNA DNA mRNA 含RNA病毒:RNA mRNA 含+RNA病毒:+RNA -RNA mRNA 含-RNA病毒:-RNA mRNA,装配,DNA分子的缩合；通过衣壳包裹DNA而形成头部；尾部和尾丝的其他部件独立装配完成；头、颈、尾部相结合；最后装上尾丝。,释 放,当宿主细胞内大量子代噬菌体已成熟后，由于水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶的作用，从细胞内部促进了细胞的裂解，从而实现了噬菌体的释放。,最后:大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病毒，新一代病毒开始新的生命旅程,The bacteriophage genome replicates and bacteriophage components begin to be produced by way of the host bacteriums metabolic machinery.,The production of bacteriophage components and enzymes progresses .,Fig. 4: Late Replication,Fig. 3: Early Replication,The bacteriophage components assemble.,A bacteriophage-coded enzyme breaks down the peptidoglycan in the bacterial cell wall causing osmotic lysis.,Fig. 6: Release,Fig. 5: Maturation,Phage T4 infecting its host E. coli cell,第五节 病毒的非增殖性感染,病毒对敏感细胞的感染可分为两类：一类是增殖性感染，这类感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征。,病毒的非增殖性感染,另一类是非增殖性感染，这类感染由于病毒或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然也可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。,一、非增殖性感染的类型,病毒的非增殖性感染有三种类型：流产感染、限制性感染和潜伏感染。 流产感染 限制性感染 潜伏感染,二、缺损病毒,有生物活性的缺损病毒包括四类：干扰缺损病毒或称干扰缺损颗粒、卫星病毒、条件缺损病毒和整合的病毒基因组。 干扰缺损病毒 卫星病毒 条件缺损病毒 整合的病毒基因组,卫星病毒,指不单独存在，常伴随着其他病毒一起出现的病毒。 卫星病毒因缺少作为必需的一部分病毒基因，因此它必需借助其他病毒才能增殖。 典型的例子是伴随着烟草坏死病毒而出现的卫星病毒。,Two primary types of bacteriophages,温和噬菌体（temperate phrage）噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（插入）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。,烈性噬菌体（virulent phage）感染细胞后,能在寄主细胞内增殖，产生大量子代噬菌体并引起细菌裂解的噬菌体。,溶源性,温和噬菌体特点：,游离态 温和噬菌体存在形式：整合态 营养态,具有整合能力；,具有同步复制能力；,都是dsDNA;,原噬菌体,整合于细菌染色体或以质粒形式存在的温和噬菌体基因组称作原噬菌体。 在原噬菌体阶段，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细胞染色体同步复制，并随细胞分裂传递给子代细胞。,溶源性细菌,细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌。 处于溶源性细菌细胞中的噬菌体DNA在一定条件下也可启动裂解循环，产生成熟的病毒颗粒。有自发裂解和诱发裂解。,溶源性细菌,溶源性反应是一种比裂解反应更有利于病毒持续和传播的病毒生存方式。,溶源菌,细菌的溶源性具有遗传性,溶源菌对同源噬菌体具有免疫性,溶源性细菌在培养中不易被查觉,非溶源细胞,溶源性细胞可获得一些新的生理特性,复愈:溶源菌,白喉杆菌,白喉毒素,植物感染病毒后的主要症状,植物病毒增殖过程,植物病毒病的控制,黄豆黄萎病毒,花叶、黄化或红化等症状,植株发生矮化，丛枝或畸形等,形成枯斑或坏死等症状,植物感染病毒后的主要症状,植物 黄 萎 病,借昆虫刺吸式口器进入,“侵入”方式,通过伤口进入，再通过胞间连丝或输导组织迅速向其它部位扩散引起普遍感染。,嫁接,烟草花叶病毒,植物病毒侵入宿主细胞后才能发生脱壳,植物病毒病的控制,转基因植物抗病毒番茄,选用天然抗性品种,改变耕作制度,使用刹虫剂消灭昆虫介体,化学药物,转基因抗病毒植物的开发,T淋巴细胞中的爱滋病毒,人类脊椎动物病毒,病毒感染对真核细胞的影响,病毒与癌症关系,病毒感染的防治,病毒感染对宿主大分子合成的影响,宿主细胞转录的抑制,宿主细胞翻译的抑制,宿主细胞DNA复制的抑制,血液淋巴中的单泡病毒,被病毒感染的 T 淋巴细胞,病毒对细胞结构的影响,病毒对宿主细胞膜的影响,病毒对细胞骨架的影响,包涵体,细胞凋亡,电镜下的流感病毒,细胞无任何明显变化,细胞病变（损伤、死亡）,细胞增生（恶性肿瘤）,病毒感染对真核细胞的影响结果,细胞遇病毒袭击而濒临死亡 （图中蓝点是病毒 ）,隐性感染,疾病综合症,死亡,瘤形成,携带者,潜伏状态,埃博拉病毒,病毒与癌症的关系,原癌基因 （人类基因组中的正常基因）,癌基因,逆转录病毒致癌机理,+RNA (-)DNA () DNA +RNA肿瘤病毒,病毒感染的防治,接种疫苗,生物制剂,中药预防,干扰素等,流感病毒,流感病毒,昆虫病毒,核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV),质型多角体病毒(cytoplasmic polyhedrosis virus,CPY),颗粒体病毒(granulosis virus,GV),昆虫病毒做为生物农药优点：,专一性高,毒力大,后效长,使用方便,对人畜安全,无公害,缺点危害经济动物,第七节 亚病毒因子,卫星病毒 卫星RN