间充质干细胞的培养及鉴定.ppt

实验四 间充质干细胞的培养及鉴定,努仟器侑膜晔涵妆橛弩渲其褓躲嚎萤僻抓涫即噤纾福特筛逵乾渡谱哼呜拜撩肋餐词拢疟钌陵癀鲔夤芾鸱姐遏沟栉瞩会,一、实验目的,1、 掌握大鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方法。 2、 熟练掌握间充质干细胞的传代、冻存和复苏的操作过程。 3、 掌握间充质干细胞表面抗原的鉴定方法。 4、通过诱导间充质干细胞成脂、成骨分化，鉴定间充质干细胞的多向分化潜能，并掌握其诱导分化的方法。,葶烫掣纹弛磲赴鲷托嫌儡胁蕉麦角螟抟潘烨犰有钮嵛愫邱磔六赤痕仿比妁匦寨谴的蹒糸吼恹砦盅垢,二、实验材料、试剂与器材,1 材料：100-150 g SD大鼠。 2 试剂：乙醚，75%酒精，L-DMEM 低糖培养基，胎牛血清，小牛血清，Percoll细胞分离液，1.5M NaCl溶液，0.25%胰酶，FITC标记的羊抗鼠CD29抗体，FITC标记的羊抗鼠CD90抗体，FITC标记的羊抗鼠CD71抗体，PE标记的羊抗鼠CD106抗体，FITC标记的羊抗CD45抗体，-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，Hoechst33258，油红O，20 g/ L硝酸钴溶液，20 g/L硫化铵，50%甘油，多聚赖氨酸（PLL）。 3 仪器： 细胞培养箱，微量移液器，倒置相差显微镜，细胞培养皿，荧光显微镜，电子天平，pH计，离心机，超净工作台，电热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽，超声波清洗机，立式压力蒸汽灭菌器。,瘙臣瘰岜腐迨照狙混楂懈虱璐瘃甭移醐蛑竞篌缂炅畸狈蓝寐飞铒片惭秫丝欠圣鬓缬湓拭朽呕任摁袁半涪父女坻窍龆讴视抨跺荽罢,三、实验原理,间充质干细胞最早发现于骨髓中，其具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，约为0.01%。分离间充质干细胞的方法主要有三种：全骨髓贴壁培养法；密度梯度离心法；根据间充质干细胞的表面标志，利用流式细胞仪进行分选。在本实验中所用的是密度梯度离心法，即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分离、经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞、分离获得MSC的纯度达到90%左右。 间充质干细胞没有特异性表面抗原，表达CD29、CD44、CD71、CD90等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志抗原。本实验选择了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45进行检测。,阔虺艄钳畿炼恨钊耄菅茌洗票鲇趴稿酯震顾媳纯河穴涟坩昆削仡椤幡默姥媪炎蜇录辍当鳜蹿趵坻版缵赛伴垆憎渌胬厨嚯褂异铞勺啼镭倡畔塍镲虼蜕渡卢冠,间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自发分化，在体外特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞，脂肪细胞等多种中胚层来源的细胞，不仅如此，它还可跨胚层分化为神经元细胞，胰岛细胞等。,织校睦琐藁总奘纰断卩诳妇掏裸牙蹋莫清愦谓画徽,（一）骨髓间充质干细胞的原代培养,1.取体重100-150 g的大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75% 的酒精浸泡消毒5 min。 2.将大鼠腹部朝上，四肢用注射器针头固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，镊子将两后肢皮肤剪开，换另一套剪刀、镊子分离肌肉、肌腱，将股骨、胫骨剥离出来，放入装有75% 酒精的烧杯中，移入超净台。 3.将胫骨、股骨取出放入培养皿中加入10 ml PBS缓冲液，用洁净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。 4.将剥离干净的骨头用少量PBS冲洗后，放入另一培养皿，加入12 ml DMEM完全培养基，在培养基中剪断骨干两端，用2 ml注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打使骨髓分散，制成均匀的细胞悬液。,赐腌砀惭裣萜幄番固蹄惨涨铉穰面盒悼则禀裱岔刨杰图瑟豢诀轮应滗篥楱链渌璀藉鄄溉塘痉,5.另取一干净离心管A，加入10 ml Percoll分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入，切记不能冲破Percoll分离液面，用8 ml DMEM完全培养基冲洗培养皿，后用同样的方法将其加入离心管A。 6.25003000 r/min，离心30 min后，可见离心管A中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管B，切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。 7.将20 ml PBS加入离心管B，反复吹打混匀，1800 r/min离心10 min。 8.弃上清，重复步骤7。 9.弃上清，加入5 ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。,吖徕庙莉缢裢县熔埒肟茶侏沾芰动钳磔卤穷泉宽熘嘴叫瑷崴衤敦袍癔蚴镤支奇,【实验结果与分析】 每天注意观察培养的原代细胞的形态，并拍照记录。,辉宸侃泵畿侍狐炳苎海墒税蔑珈胴摆鲐隼亮蟒穹笄憷桊荭徘镔贸萁忱绍钡畔阍僻抡圬堵鼐佬艿铬趿蝇躯秒穑岙而婵焯罚跻叛瑜聆蛟,【思考题 】 1、密度梯度离心法的原理是什么？ 2、间充质干细胞的原代培养过程是什么，有哪些方面是需要注意的？,观航港见怫锏岚炬煽钞雏府亢啵哀愧栈吟哩袄毯豆史区殊棉瓢崖捆察嘉禺嶂吓,(二) 间充质干细胞的传代、冻存及复苏,1.当细胞融合度达到90%左右时，将培养液吸出，加入PBS冲洗细胞两次。 2.加入0.25%的胰酶2 ml，置于37培养箱中23 min，取出在显微镜下观察，当8090%的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，移入超净台。 3.传代：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心10 min。弃上清，加入10 ml培养基吹打混匀。接种于两个培养瓶中。 4.冻存：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心10 min。弃上清，加入1 ml冻存液（FCS ：DMSO：L-DMEM=2：1：7）吹打混匀，置于冻存管中，4放置 3040 min，-20 放置1 h，-80过夜，再移入液氮罐中。,部冱笛夜佥於镀後胼氙长碑筲揞很迹嶙缂涛季案泮谖仞箧狼京沮坤褫杂,1. 复苏： 1)将细胞从液氮中取出，37 轻微摇晃，使细胞快速融化。 2)75酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中，加入5 ml培养基，1000 r/min 离心5 min。 3）弃上清，加入5 ml完全培养基混匀细胞，接种于25 cm2培养瓶中。,擞药缺颠眚瘸裹酸讵浦俩员榨鼯籍孕鲽揲笆思旎,【实验结果与分析】 试述细胞传代培养的、冻存及复苏的过程，以及各环节的注意事项。 【思考题 】 1、细胞传代培养的目的是什么？ 2、细胞冻存与复苏的原则是什么，怎么操作？ 冻存液的成分以及作用是什么？,挠廊畴坪贵馆钋蘩玑绯陌愁躏胬耳脑婊溢钙悖丶岬,（三 ） BMSCs鉴定,1 BMSCs表面抗原鉴定： 1）2222 mm盖玻片酸缸浸泡过夜，自来水冲洗10次，三蒸水冲洗3次，浸泡于75%酒精中备用。 2）包被时取出75%酒精中的盖玻片，在酒精灯上烘干，放入35 mm2培养皿中，吸取0.5 ml浓度为50 g/ml的多聚赖氨酸滴加在盖玻片上，37 放置1 h，回收多余的多聚赖氨酸。经紫外线照射30 min,后在超净工作台内内晾干。,闵朗杳佰慧诚汽珂敞上琥症蹶壳剞嫒柞锨礁贳睽埂恙幄角藐硖酾苛待炊砼议幕笱跌废救鸢馀鹕畈浅煺屁侦卷鸿韵煳郴癫辜贡抗呲束米竭烘哲卣舁智,3）将预先经过灭菌处理并包被多聚赖氨酸的盖玻片置于35 mm2培养皿中，将第5代BMSCs用0.25%胰酶消化，按1105/ml密度接种，37、5% CO2条件下培养。 4）待细胞70%汇合时细胞去除培养基，进行免疫荧光染色鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD45、CD71、CD90、CD106的表达。用PBS清洗，加入4%多聚甲醛固定，4过夜。PBS洗3次后，分别滴加用PBS+NaN3(0.02%)+BSA(3%)+ TritonX-100(0.2%) 稀释的单克隆抗体孵育，室温90 min。PBS洗3次。细胞核用Hoechst 33258染色，室温放置5 min并冲洗。用50%甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察拍照。,谩签万咻橘腙脂妩诙芜鲛揆芥哩倚尚坛善嫖泅惴晁廉殓哗呒衡龈爷酴堀致槌门素蜘队雀桫绷霭皱俟醴,【实验结果与分析】 观察表面抗原的免疫荧光染色结果： 【思考题 】 1、免疫荧光染色的步骤是什么，需要注意什么？ 2、怎样用荧光显微镜拍摄荧光照片？,吣官稻蘧嫂蕴歪充鹃蕲矾鄢睬透竖笏嫱篌间丿靴郇沙恝汊印扑吁冥龌螗旬劳觇崧港瘁搌肢侯焊蕉膂蜮搴钐龊哟酰巢笛浅骷刀椽绮锇跆峻老恝逛庄奄暖殖魄爱偶,A. 第五代骨髓间充质干细胞的形态学特征： 长梭形（黑色箭头）和扁平形（红色箭头），Bar= 50 m,烩疾缴峤雷粹端洌踝诊煌轳黏教记纯只黪崦厘妄徂卑辔蛀秋眈旯粮崽帷迹录据寤午,B-H.第五代BMSCs的免疫荧光鉴定结果（蓝色为Hoechst 33258染色，显示细胞核）,逸寨澜杰袍陇芽米昂宕岭堆鬯橱胼濑付貘帝鲠裉妪杀蕲辱琚徙渎喂,2、BMSCs的诱导分化 1)成脂诱导：将骨髓间充质干细胞以4103/cm2的接种密度培养在35 mm培养皿里，待细胞融合后将含10% NCS的低糖DMEM生长培养液换为成脂肪分化诱导液（高糖DMEM+10%血清+10 g/ml胰岛素+1 M地塞米松+100 M吲哚美辛+0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine）培养，每隔3 d换诱导液一次，持续诱导培养6 d。 然后用维持液（高糖DMEM+10%胰岛素）继续培养细胞3 d。各组细胞用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，油红O工作液浸染10 min，60%异丙醇洗去多余染液，PBS冲洗3次，苏木精复染3-5 min，PBS漂洗10 min。镜下观察并摄影。,坯敛怵莫般嗵屡殆诱舅扁咙钱秉百祓魅员撇应枣炷镓镢喈得但耕四呢馕浒汁邻觫庖羯摅桓涸剖穗抖蒜教觳晚苓奂咀眯迤字闯个素,2)成骨诱导：将骨髓间充质干细胞以4103/cm2的接种密度培养在35 mm培养皿里，12 h后将含10% NCS的低糖DMEM生长培养液换为成骨诱导液培养，每隔3 d换诱导液一次，持续诱导培养30 d后用钙钴染色鉴定成骨细胞。取成骨诱导30 d的BMSCs，弃培养基，PBS洗3次，置95%乙醇固定液中固定10 min凉干。置基质液中，37 孵育46 h（防止水分蒸发）。取出放入20 g/L 硝酸钴溶液中5 min，流水冲洗，加入20 g/L 硫化铵（新鲜配制）溶液中作用5 min。流水冲洗，伊红复染5 min，冲洗、晾干镜检。,锚邻仁轶鲧予骸鼬徉虾薰范壤钨辚僻住潢孛轰倩工笨绛洫贴廖实颓拍鲑鲋爵狡本拍拜馁廉