论文资料：福建金线莲总黄酮提取工艺的研究.doc

福建金线莲总黄酮提取工艺的研究*关 璟, 王春兰*, 郭顺星, 肖培根（中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，100094，北京，）摘要：目的 研究兰科开唇兰属药用植物福建金线莲Ancecotochilus roxburghii总黄酮的最佳提取工艺，为该药材质量研究奠定基础。方法 以总黄酮含量为指标，紫外分光光度法为检测手段，利用正交实验设计确定最佳提取工艺。结果 所考察的因素中，对福建金线莲总黄酮提取率影响程度为：溶剂浓度 提取次数 提取时间 溶剂用量，其中乙醇浓度对黄酮提取率具有显著影响。结论 福建金线莲总黄酮最佳提取工艺为：95%乙醇浸泡过夜，加热回流提取3次，每次1.5hr，溶剂用量均为12倍量。加样回收率为98.51%，RSD%为2.068%。关键词：福建金线莲；总黄酮；正交实验设计中图分类号 文献标识码：A 文章编号福建金线莲（Anoectochilus roburghii）为兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Anoectochilus）珍稀药用植物，又名金线兰、花叶开唇兰等。该植物主要分布于中国南部福建等省，日本、斯里兰卡、印度和尼泊尔等国也有零星分布1。金线莲在民间有“药王”、“金草”之美誉，近年来主要用于治疗高血压、糖尿病、心脏病、肺炎、急慢性肝炎、肾炎等症2。在对其化学成分系统研究的基础上，认为黄酮类化合物为福建金线莲化学成分中重要组成部分2-4。因此以总黄酮为检测指标，紫外分光光度法为检测手段，利用正交实验设计，对福建金线莲提取工艺进行了研究，为进一步的质量控制以及药理活性等研究工作提供可靠资料。1 材料、仪器福建金线莲Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.购于福建省，由中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员鉴定。标准品Bu-h（异鼠李素-3-O-芸香糖）为我室从该植物中分离得到，纯度98%。所用试剂均为分析纯。PHILIPS PU8800紫外可见分光光度计；电子分析天平（AE240）。2 试验方法取待测标准溶液进行200-400nm紫外光谱扫描，如图1所示，标准品Bu-h的最大吸收波长在205, 370, 254nm处。2.1 检测方法的选择样品的原阶紫外光谱图没有显示出黄酮的特征吸收，但其二阶导数光谱图在=370nm处有较明显的波动。因此以370nm最为检测波长。_* 国家自然科学基金资助项目（30270148）和国家杰出青年科学基金资助项目（30325047）* 通讯作者，Tel：(010)62899734； E-mail： 图 1 标准品和样品紫外区扫描图，左为标准品，右为样品紫外吸收光谱图2.2标准品及样品溶液的制备2.2.1 标准溶液的制备及标准曲线的绘制取标准品Bu-h 10.05mg，用95%乙醇溶于10ml容量瓶。取2ml于50ml容量瓶，加95%乙醇至刻度，得到浓度为0.04020mg/ml的标准溶液。取此标准溶液Vml，置于5ml容量瓶，加95%乙醇至刻度，重复3组，待测。表1 标准品浓度与吸光值AV(ml)1.52.02.53.03.5C(g/ml)12.0616.0820.1024.1228.14A0.3540.46030.5670.6720.787由表1中数据得到标准曲线方程：C=37.30A-1.088，相关系数r=0.9997，线性范围：10.102- 25.022 g/ml。2.2.2 样品溶液的制备 精密称取干燥药材500mg，加入溶剂，浸泡过夜，加热回流提取，提取液转入25ml容量瓶，加95%乙醇至刻度。取该溶液1ml，置于5ml容量瓶，加95%乙醇至刻度，待测。2.3正交实验设计通过预实验，对提取方法，包括索氏提取、回流提取、超声提取，提取溶剂的种类，包括甲醇和乙醇，以及浸泡时间、提取时间、提取次数、提取温度、溶剂用量等因素进行了考察，确定了4个主要因素。同时分别对4个主要因素进行水平的筛选，确定了3个水平。选用常用的四因素三水平L9(34)正交表进行实验。因素水平见表2。因素表2 因素水平表水平A(乙醇浓度/%)B(溶剂用量/倍量)C(提取时间/hr)D(提取次数/次)19580.51260101.02350121.53表3 直观分析数据表 列号实验号1 (A)2 (B)3 (C)4 (D)FLY%19580.511.456295101.021.688395121.531.88346081.031.026560101.510.9054660120.521.05075081.521.020850100.530.9740950121.010.8390k1j1.6761.1671.1601.067k2j0.9441.1891.1841.253k3j0.9441.2571.2691.294R0.7320.0900.10970.22优水平1333注：FLY% 代表药材的总黄酮含量，以下同。 由表3 的结果得到福建金线莲总黄酮最佳提取工艺为：A1B3C3D3，即：95%乙醇浸泡过夜，加热回流提取3次，每次1.5小时，溶剂用量均为12倍量。2.4 方法学考察2.4.1 精密度实验 精密量取2.0ml浓度为0.04020mg/ml的标准溶液，置于5ml容量瓶，加95%乙醇至刻度，测吸光值。重复操作5组，RSD值为0.3892%。2.4.2 重复性实验 根据正交实验结果，按2.2.2项下样品溶液制备方法，重复操作5组，测定结果并计算RSD，为1.4234%。2.4.3 加样回收率实验取药材500mg，加入浓度为2.007mg/ml的标准溶液2.5ml，按照实验所得最佳提取工艺处理药材，得到供试液，重复操作6组。370nm处测其吸光值，计算总黄酮药材含量。测得加样回收率为98.51%，RSD为2.068%。3 结果与讨论3.1 最佳提取工艺最优水平组合与试验中较好方案一致，因此最佳提取工艺为A1B3C3D3，即，使用12倍量的95%乙醇将药材浸泡过夜，加热回流提取3次，每次1.5小时，溶剂用量均为12倍量。3.2 药材总黄酮含量使用最佳提取工艺处理药材，重复5组，得到的提取物计算药材总黄酮含量为：2.048%，RSD为1.023%。3.3直观分析 表3中的R值代表各列的极差，极差越大表示因素越重要。故四个因素的重要顺序为：ADCB。表4 方差分析数据表方差来源离均差平方和自由度F比值F临界值P值乙醇浓度1.002277.07719.00P 0.05溶剂用量0.01321.00019.00提取时间0.02021.53819.00提取次数0.08826.76919.00误差0.012F0.05 (2, 2) = 19.00, F0.01 (2, 2)= 99.003.4方差分析数据的方差分析结果表明，乙醇浓度对药材中总黄酮的提取率具有显著影响，且P0.05。而溶剂用量、提取次数和时间对药材中总黄酮的含量没有显著影响。在提取时为了节省能源，可选择这三个因素的较低水平进行提取。REFERENCES1 Delectis Florae Reipublicae Popularis Sinicae Agendae Academiae Sinicae Edita. 1978. Flora Reipublicae Popularis Sinicae (中国植物志). Tomus 17, 18. Beijing : Sinice Press. 624.2 HE C N, WANG C L, GUO S X. Study on the chemical constituents of Anoectochilus roxburghii. Chin Pharm J (中国药学杂志). 2005,40(8): 581-5833 HE C N, WANG C L, GUO S X. Study on chemical constituents in herbs of Anoectochilus roxburghii . China Journal of Chinese Materia Medica (中国中药杂志). 2005,30(10):761-7634 GUAN J, WANG C L, GUO S X. Isolation and structural elucidation of flavonoids from Anoectochilus roxburghii. Chinese Taditional and Herbal Drugs (中草药). 2005, 36(10): 1450-14535 Chen Y T , Zheng R L , Zh J J, et al. Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants. Free Radical Biology Medicine, 1990, 9: 196 Snyder L.R., et al. Practical HPLC method development. Science Press (科学出版社). Beijing: 19987 Cao W G, Liu Z Q, Shao Y. A progress in pharmacological research of flavonoids. Acta Bot. Boreal Occident Sin (西北植物学报). 2003, 23(12): 2241-2247Study on extraction technology of total flavonoids for Anoectochilus roburghii by orthogonal designGUAN Jing, WANG Chun-lan*, GUO Shun-xing, XIAO Pei-gen(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100094, China)Abstract Objective: To study the extraction technology of total flavonoids for Anoectochilus roburghii. Method : The extraction condition was optimized with orthogonal design by the detection of UV spectrum. Result: The order of factors that the flavonoid extraction was affected first is ethanol concentration, second is extraction times, third is extraction continuance time, and the last is solvent quantity. Conclusion: The optimum extractions are A1B3C3D3