米曲霉种曲培养条件的优化毕业论文.doc

毕 业 论 文 题 目 米曲霉种曲培养条件的优化 专 业 生物工程 班 级 071班 姓 名 舒琴情 指导教师 胡文浪(高讲) 所在学院 生环学院 完成时间：2011年 5月4承 诺 书我谨此郑重承诺：本毕业设计（论文）是本人在指导老师指导下独立撰写完成的。凡涉及他人观点和材料，均依据著作规范作了注释。如有抄袭或其它违反知识产权的情况，本人愿接受学校处分。 承诺人（签名）： 年 月 日米曲霉种曲培养条件的优化生物与环境学院生物工程专业 舒琴情摘 要 曲霉菌种是酿造酱油的主要菌种，是酿造酱油品质优劣的关键。其产生的蛋白水解酶类属诱导酶类，其产量及其活性与培养基的诱导物及培养条件相关。本文主要探索米曲霉种曲的培养条件，主要有培养温度、培养基的初始pH值、培养时间等因素，以及探索废啤酒糟替代原料进行发酵的可行性。结果表明，在44小时时，32的温度，培养基初始酸碱度为7的情况下，米曲霉生长旺盛，蛋白酶产量最优。在传统原料培养及替代原料培养的对比试验中可得出，在啤酒糟：麸皮=5:5的情况下，其蛋白酶活力与传统工艺培养的酶活基本一致，表明了啤酒糟作为原料生产酱油的可行性。关键词 米曲霉；酱油；蛋白酶Culture condition optimization of Aspergillus oryzae Shu Qin-qing,Major in Biological engineering,College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren UniversityAbstract: Aspergillus species are the main strain soy sauce, is the key of the good or bad fermented soy.The proteolytic enzymes are produced by induction of enzymes, its production and its inducer activity and the medium and culture conditions related. This paper mainly explores the cultivation of rice aspergillus kind of song, mainly has the incubation temperature conditions, the initial pH value, medium, and the factors such as training time exploring waste beer bad alternative materials in fermentation feasibility. The results show that when the 44 hours 32 , the temperature, medium for initial ph of 7 cases, vigorous growth, protease anti-pathogenic rice yield optimal. In traditional training and substitute raw materials in the cultivation of contrast test paper, in beer worse: bran = 50 cases, its protease vigor and the cultivation of traditional craft is basically the same enzyme live shows that beer worse as raw materials to produce the feasibility of soy sauce.Keywords: Aspergillus oryzae; soy sauce; protease activity目 录1 引 言11.1本课题研究的背景11.2本课题研究的意义12 研究内容23实验方法23.1米曲霉的分离纯化23.2蛋白水解酶测定33.3实验的基本方案43.3.1米曲霉在不同曲料pH条件下的酶活力43.3.2培养温度对米曲霉产蛋白酶活力的影响43.3.3米曲霉在不同培养时间下的酶活力43.3.4米曲霉的替代原料培养44 实验结果与讨论54.1在不同初始pH下试验数据与讨论54.2不同温度下进行试验的数据与讨论64.3在不同培养时间下试验数据与讨论64.4替代原料的米曲霉酶活试验数据与讨论75 小结85.1结论85.2本试验创新之处8致 谢10参考文献111 引 言1.1本课题研究的背景米曲霉具有丰富的酶系,其稳定性高,能耐受较高的温度；在蛋白酶的作用下，可将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植物酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛的应用于食品、饲料、酿造等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉在我国酱油生产行业中的应用很普遍，传统的酱油酿造方法得到的产品香气醇厚，风味俱佳，但由于发酵周期长，生产工艺落后，原料及设备利用率低，其产量远远不能满足市场需要。有些厂家的米曲霉蛋白分解能力低, 单株生产菌株应用于生产时的蛋白酶活力为8001000U ,全氮利用率为72.4% ,氨基态氮生成率只有42%44%,复合菌株的氨基态氮生成率在50%左右，而日本酱油行业的蛋白质利用率已经达到92%。由于氨基态氮是酱油质量标准中的主要指标, 产品中氨基态氮的含量低,产品的营养水平就低，所以米曲霉的优化筛选是酱油酿造业中的至关重要的部分。长期的实验发现，沪酿3042米曲霉用于酱油生产,具有适应性强,繁殖速度快,酶系全,不产黄曲霉毒素等特点。从20世纪60年代末期开始，沪酿3042米曲霉在酱油生产中广泛应用，至今已40多年，仍是深受广大厂家的欢迎。1.2本课题研究的意义酱油酿造过程主要依赖于米曲霉所产生的丰富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系,分解原料中的各种成分,从而形成酱油独特的色、香、味、体。生产过程中米曲霉主要作用是制曲和发酵，制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生长发育，并大量产生和积蓄所需要的酶。在发酵过程中利用这些酶的作用形成酱油独特的色、香、味、体。其发酵机理是一个错综复杂的物化学反应过程，其主要是淀粉与蛋白质的分解与合成代谢过程，通过温度和时间,让蛋白酶分解蛋白质为氨基酸,淀粉酶分解淀粉成葡萄糖。然而在这样的一个经济快速发展的时代，人民生活水平的提高,对酱油质量要求越来越高,需求量越来越大,这与蛋白质资源缺乏的矛盾日益突出。啤酒生产过程中产生了大量的废料，这些物质大部分没有得到较好的利用，大多停留在原始粗加工上，创利甚微，不但浪费资源，甚至会污染环境。酿造酱油所用的原料包括蛋白质原料、淀粉原料、食盐、水等几个方面，而其中的蛋白质原料和淀粉原料提供是发酵酿造过程中所需要的各种主要营养成分。根据实验研究，对啤酒的废料的成分进行分析可知，废弃啤酒废料中蛋白质含量为45%50%，除此之外，还有丰富的B族维生素、有机磷、有机钙、铁等物质，在啤酒生产中，每生产1000吨的啤酒，就有1.2吨的啤酒废料产生，其中湿啤酒糟的成分为：水分75%80%、蛋白质8.5%、可溶性淀粉10%、粗纤维5%等。因此，从理论上来说废啤酒糟完全可以替代全部或部分豆粕作为酿造酱油的原料。本课题主要切入点是针对酱油酿造菌株-米曲霉蛋白酶活力低的问题,为了提高原料的利用率, 降低生产成本等问题，将研究菌种在不同培养条件下的生长形状，生长速度及其产酶活力情况来选育优良的米曲霉菌种。2 研究内容根据本课题研究意义，主要掌握选择合适的米曲霉培养方法、适宜的培养基及培养条件，确定最佳产酶条件，来选育优良的米曲霉菌种，以提高酱油生产的原料利用率，生产效率和出品率。具体内容包括：（1）通过米曲霉的活化，观察菌种的菌丝体形状，颜色等来得到纯化米曲霉；（2）单因子研究影响因素，主要包括不同的pH、温度、培养时间条件下对种曲的蛋白酶活力分布的影响。（3）通过米曲霉的优化证明啤酒下脚料完全有可能全部或部分替代豆粕进行酱油酿造。3实验方法3.1米曲霉的分离纯化米曲霉由杭州酱油酿造厂提供（1）米曲霉的分离纯化（平皿培养）培养基组分：豆汁：1000ml45B 可溶性淀粉：20g 磷酸二氢钾1g 琼脂：025g硫酸铵：0.5g 硫酸镁：0.5g 30保温箱内培养2d，选取菌落半径比值大，菌落生长快，孢子多的单一菌落。（2）米曲霉的斜面培养在恒温箱30培养23d，直至长满茂盛的黄绿色孢子。（3）米曲霉的二次扩大培养（三角瓶培养）培养基组分： 麸皮80g 面粉20g 水80-90ml在30保温箱内培养3d左右，瓶内曲料上布满白斑及菌丝，孢子充分长满曲料。3.2蛋白水解酶测定方法：福林-酚试剂法酪氨酸标准曲线的制作：表3.1 蛋白酶标准曲线制作试剂管号1号2号3号4号5号6号7号酪氨酸含量（mgL）0102030405060标准酪氨酸（100 mgL）(ml)0.00.10.20.30.40.50.6蒸馏水(ml)1.00.90.80.70.60.50.40.6 molL Na2CO3溶液（ml）5.0Folin-酚乙试剂(ml)0.5混匀后，置于40恒温水浴保温20minA66000.0650.1660.2690.3920.4500.606数据分析绘制曲线，见下图：图3.1 蛋白酶标准曲线标准曲线公式：y=0.1005x 0.12373.3实验的基本方案根据大量文献查阅，综合分析，在酱油酿造工艺中传统最佳原料配比为：麸皮80% 面粉20% 水份70%。本课题在此配比方案下展开试验。3.3.1米曲霉在不同曲料pH条件下的酶活力在发酵过程中，起始pH的不同，会造成微生物产酶的不同。因此，本实验以米曲霉为试验菌种，对起始pH进行确定，选择范围为pH为49。故以配置pH 4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0六种发酵培养基，接入菌种，37，160r/min摇床培养24h后测定粗酶液酶活。在最佳温度下进行发酵培养，测定其产酶活力，确定最佳发酵pH。3.3.2培养温度对米曲霉产蛋白酶活力的影响将米曲霉种子接于文献查阅的传统配比种曲培养基中，在自然pH下，于温度分别于24、28、32、36，160r/min摇床培养24h后测定米曲霉的蛋白酶活力，并以此确定最佳发酵温度。3.3.3米曲霉在不同培养时间下的酶活力米曲霉的发酵时间也是酱油生产的一个重要的控制环节，在发酵过程中，随着时间的延长，曲霉菌的产酶活力也会发生变化。考虑到米曲霉产酶量，选取3个不同的发酵时间，40小时、44小时、48小时三个时间点测定蛋白酶活力，以确定最佳的培养时间。3.3.4米曲霉的替代原料培养原料配比：（参照组）麸皮80% 面粉20% 水70%酒糟部分替代麸皮的配比方案见下表3.2表3.2 酒糟部分替代麸皮进行培养NO.酒糟：麸皮培养时间1554024434843740544648773408449481010040114412484 实验结果与讨论4.1在不同初始pH下试验数据与讨论通过实验在pH49的不同初始酸碱度条件下，得出具体数据，见表4.1表4.1 不同pH值下米曲霉蛋白酶活力pH456789蛋白酶活力（U/g）9909071104.81405.11156.1880.7表4.1制作曲线分析如下，图4.1图4.1 不同酸碱度下蛋白酶活曲线图由上述图4.1结果可看出，蛋白酶对蛋白质的降解能力与其所处的pH环境有密切相关，此研究表明了米曲霉蛋白酶的综合活力与pH的关系和变化规律，更好的了解米曲霉的特性，有助于选择更合适生产的菌株。从图4.1可看出pH值在45都较偏低，pH在6的值上酶活力开始上升pH为7时达到最高峰，大于7的pH的环境下，酶活下降，所以可得出米曲霉的蛋白酶活力的最佳pH为7。4.2不同温度下进行试验的数据与讨论通过实验在不同温度条件下测定酶活，得出具体数据，见表4.2表4.2 不同温度下测定米曲霉蛋白酶活力温度（）24283236蛋白酶活力（U/g）108.4855.81163.5601表4.2数据分析见下图，图4.2图4.2 不同温度下蛋白酶活曲线由图4.2可看出，蛋白酶酶活力与其所处的温度有密切相关，温度在24时酶活比较低，随着温度的升高酶活呈正比例上升在32达到最高点，在32以上，酶活呈反比例下降。所以米曲霉产蛋白酶的最适温度为32。4.3在不同培养时间下试验数据与讨论通过实验在不同发酵时间条件下，得出具体的蛋白酶活力数据，见表4.3表4.3 不同发酵时间下的蛋白酶活力试验结果时间（h）404448蛋白酶活力（U/g）10891338.5998.6表4.3数据分析见下图图4.3 不同培养时间下的蛋白酶活力从图4.3可得，米曲霉的蛋白酶的活力和培养时间有密切的关系，在4044小时之间，蛋白酶活力成直线上升，44h后，酶活力下降，在44h达到最高峰，所以最佳培养时间为44小时。4.4替代原料的米曲霉酶活试验数据与讨论表4.4 传统与替代的对比参照数据酒糟：麸皮培养时间蛋白酶活力（U/g）外观参照组401089+生长旺盛441338.548998.65540993+生长旺盛441400.4481133.43740975.7+生长较好441302481020.97340867.5+生长一般44953.348927.810040224.1+生长较差44307.448233.9由表4.4可见，从米曲霉的生长表观指标来看，除全部替代组菌种生长明显较差外，其余各实验组菌体均生长良好。曲料疏松，内部白色菌丝生长旺盛，并密密着生黄绿色的孢子。从米曲霉生长周期来看，培养20小时左右，白色菌丝开始生长，再培养6-8小时，开始长出黄绿色孢子，至40-44小时，孢子生长旺盛，此时酶活最佳。从表结果可看出，废啤酒糟：麸皮=5:5配比组酶活最高。而啤酒糟：麸皮=3:7这一配比组，亦可用来制曲。从表4.4对照几组数据可以看出，废酒糟：麸皮=5:5配比组，废酒糟：麸皮=3:7配比组的蛋白酶酶活与对照组的酶活数据十分接近，由此实验结果可得知废啤酒糟部分替代原料产生酱油是可行的，在原料配比适当，不影响质量的前提下，从降低成本角度出发，可选择废啤酒糟：麸皮=5:5配比组为最佳方案。5 小结5.1结论 米曲霉菌种是酿造酱油品质优劣的关键，本文通过一系列的研究表明米曲霉的生命活动与其周围的环境条件有密切的相关性。只有在适宜的外界环境下，才能进行良好的生长繁殖，产生人类所需的各种酶。本课题的实验研究表明在传统最佳原料配比的基础上，研究表明，在单因子试验中得出，产蛋白酶的最佳ph为7，最佳温度为32，最佳培养时间为44小时。此外，在替代原料实验中，运用对照组和实验组的数据对照，可以看出，啤酒糟：麸皮=5:5与传统工艺培养的酶活基本一致，表明了用废啤酒糟替代原料的实践可行性。5.2本试验创新之处 随着人民生活水平的提高,对酱油质量要求越来越高,需求量越来越大,这与蛋白质资源缺乏的矛盾日益突出。利用啤酒废料生产酱油,既解决啤酒厂的污染问题,又开发了酱油生产的原料,使酱油质量提高,这对啤酒和酱油酿造工业的发展部互为有利。投资少、产出多、效益大、实用性强、有明显的经济效益和社会效益,利国利民,前景远大,意义深远。这在我国酱油生产中具有十分重要的意义。本课题在指导老师带领下，在不影响质量的前提下，考虑价格，研究米曲霉培养条件的同时结合废啤酒糟替代原料为研究方向，用啤酒糟来替代原料，为生产节约成本，创造更大的经济效益。实验表明其成品酱油基本符合国家二级酱油标准，若将这一方法成功推广，将对部分农副产品延伸产业链，降低酱油酿造成本、提高相关企业以及环境保护具有积极的意义。致 谢本论文是在导师胡文浪老师的悉心指导下完成的，值此论文完成之际，我谨向我的导师胡文浪表示衷心的感谢，尤为感谢胡老师在我实习期间对我学业上的悉心指导和生活上的热情关怀。他对事业坚忍不拔的追求、对科研倾情的全心投入、丰富的实践经验都给我留下了深刻的印象，值得我好好学习，相信会鼓舞我一生。同时，还要感谢曾给予我关心和帮助的浙江树人大学生物与环境工程学院的各位老师和同学。最后，对即将参加论文评议、评阅和对本论文提出宝贵意见的所有专家和老师表示诚挚的感谢。 舒琴情 2011年6月 参考文献1 刘金霞酱油酿造过程中米曲霉酶系的影响因素J江苏调味副食品，2002，(73)：10-112 王朋朋，常娟，王平，等蛋白酶和淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质分析研究M动物生产，2009，(21)：48-513 阚清华，汤斌，张庆庆，等沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化D安徽工程科技学院学报，2010，25(02)：26-294 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