松江鲈遗传多样性分析--本科毕业论文.doc

常熟理工学院毕业论文 本科毕业论文 题 目 松江鲈遗传多样性分析 系（院） 生物与食品工程系 年 级 2004 级 专 业 生物科学（师范）班 级 （2）班 学 号 060104210 学生姓名 鲍 峰 指导教师 郁建锋 职 称 讲师 论文提交日期 2008 年6月5日 21松江鲈遗传多样性分析摘 要本研究通过正交实验设计，分别从TagDNA聚合酶、Mg2 +、dNTPmix和引物4种PCR原料因素的3个水平，筛选并确立了松江鲈ISSR- PCR反应最佳体系，并通过温度梯度PCR，确立了适于的退火温度。结果表明，利用所建立的ISSR-PCR反应体系，对松江鲈样本进行检验，获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带。从77个ISSR引物中筛选出4个引物，对松江鲈2个群体（辽宁丹东野生群体、河北秦皇岛F1代人工繁育群体）共48个样品进行扩增，共得到44个清晰的扩增位点，其中多态性位点37个，多态位点百分率为84.09%。Popgene分析结果表明：丹东野生群体的遗传多样性水平(P=79.55%，h=0.2750，I=0.4100)略高于人工繁育群体的遗传多样性水平。松江鲈48个个体间最大的遗传距离为0.8389 ,个体间最小的遗传距离为0.0465，48个个体的平均遗传距离为0.3525；群体间的Neis遗传分化系数为0.0876；利用MEGA3.0软件构建了松江鲈48个个体的UPGMA系统树，松江鲈个体不以地理群体分别聚类，无明显分支。研究表明松江鲈种群的遗传多样性处于中等水平，2个群体的遗传分化尚未达到种群的分化水平。本文从分子遗传学入手，采用ISSR分子标记技术分别对松江鲈的野生与人工繁育群体进行遗传多样性研究，为其种质资源的科学管理、研究野生松江鲈的遗传背景和比较野生群体与人工繁育群体之间的遗传差异以及探讨由于辽东半岛沿岸带有较多松江鲈分布而产生的基因交流对2个群体遗传结构的影响提供了重要理论依据。关键词：松江鲈 正交试验 ISSR 遗传多样性 Study on the genetic diversity of Trachidermus fasciatus Abstract ISSR technique was used to assess the genetic diversity of two populations (24 wide individuals from the Yalu River, and 24 cultured individuals from the Qinhuang Island). In this study, orthogonal design was used to optimize ISSR amplification system on Trachidermus fasciatus Heckel in four factors (Taq DNA polymerase, dNTP, primer, Mg2+) at three levels respectively. Therefore best reaction systems could be established. And the optimal annealing temperature 51 for ISSR-PCR reaction was proposed by gradient PCR. The clear and polymorphic DNA bands were amplified repeatedly from 24 wild Trachidermus fasciatus Heckel by the established ISSR amplification system.The genetic diversity of 48 samples from two populations (24 wide individuals from the Yalu River, and 24 cultured individuals from the Qinhuang Island ) were studied using the inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. The ISSR bands can be differentiated highly in 4 primers after screening. A total of 37 discernible DNA fragments were observed, among which 44 fragments(84.09%) being polymorphic. The percentage of polymorphic(P), Neis gene diversity and Shannons index showed that the genetic variation of the wild population (P=79.55%, h=0.2750, I=0.4100) was a little higher than the cultured population. The average genetic distance was 0.3525 among the 48 individuals, the inter-populations Neis gene diversity coefficient were 0.0876, and UPGMA analysis showed that the 48 individuals were not divided into two clusters corresponding to the two populations. The results indicated that there was a middle level of population genetic structure with a considerable frequency of gene flow and the genetic differentiation among two populations hasnt reached the population level yet. These results provided a genetic background information and theory basis for researching the related germplasm resouce.Key words: Hapalogenys nitens; orthogonal design; ISSR; genetic diversity目录1.引言11.1 松江鲈生物学简介11.2 ISSR分子标记技术21.3 国内外松江鲈的研究进展32.材料和方法42.1 材料来源42.2 实验试剂42.3 实验器材52.4 实验方法52.4.1 基因组DNA的提取（SDS法裂解）52.4.2 DNA电泳检测62.4.3 引物初筛62.4.4 PCR反应体系的优化62.4.5 退火温度确定62.4.6 ISSR-PCR反应62.4.7 PCR产物检测62.4.8 数据分析73.结果73.1 松江鲈DNA的提取结果73.2 引物筛选和正交试验结果83.3 退火温度梯度PCR结果103.4 ISSR-PCR反应结果103.5 松江鲈群体遗传多样性分析123.6 松江鲈群体遗传变异和聚类分析134.讨论144.1采用正交法优化ISSR-PCR体系144.2松江鲈群体遗传多样性154.3松江鲈群体间的遗传变异174.小结174.展望18参考文献19致谢221 引言1.1 松江鲈生物学简介 松江鲈（Trachidermus fasciatus Heckel），属鲉形目（Scorpaeniformes）、杜父鱼科（Cottidae）、松江鲈属（Trachidermus）。松江鲈主要分布于西太平洋沿岸，及鲜半岛南岸的西部和日本九州西部，在我国分布甚广，从辽宁的鸭绿江口到福建的九龙江等临近海淡水江河下游的广大地区1。松江鲈个体较小，体长一般为1214cm。体形延长，头大，宽而扁平，躯干部近圆桶形，向后逐渐细小。体无鳞，具粒状和细刺状皮质突起，黄褐色，体侧具暗色横纹56条，侧线平直。松江鲈是一种生活于浅水底层的肉食性洄游鱼类，常栖息在与海水相通的湖泊或河流中，于淡水中育肥；生殖季节(122月) 自淡水作降河入海的生殖洄游；4月中旬幼鱼从近海游入淡水区域。卵为粘性，相互粘结为块状，呈淡黄色、桔黄色或桔红色。70年代以来，由于水质受到污染，河道内又大量兴建水利设施，破坏了它的原有生境，导致松江鲈濒临灭绝，现属于国家二级保护动物2。1.2 ISSR分子标记技术ISSR，inter simple sequence repeat的简写，即简单重复序列间扩增，是近年来发展起来的一种新的分子标记。ISSR技术是根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计单一引物，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增。该技术在SSR序列的5或3末端加上24个随机选择的核苷酸作为引物，如：5端的引物为BDDA(CA)7，3端的引物为(CA)8RY，以引起特定序列位点的退火，降低其他可能靶标退火的数目。该策略的优点是在基因组上只有与锚定的核苷酸匹配的那些位点才能被靶定，因而避免了引物在基因组上的滑动，可提高PCR扩增反应的专一性35。ISSR-PCR技术最早是Zietkiewicz61994年提出的一种简单重复序列间扩增多态性分子标记。它是以PCR技术为基础，利用真核生物基因组中广泛存在的SSR来设计引物，无需预先克隆和测序，从而对位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR 扩增，扩增产物经电泳分离获得多态性图谱。ISSR又依引物在5或3端加锚定碱基与否而分为锚定简单重复序列间扩增(anchored inter simple sequence repeat，ASSR) 和非锚定简单重复序列间扩增(Nonanchored inter simple sequence repeat)，亦称MP - PCR(microsatellite primed PCR)3。ISSR技术需经过多次预实验选择出最佳的引物和实验条件，才能更好的得出实验结果，便于分析。ISSR标记无需知道序列的信息，可检测到微卫星的高度多态性； 同时引物较长，PCR条件更为严谨，能快速扫描对应的靶标区域，一旦扩增条件优化，由琼脂糖凝胶电泳即产生可读性信息，甚至是对于种内变异的高度多态性。ISSR技术作为一种新型的分子遗传标记，结合了RAPD和SSR的优点：引物设计是根据几个核苷酸为单位多次重复的DNA序列，无需预先克隆和测序微卫星的侧翼序列；模板需要量极少；ISSR标记蕴含了大量的遗传信息，可以检测到基因组中许多位点的差异，可以揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多态性；其退火温度高且加入甲酰胺，大大降低了非特异性扩增的产生，得到的信息更准确；实验成本低，操作简单，特异性强，比RAPD更有针对性；实验稳定性较高。ISSR技术的缺点：ISSR技术反应条件易受各种因素的干扰，如模板DNA浓度、引物、温度、Taq 酶、dNTP以及Mg2 +的浓度等都能影响ISSR的结果，所以各种反应参数必须事先优化选择；ISSR标记大多为显性标记，不能提供检测位点的纯合与杂合状态5。 ISSR是一种在PCR中直接使用微卫星序列进行DNA扩增的分子标记，具有如下特点：1.扩增基因组DNA，适用于任何富含SSR重复单元和SSR广泛分布的物种，可同时提供多位点信息和揭示不同微卫星座位个体间变异的信息；2.为显性标记，符合孟德尔遗传规律；3.遗传多态性高。ISSR技术采用了较长的引物，因此引物具有更强的专一性，与模板结合的强度提高，降低了杂带的干扰，随之提高了实验结果的可重复性；4.无需知道任何靶标序列的SSR 背景信息。用于ISSR分析的引物可基于任何在微卫星位点发现的SSR重复单元，并且侧翼靶标简单序列重复的任何一端均能够锚定基因组序列6。ISSR技术的步骤主要包括DNA提取、PCR扩增、电泳检测、观察结果及统计分析。这种技术的DNA提取一般用SDS法或者CTAB法，DNA一般不需要纯化。PCR扩增和RAPD7类似，每个引物不适合于所有的物种，不同引物所需的条件也不相同。筛选出多态性强，可重复性好的引物是整个实验成功的关键。ISSR引物国内有上海生工开发的以小麦基因组为基础的成套引物试剂盒，国际上有加拿大哥伦比亚大学生产的引物试剂盒。电泳一般使用的是琼脂糖浓度为1.52.0%，或聚丙烯酰胺6.0%，使用硝酸银或EB染色。最后结果的统计分析是将电泳图上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置无带和不易分辨的弱带记为“0”，建立原始距阵。计算每个引物的多态性百分数(多态性谱带数/总谱带100%)。 ISSR标记技术具有DNA样品用量少、操作简单、实验成本低等优点，且实验重复性好、信息量大、多态性高，是一种非常理想的检测物种内遗传变异的分子标记5。该技术能够揭示比RFLP，RAPD，SSR更多的多态性，可用引物进行扩增，无需预先克隆和测序，有较强的稳定性和重复性，现已被广泛用于品种鉴定7、多样性分析8,9、指纹图谱的构建10等研究中。ISSR技术在植物上应用较多，在动物育种中的应用较少，尤其在鱼类群体遗传学研究方面。迄今为止，仅见许广平等报道的ISSR标记在黄海南部小黄鱼群体遗传多样性研究11，刘云国等报道的ISSR在牙鲆分子遗传学上的研究12及王世锋等报道的ISSR分析斜带髭鲷野生与养殖群体遗传结构13。1.3 国内外松江鲈的研究进展 19世纪Heckel14对菲律宾的松江鲈进行了形态学研究，将其定名为Trachidermus fasciatus；20世纪50年代，李思忠15在黄渤海鱼类调查报告中对其分布作了概述；邵炳绪等（1980）16在松江鲈繁殖习性的调查研究一文中对松江鲈繁殖洄游、产卵场作了报道，对松江鲈的胚胎发育和幼鱼形态作了描述和研究；李堃宝等（1984）17对松江鲈一生中所经历淡水和海水两种不同生境后消化器官的组织学变化进行了研究，为松江鲈的人工繁育和其他降海繁殖鱼类的研究提供参考；周明等（1996）18通过对松江鲈仔鱼的消化道进行从口腔到尾部的连续切片，观察其消化道的组织学结构，为解决松江鲈仔鱼开口时间与选择合适开口饵料提供理论依据。韦正道等（1997）19研究了温度、盐度、饵料、光照等因子对松江鲈生长的影响；日本N. Takeshita等20在松江鲈胚胎发育和仔鱼生物学方面开展了研究。王金秋（1999）21从松江鲈的生态学和繁殖生物学方面综述了其研究进展。王金秋等（2001）22采用垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳，对松江鲈的7种组织进行了6种同工酶的电泳研究，并对各种酶的同工酶位点及酶谱表型进行了分析。王金秋等（2002）23采用垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳,对鸭绿江流域松江鲈天然种群的8种同工酶的20个基因座位进行分析，讨论了松江鲈的种质资源状况及与生态环境的关系。王金秋等（2004）24通过对上海松江鲈驯养繁育基地松江鲈自然产卵受精及人工授精所得受精卵的群体试验观察，描述了受精卵的发育过程，研究结果为松江鲈的大规模育苗生产提供必要的理论指导。由此观之，目前对松江鲈的研究主要是从生理、生态学、繁殖习性 、生活习性、组织学、环境因子对生长的影响、染色体核型分析、人工繁殖、胚胎发育及同功酶分析等方面进行的。总的看来, 松江鲈的基础研究工作已趋成熟，但其遗传学的研究仅见染色体组型分析25和同工酶分析23,24。本研究从分子遗传学入手，采用ISSR分子标记技术分别对松江鲈的野生与人工繁育群体进行遗传多样性研究，进一步研究了野生松江鲈的遗传背景，查明了其野生群体与人工繁育群体之间的亲缘关系，并探讨了由于滥捕而导致的群体小型化对野生种群以及人工繁育对养殖群体遗传结构的影响。对于松江鲈的生物学，国内外学者对松江鲈的生态习性、人工繁殖和越冬、洄游的组织生理学、病害及遗传等方面进行了研究。根据现有的情况，目前应对松江鲈的分布区进行保护，对现有分布区进行调查，加大繁殖生物学的研究2。2 材料和方法2.1 材料来源用于本实验的松江鲈的2个群体样本分别采自辽宁丹东和河北秦皇岛，其中辽宁丹东的松江鲈为野生群体，河北秦皇岛群体为F1代人工繁育群体，样品鱼采回实验室后，立即保存于95的乙醇中，实验备用。本研究中两个群体分别取24个个体用于ISSR检测。丹东松江鲈采样点秦皇岛松江鲈采样点图1 松江鲈采样点分布图Fig.1 Map of sample collecting localities2.2 实验试剂表1 主要药品名称及厂家Tab1. Names and manufacturers of the Major reagent名称厂家无水乙醇（分析纯AR）上海试一化学试剂有限公司异戊醇（分析纯AR）中国医药（集团）上海化学试剂公司NaCl （分析纯AR）淮安化工厂乙酸中国上海试剂一厂EDTA（乙二胺四乙酸二钠）中国医药（集团）上海化学试剂公司盐酸 （分析纯AR）宜兴市腾兴化工有限公司饱和酚（分析纯AR）Auyoo Biotechnology.luc续表1琼脂糖上海宝生物工程（大连）有限公司TaqDNA聚合酶上海宝生物工程（大连）有限公司DGL2000 NDA Marker北京鼎国生物技术有限责任公司2.3 实验器材表2 主要仪器的名称、型号及厂家Tab2. Names, models and manufacturers of the Major equipment名称型号厂家电子天平EA604A上海精天电子仪器有限公司pH计PHSJ-1A上海精密科学仪器有限公司台式高速离心机TGL-16G上海安亭科学仪器厂稳压稳流电泳仪DYY-6B北京六一仪器厂指针式电热恒温水浴锅HHS-4上海电子光学科技研究所手提式压力蒸汽灭菌锅YXQ.SG41.280上海华线医用核子仪器有限公司UVP凝胶成像仪BiospectrumAC76-0101-22UVPGRADIENT梯度PCR仪TgradientBiometra高速冷冻离心机3K30上海安亭科学仪器厂2.4实验方法2.4.1 基因组DNA的提取（SDS法裂解）剪取0.05g0.1g左右的松江鲈肌肉，去鱼皮，放在蒸馏水中漂洗约1h，每隔10min左右换一次水。把样品剪碎，放入1.5ml的离心管中，并用解剖针的粗头将其捣碎，加入500l 12%SDS裂解液，5 l 蛋白酶K（20mg/ml），颠倒混匀。56水浴锅中水浴过夜。在裂解过夜后的样品中再加入5l 蛋白酶K，56水浴1 h以上（裂解液澄清，表示消化完全）；将离心管放入4高速冷冻离心机内，12000rpm离心10 min；取上清液于新的离心管中，加入500l预冷苯酚/氯仿/异戊醇( 25 ：24 ：1 )，缓慢颠倒混匀10 min，12000 rpm离心10 min；取上清液（水相与有机相之间含蛋白质）于新的离心管中；重复一次；加等体积氯仿/异戊醇( 24 ：1) ，缓慢颠倒混匀10 min，12000 rpm离心10 min；取上清液，加2倍体积无水乙醇( -20预冷) 沉淀，-20放置30min以上，12000 rpm离心10 min；弃上清液，加70%酒精200l洗涤沉淀，4 12000 rpm离心5 min，弃上清液，重复一次。干燥后加50l TE和1lRNA酶（10 mg/ml），56水浴溶解15min。2.4.2 DNA电泳检测配制0.8%的琼脂糖凝胶，在80100V的稳压下电泳1h左右。然后在凝胶成像系统下选取条带清晰的DNA作为模板。2.4.3 引物初筛本实验所用的ISSR引物为加拿大British Columbia大学提供的成套引物，引物合成由南京生兴公司合成。实验使用1个松江鲈个体的基因组DNA模板，用77种ISSR引物进行PCR扩增，从中筛选出扩增条带较多，信号强，背景清晰的引物。PCR反应体系为：总体积20ul，其中模板DNA 1l（约30ng），Mg2+ 1.6 l（浓度为2.0mmol/L）；4种dNTP 1.6 l（各浓度为0.2mmol/L）；Taq酶用量为2 l（0.5U/ l）；引物1l（浓度为0.25mol/L）。扩增程序为：先94预变性5min，再94变性45 sec、53复性45sec、72延伸1.5min，共40个循环，72延伸10min。2.4.4 PCR反应体系的优化PCR反应体系由10PCR Buffer、dNTPmix、Mg2+、TaqDNA聚合酶、Primer、DNA模板等6部分组成，各个组份都能影响PCR结果的好坏。在本实验中采用L9 (34 )正交试验设计，对Mg2 + 、dNTPmix、Primer、Taq DNA聚合酶进行4因素3水平筛选，为增加可信度，设2次重复，方案如表3。根据表3制备总体积为20l的PCR反应体系，除表中变化因素外，每管中还含有1PCR buffer和30 ng模板DNA，引物为初筛实验中所选出的引物。2.4.5 退火温度确定 根据正交试验结果，选择合适的反应体系，结合引物的退火温度设定梯度PCR的温度范围为4862。2.4.6 ISSR-PCR反应通过正交试验选出每个引物的最适扩增条件，选取2个群体（辽宁丹东野生群体、河北秦皇岛F1代人工繁育群体）共48个松江鲈个体的 DNA 模板进行PCR扩增。2.4.7 PCR产物检测扩增反应结束后，PCR产物在1. 2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶中含0. 05%的溴化乙锭，扩增片段大小通过DGL2000 Marker比较得以记录，电极缓冲液为1TAE，电压5 V / cm，电泳结束后在凝胶图像分析仪上观测分析并照相。表3 松江鲈ISSR-PCR正交试验Tab3. Orthogonal design with L9 (34) for ISSR-PCR序号因 素Taq 酶（U/20l）dNTP(mol/L)引物(mol/L)Mg2+(mmol/L)10.51500.252.020.52000.502.530.52500.753.041.01500.503.051.02000.752.061.02500.252.571.51500.752.581.52000.253.091.52500.502.02.4.8 数据分析将ISSR电泳结果记录后进行人工读带，同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，属于同一位点的产物，按有带的记为1，无带的记为0的格式输入计算机，构成ISSR表型数据矩阵。对群体遗传参数的统计基于以下两个假设：1松江鲈群体基本处于Hardy-Weinberg平衡；2)统计条带时认为电泳迁移率相同的条带是扩增基因组上相同DNA片段的产物。采用Popgene1.32软件对2个群体间和每个群体个体间分别进行遗传参数分析。分别计算了多态位点百分率(P，percentage of polymorphic bands)、观测等位基因数(na，number of alleles per locus)、有效等位基因数(ne，effective number of alleles per locus)、Shannons信息指数(I，Shannons information index)、群体总基因多样性(Ht，total gene diversity)、群体内基因多样性(Hs，gene diversity within populations)、各群体间的遗传分化指数(Gst，coefficient of population differentiation) (Gst= 1-Hs/Ht)、基因流(Nm，gene flow，Nm = 0.5(1-Gst)/Gst)、Neis基因多样性(h)、Nei的遗传距离(D，genetic distance)和遗传相似系数(S，genetic similarity)，通过MEGA3.0软件构建UPGMA系统树。3结果3.1 松江鲈DNA的提取结果本实验是采用常规的SDS法对鱼肌肉组织进行裂解，再用酚仿抽提法提取样品鱼基因组DNA的，酚氯仿法是提取动物基因组DNA最常用的方法，这种方法操作步骤复杂，所用试剂较多，有机酚对人体也有伤害，操作要按规定。鱼类所含的蛋白质较多，在样品鱼裂解过夜后，再加入适量蛋白酶K，进一步裂解1小时以上。抽提DNA的过程中，用大口径的枪头吸取上清液，用苯酚/氯仿/异戊醇( 25：24：1 )抽提2次，氯仿/异戊醇( 24：1)抽提一次。水浴TE溶解DNA。0.8琼脂糖凝胶电泳检测到的松江鲈肌肉组织的基因组DNA，分子量大小基本一致，条带清晰，无拖尾现象；泳道7、11、12的点样孔可能有残留的糖类等杂质；泳道6、7、8、9有弥散现象（图2）。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12图2 SDS法提取松江鲈DNA电泳图Fig2. Electrophoresis of DNA for SDS extraction method3.2 引物筛选和正交试验结果 通过引物初筛实验，从上海生工合成的77个引物中筛选出扩增条带较多，信号强，背景清晰的4个用于ISSR扩增，引物编号及序列见表4。PCR的扩增结果受多种因素的影响，尤其是受到Mg2+、dNTP、primer和DNA聚合酶等因素综合作用的影响。从图3、4正交试验的结果可以看出，在9个处理组合中，由于4种因素不同浓度组合不同，其扩增结果存在着明显的差异。泳道1、2、8条带强度较弱且多态性低，尤其泳道1，几乎扩不出条带，其原因可能为体系中个浓度过低所致。泳道5、9条带清晰，多态性高。通过比较，以特异谱带多态性高、背景干扰低、主带清晰、副带明显为原则，同时结合试验成本因素，确定ISSR - PCR的最佳反应体系为：20 l反应体系中含有Mg2 + 2.5 mmol/L、dNTP 250 mol/L、引物0. 25 mol/L、Taq DNA聚合酶1 U。100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9图3 引物61正交实验PCR扩增结果（M:DNA marker DGL 2000,下同）Fig3. Amplification results of primer 61 by orthogonal design(M:DNA marker DGL 2000;Lane 1-9:Group 1-9)100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9图4 引物63正交实验PCR扩增结果Fig4. Amplification results of primer 61 by orthogonal design100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M图5 退火温度梯度实验注：112温度分别为：48、48.3、49.3、50.8、52.5、54.2、55.8、57.5、59.2、60.7、61.7、62Fig5. The effect of annealing temperatures on ISSR-PCR amplificationLane 1Lane12: 48,48.3,49.3,50.8,52.5,54.2,55.8,57.5,59.2,60.7,61.7,623.3 退火温度梯度PCR 结果梯度PCR 结果（图5）显示，退火温度较低时（48. 048.3 ），谱带背景较高且条带不清楚。随着退火温度升高（49. 362. 0 ），扩增条带逐渐减少，当退火温度为50. 8 时扩增背景较低，主带清晰，温度进一步提高，条带强度和数量减少，并条带不清，主要是退火温度影响了引物和模板的结合，因此确立退火温度为51. 0 。3.4 ISSR-PCR反应结果本实验从77个引物中筛选出4个ISSR引物，对松江鲈2个群体的48个DNA样品进行PCR扩增，4个ISSR引物扩增出的条带数目913不等，片段大小在0.22.5 kb之间（见表4），共扩增产生了44个可统计的条带，其中具有多态性的条带37条，多态位点比例84.09%。丹东松江鲈野生群体和秦皇岛松江鲈人工繁育群体的平均多态位点百分率分别为79.55%和75%（表5）。100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M图6 引物8在松江鲈人工繁育群体中的ISSR扩增结果(M:DGL2000 DNA Marker,下同)Fig6. The ISSR pattern amplified by primer 8 in cultured populations of Trachidermus fasciatus.100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M图7 引物8在松江鲈野生群体中的ISSR扩增结果Fig7. The ISSR pattern amplified by primer 8 in wide populations of Trachidermus fasciatus .100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M图8 引物58在松江鲈人工繁育群体中的ISSR扩增结果Fig8. The ISSR pattern amplified by primer 58 in cultured populations of Trachidermus fasciatus .100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M图9 引物58在松江鲈野生群体中的ISSR扩增结果Fig9. The ISSR pattern amplified by primer 58 in wide populations of Trachidermus fasciatus .100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M图10 引物61在松江鲈人工繁育群体中的ISSR扩增结果Fig10. The ISSR pattern amplified by primer 61 in cultrued populations of Trachidermus fasciatus.100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M图11 引物61在松江鲈野生群体中的ISSR扩增结果Fig11. The ISSR pattern amplified by primer 61 in wide populations of Trachidermus fasciatus .100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M图12 引物63在松江鲈人工繁育群体中的ISSR扩增结果Fig12. The ISSR pattern amplified by primer 63 in cultured populations of Trachidermus fasciatus .100bp250bp500bp750bp1000bp1600bp2000bp19325bp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M图13 引物61在松江鲈野生群体中的ISSR扩增结果Fig13. The ISSR pattern amplified by primer 63 in wide populations of Trachidermus fasciatus .3.5 松江鲈群体遗传多样性分析2个群体的Neis基因多样性值分别为0.2750和0.2471（见表6），Shannons遗传多样性指数分别为0.4100和0.3725，即松江鲈丹东野生群体的遗传多样性水平略高于秦皇岛人工繁育群体。松江鲈两个群体总的Neis基因多样性和Shannons 信息指数为0.2872和0.4274。表4 4个ISSR引物在48个松江鲈个体间的扩增情况Tab4. The ISSR primer sequence ,the amplified bands,and the percentage of polymorphism in 48 individuals of Trachidermus fasciatus引物编号序列片段大小(kb)位点数多态位点数P(%)HI8(ATG)60.252.0131292 0.2753 0.4226 58(AG)8GA0.201.610660 0.1747 0.2627 61(AG)8GT0.302.09889 0.3795 0.5480 63(AG)8CT0.402.5121192 0.3246 0.4794 平均/119.2583.22 0.2885 0.4282 表5 2个松江鲈群体的ISSR遗传多样性比较分析Tab. Comparison of genetic diversity between the wide and cultured populations revealed by ISSR analysis群体个体数多态位点数多态位点百分率%平均遗传距离Neis基因多样性Shannons 信息指数野生群体243579.55 0.3436 0.2750 0.4100 人工繁育群体24 33 75.000.3021 0.2471 0.3725 整体水平483784.090.3525 0.28720.4274表6 2个松江鲈群体遗传变异分析Tab6. Statistical analysis of genetic variation in two populations个体数总基因多样性（Ht）群体内基因多样性(Hs)基因分化系数(Gst）基因流（Nm)480.3255 0.3065 0.0876 5.4152 3.6 松江鲈群体遗传变异和聚类分析根据Ht和Hs计算出2个松江鲈群体间的分化系数Gst=0.0876，由Gst所推导出的群体之间的Nm为5.4152。通过软件Popgene1.32进行分析，得到松江鲈48 个个体间的遗传距离P值，任意两个个体间的P 值在0.04650.8398之内，平均遗传距离为0.3525，采用MEGA3.0软件构建松江鲈48 个体的UPGMA系统树（图14）显示其不以地理群体分别聚类，无明显分支。图14 基于ISSR扩增结果构建的松江鲈UPGMA系统树(124：野生群体，2548：人工繁育群体)Fig14. UPGMA phylogenetic tree of Trachidermus fasciatus based on ISSR patterns (124:wide population,2548:cultured population)4 讨论4.1 采用正交法优化ISSR-PCR体系本文通过Taq 酶、Mg2+ 浓度、dNTP、引物四个主要因素对PCR结果的影响8，利用正交试验设计方法，初步建立并优化了松江鲈ISSR 标记的PCR 反应体系。在这四个主要因素中，TaqDNA聚合酶是保证PCR成功的先决条件，其量要适当，过低就会造成扩增条带过少，甚至得不到结果，降低了PCR的灵敏度，但又不能过多，否则会降低整个PCR反应的特异性，同时会出现大量的弥散片断26,27。由于TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，因此在反应体系中Mg2+浓度十分重要，Mg2+ 浓度过高，PCR反应特异性降低，出现非特异性扩增；浓度过低则会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。有研究报道2830Mg2+ 最终反应浓度还会受到体系中其它成分，尤其是dNTP 的影响，因此，Mg2+浓度的确定应同时考虑这些因素。dN