石蜡切片免疫组化染色步骤[公众微信号：bioworlde].doc

石蜡切片免疫组化染色步骤默认分类 2009-10-16 16:28:14 阅读149 评论0 字号：大中小订阅 三步法（以SP试剂盒为例）? 石蜡切片脱蜡至水。? 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。? 3%H2O2室温孵育510分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟3次。? 510%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育12小时或4过夜。? PBS冲洗，2分钟3次。? 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37孵育1030分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育1020分钟。? PBS冲洗，2分钟3次。? 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37孵育1030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育1020分钟。? PBS冲洗，2分钟3次。? 显色剂显色（DAB或AEC）。? 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）? 石蜡切片脱蜡至水。? 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。? 3% H2O2室温孵育510分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟3次。? 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育12小时或4过夜。? PBS冲洗，2分钟3次。? 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37孵育20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟3次。? 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37孵育2030分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟3次。? PBS冲洗，2分钟3次。? 显色剂显色（DAB或AEC）。? 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。石蜡切片免疫组化染色常见问题处理无/弱染色默认分类 2009-10-16 16:26:05 阅读125 评论0 字号：大中小订阅 织固定 新鲜组织应及时固定，一般推荐使用10%中性福尔马林固定6-24小时。如果固定不够可能会造成蛋白弥散或降解，出现阴性染色或周边阳性中心阴性染色；如果过固定可能会造成蛋白空间结构交联过度，即使经过抗原热修复也难以出现阳性结果，或出现中心有阳性周围阴性的染色结果。可以将Vimentin作为检验标本的固定情况的指标，因为Vimentin蛋白抗原决定簇对醛类比较敏感，且Vimentin广泛分布于几乎各种组织中，如血管内皮细胞和间质细胞均阳性，所以可以参考Vimentin的染色结果来判断组织固定情况。烤片推荐烤片条件为56-60 1-2小时或过夜。温度过高会破坏抗原决定簇，产生假阴性。一抗储存条件是否合适，有些抗体（如Santa Cruz公司的抗体）不能冷冻保存；避免抗体反复冻融；使用浓度过低；孵育时间过短；试剂是否在有效期内。随着储存时间延长，抗体的效价也会发生变化，应及时调整。检测系统所使用的检测系统是否和一抗匹配，通用型检测系统只能检测小鼠和兔来源的抗体，不能用于山羊来源的一抗的检测；如果检测系统中包含两种以上的试剂，注意使用顺序是否正确；注意检测系统的灵敏度，一般而言Polymer二步法检测试剂灵敏度高于SP三步法检测试剂，同等类型的检测系统中辣根酶检测系统的灵敏度是碱磷酶检测系统的四倍，目前我公司所售的检测系统中PV-9000是灵敏度最高的产品，如果所检测的抗原含量较低，必须考虑这些因素。显色系统所使用的显色剂是否是检测系统中标记酶的底物，一般辣根酶用DAB（棕黄色）和AEC（红色）显色，碱磷酶用BCIP/NBT（蓝色）和AP-red（红色）显色，其中DAB的灵敏度最高，是AEC的四倍。封片选择合适的封片剂至关重要。目前市售的封片剂分为两大类，一类是醇溶性的（如中性树胶、香味封片剂），一类是水溶性的（如GVA）。如果底物所产生的终末产物溶于有机溶剂（如AEC、AP-red等），就不适用醇溶性封片剂封片，否则会褪色乃至出现阴性结果。其他步骤组织切片上残留的PBS/TBS冲洗液过多，进一步稀释了抗体；蛋白含量过低或无表达，应设立阳性对照片；复染过深导致遮盖阳性信号，尤其是核阳性的抗体；某些抗原决定簇对H2O2敏感，如CD4，应用低浓度的H2O2或省略。石蜡切片免疫组化染色常见问题处理非特异性背景染色默认分类 2009-10-16 16:22:41 阅读49 评论0 字号：大中小订阅 内源性生物素 生物素是一种维生素，作为一种辅酶参与羧化反应。在人体组织中，绝大多数生物素与线粒体丙酮酸盐羧化酶相关，因此，富含线粒体的细胞具有丰富的内源性生物素，如肾脏、肝脏以及一些肿瘤细胞。如果应用生物素/卵白素检测系统，由于卵白素可以和生物素不可逆地强结合，势必会造成非特异性染色，热介导的抗原修复可以显著“复活”内源性生物素，所以更加加剧这种非特异背景染色。解决的方法除了换成非生物素的检测系统外，还可以用以下简单的方法封闭内源性生物素。首先用蛋清中的卵白素（一个鸡蛋清加入到100ml的PBS中）封闭内源性生物素，再用5%奶粉作为生物素替代品（5克奶粉加入100ml的PBS/TBS中）来封闭卵白素中未结合的位点，冲洗后即可加一抗。内源性过氧化物酶一般红细胞和嗜中性粒细胞中过氧化物酶含量比较高，会造成非特异性染色。灭活内源性过氧化物酶的方法：0.3%-3%H2O2，用PBS（pH7.4）或蒸馏水或甲醇配制。冲洗步骤免疫组化染色步骤中包括多次冲洗过程，任何一步出现冲洗不干净的问题，都有可能产生背景染色。解决的方法可以在冲洗液中加入吐温20，一般在1000ml的冲洗液中加入0.2ml的吐温20即可。鼠单抗用于鼠组织由于小鼠组织中可能含有内源性IgG，所以检测系统就会识别这些抗体，造成非特异性染色。解决的方法要么封闭内源性IgG，要么直接使用商品化的Mouse-to-Mouse检测试剂盒。