中国药典2010年版高效液相色谱法

高效液相色谱法,一概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：,一优点,高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cmmin-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。,对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分,高效液相色谱法在中国药典2005年版的应用,高效液相色谱法在中国药典2005年版的应用 高效液相色谱法用于含量测定的品种达479种，涉及518项；气相色谱法用于鉴别和含量测定的品种有47种。,药典二部品种中采用高效液相色谱法的品种有848种(次)，较2000年版增加566种(次),其中复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法，采用高效液相色谱法作含量测定的品种增订223种；增订红外鉴别的品种达70种；增订溶出度和含量均匀度检查的品种分别为93种和37种；增订有关物质检查的品种226种，系统适用性要求也更为合理；,二原理,高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。,三 1.对仪器的一般要求,所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定.常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料,用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。,注样量一般为数微升，除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时,所用流动相应符合紫外分光光度法（附录 ）项下的对溶剂的要求。,正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变, 以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。,色谱条件与系统适用性试验,按各品种项下的要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。,（1） 色谱柱的理论板数,色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(Wh/2)，按n=5.54(tRWh/2)计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长，载体性能，色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。,(2) 分离度,定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： 2(tR2 -tR1 ) R W 1W 2 式中 tR 2 为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR 1 为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2 为此相邻两峰的峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。,(3) 拖尾因子,为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子(T)是否符合各品种项下的规定,或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。除另有规定外， (T) 应在0.951.05之间。,四重复性,取各品种下的对照溶液，连续进样5次，除令有规定外，其峰面积测量值相对标准偏差应不大于2.0。也可按照规定 配制相当于80、100和120的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别注样3次,计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0。,3.测定法,定量测定时，可根据样品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但用归一法或内标法测定杂质总量时，须采用峰面积法。,(1)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量,按各品种项下的规定,精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： A s cs 校正因子（f） A r mr,(2)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量,按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：,（3）加校正因子的主成份自身对照法 （4）不加校正因子的主成份自身对照法,（5）面积归一化法,由于峰面积归一化法测定误差大，因此本法 只能通常用于粗略考察供試品中的杂质含量，除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查，方法是测量各杂质峰面积和色谱图上除溶剂外的总色谱 峰面积，计算各峰面积及其之和占总峰面积的百分率。,高效液相色谱法常见的问题及注意事项,现象1：色谱峰未分开 判断-排除方法 （1）色谱柱分离度低，柱效不高-（1）选择高效柱或重新装柱 （2）色谱柱或色谱条件（溶剂、检测器、温度、流速、柱子等）选择不当 -（2）再行试验选择最佳色谱分离条件 （3）柱子过载-（3）减少进样量或采用“再循环分离”技术,（4）流动相流速过大-（4）适当降低流速 （5）柱中填料流失过多，增加了柱外效应-（5）更换色谱柱 （6）进样技术不佳-（6）提高进样技术,现象2：峰展宽,判断-排除方法 （1）进样体积过大，样品过浓-（1）减小进样体积，稀释样品 （2）柱外体积过大 -（2）减小检测池等体积 （3）流动相粘度过高-（3）增加柱温，采用低粘度流动相 （4）保留时间过长-（4）增加强溶剂浓度，或采用梯度,现象3：基线漂移,判断-排除方法 （1）溶剂贮槽污染-（1）清洗贮槽装入新的流动相冲洗柱子 （2）前次分离样品中的强吸附组分从柱上洗脱-（2）在分离之前用强流动相从柱中洗脱所有的组分：使用溶剂梯度清洗柱子 （3）由微粒造成柱入口、进样阀、柱入口的部分堵塞-（3）清洗进样系统和柱入口过滤片,（4）溶剂分层-（4）采用合适溶剂 （5）泵输出的缓慢改变 -（5）检查流量，使室温恒温 （6）检测器污染 -（6）清洗检测器 （7）柱污染或“流失”-（7）再生或更换（再生不成功）柱子：使用预柱 （8）检测器温度变化-（8）使系统恒温 （9）光源故障 -（9）更换光源灯,现象4：基线有噪声,判断排除方法 （1）工作站与检测器信号输出接触不良- - - - （1）检查并接好信号线 （2）电压不稳-（2）采取稳压措施 （3）接地线不好 -（3）应改用良好的接地线,（4）泵中有气泡，泵压不稳-（4）赶除聚集于泵头内的气泡 （5）溶剂纯度不高，背景吸收强，透光差- - - （5）提纯溶剂或选纯度比较高、透光性好的溶剂作为流动相 （6）检测池污染-（6）清洗检测池 （7）示差折光检测器液槽漏 -（7）检修或更换液槽,（8）用RI检测时，环境温度变化太大-（8）应采用恒温或温度变化不大的环境作试验 （9）样品池或参比池中有气泡-（9）突然加大流量赶出气泡，在检测器出口加限流器适当增大池内压 （10）检测器光源故障-（10）更换光源 （11）紧固件或连接件泄漏-（11）拧紧或更换紧固件 （12）进样装置部分堵塞-（12）检修进样器并清洗,现象5：峰重现性差,判断-排除方法 （1）注射器针头太长，样品液部分漏掉 -（1）选用合适的针头 （2）进样技术欠佳，表现为峰面积忽大忽小-（2）认真掌握进样技术使重复性误差小于5% （3）管路有泄漏处 -（3）检查并修复 （4）仪器没有充分稳定-（4）对仪器再次预热稳定冲洗平衡,（5）实验条件发生变化-（5）使实验条件尽可能一致 （6）注射器有泄漏或堵塞现象-（6）修复或更换注射器 （7）进样速度不一致-（7）掌握一样的进样速度 （8）进样阀开关不灵，阀门没充分打开- （8）检查维修进样阀开关,高效液相色谱法常见问题探讨,1 当使用带有表面活性剂的的流动相后，如何冲洗色谱柱 应用纯水以1 ml/min冲洗30分钟，在用10、20甲醇冲洗30分钟，最后再用高浓度的甲醇水冲洗。 2 什么情况下加一预柱 分析生化样品，血液制品时，最好加一预柱。,3.甲醇和乙睛的截止波长是多少， 应用意义是什么 甲醇和乙睛的截止波长分别为210nm与 190nm左右，在流动相中，增大甲醇和乙睛的比例，即增加有机相的比例，能使出峰面积加快，但同时减少分离度。,4 高效液相色谱法检测有关物质时的最低检出限要求至少为多少，如达不到，有何办法或措施 至少为0.1，如达不到，可采取不断稀释样品溶液的浓度。 5检测有关物质时，自身对照和归一化法的检测结果什么情况下两者基本一致，两个各自的应用价值是什么 如果检测物质线性关系良好，稀释100倍，峰面积还呈线性关系的话，归一化法和自身对照法所得的结果是一致的，（最多差0.02左右），但如果稀释100倍，峰面积不呈线性关系的话，那么两法所得的结果，将有所差异，如此采用归一化法，将得不到正确的结果，因为此时峰面积不能准确的表示质量，而采用自身对照则可避免该情况的发生。,6最低检测限的意义 最低检测限虽然是个绝对值，但其真正意义确是相对值，即相对于供試品溶液的中样品浓度的多少而言，设定杂质总量不得过1.0。最低检出限通常许达到对照溶液浓度的十分之一到五十分之一。 7使用对照品外标一点法测定时的关键是什么 使用对照品外标一点法测定时的关键是尽量保持样品溶液和对照品溶液的浓度一致。,维生素B6的测定高效液相色谱法,本方法采用高效液相色谱法测定维生素B6注射液中维生素B6（C8H11NO3）的含量。 供试品制成流动相溶液，进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长291nm处检测维生素B6吸收值，计算出其含量。,试剂,1. 甲醇 2. 0.04%戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节pH值至3.0） 3. 冰醋酸,仪器设备,1. 仪器 1.1 高效液相色谱仪 1.2 色谱柱 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按维生素B6峰计算不低于4000。 1.3 紫外吸收检测器,2. 色谱条件 2.1 流动相：0.04%戊烷磺酸钠溶液 甲醇=85 ：15。 2.2 检测波长：291nm 2.3 柱温：室温,试样制备,1. 称取供试品 精密量取本