男性不育实验诊断课件

男性不育实验诊断 新方法及新进展,深圳华康生物医学工程有限公司 生殖医学部,内容提要 男性生殖系统基础 WHO推荐或国内外广泛认可检测指标的临 床意义 标准或广泛认可的方法学 国内外同类检测试剂盒的对比研究 组项分析 病例分析,男性生殖系统 基础,男性生殖器官,一、睾丸 （一）生精小管 1、生精细胞与精子发生 精原细胞、初级精母细胞、次级精母细 胞、精子细胞、精子。 1.1 精原细胞 A型是生精细胞中的干细胞，通过 不断的增殖分裂，一部分转化为B型细 胞，再经过数次的减数分裂后，分化成 为初级精母细胞；另一部分暂时不分 裂，继续以干细胞存在。,1.2 初级精母细胞 染色体核型为46，XY。初级精母细胞通 过DNA复制后，进行第一次成熟分裂，形成二 个次级精母细胞。 （二）支持细胞 血睾屏障-间质内的毛细血管内皮及其 基膜、结缔组织、生精小管界膜和支持细胞的 紧密连接。,支持细胞功能： （1）支持和营养生精上皮； （2）吞噬和消化处理残余体； （3）分泌的睾丸液有助于精子的输送； （4）分泌的抑制素可以抑制垂体合成及分泌FSH； （5）合成的ABP与雄激素结合可以提高生精小管内 的雄激素含量，促进精子的发生； （6）阻止某些大分子物质的侵入，也阻止精子抗 原逸出到生精小管外。,（三）间质细胞 主要功能为合成雄激素,二、生殖管道 （一）附睾 分为头、体、尾三部分，储存精子和精 子功能性成熟的场所。 1.输出小管-为附睾的头部 2.附睾管-组成附睾的体、尾部分 泌中性a葡糖苷酶、肉毒碱等，与精子 的功能性成熟有关。 （二）输精管 精子排出的通道。,三、附性腺 （一）精囊腺 其分泌物呈弱碱性，富含果糖。 （二）前列腺 分泌物呈酸性，富含ACP、柠檬酸、锌。 四、精液 组成：精子与精浆（精囊液占60%、前列腺液占35%、其它占5%）,授精的自然环节与实验监测,1.精子在女性生殖道的运动 宫颈粘液抗精子抗体:制动 精液前列腺素:阴道收缩 2.精子的活动力 精子鞭打运动结构基础:鞭毛轴丝和致密纤维 直接动力能量:葡葡糖 3.精子与透明带的结合 卵透明蛋白ZP3与精子透明带受体糖基紧密连接 N-乙酰葡糖胺和甘露糖基:诱发精子顶体反应,4.精子的顶体反应及穿过透明带 顶体酶:消化透明带 精子动力:穿透外周带 5.精子与卵子的融合 6.卵子的激活 钙离子内流,卵母细胞膜下颗粒的胞外分泌 卵阻碍多精受精： 改变卵膜的构成，使其对精子无亲和力 透明带阻碍多精受精 糖苷酶降解透明带糖蛋白ZP3,精子膜表面受体无识别 7.男子生殖核的形成 核解聚,男性不育症 实验诊断指标,一.免疫性不育检测,（一）抗精子抗体 1、抗精子抗体的产生 生理屏障的破坏 感染导致的抗精子抗体的产生 精浆免疫抑制因子的异常 生殖道局部免疫功能的异常 异常的性活动,2、抗精子抗体与男性不育 影响精子活力及抑制精子穿透宫颈黏液； 抑制精子获能、顶体反应及受孕 ； 影响精子酶的活力和抑制透明带和放射冠 的分散作用； 封闭顶体膜上的抗原位点和抑制精子对透 明带的附着与穿透 ； 影响精子与卵子的结合； 影响胚胎的发育。,3、抗精子抗体检测方法学 血清AsAb检测指标的局限性 A）男性特有的血睾屏障对精子施行封闭式保 护； B）精子抗原的复杂性给诊断试剂的制备带来 困难。 精子膜表面抗体（包被抗体）检测的意义 A）避免精子膜内抗原释放，反应具特异性； B）检测活力精子，更具临床意义。,4、精子膜表面抗体检测的方法（WHO推荐） 混合凝集反应（mixedagglutination reaction，MAR） 特点：免疫性不育过筛试验，检测IgG型 抗体。 免疫珠（immunobead test IBT） 特点：特异性较MAR更高,可进行IgG、 IgA、IgM抗体分型。, 间接免疫珠试验 特点：可取女性宫颈粘液或血清标本，与正常 活体精子预孵育，间接检测标本是否存 在AsAb；可用于检测精浆AsAb；也可进 行夫妻协同试验。 可选组合方式进行抗精子抗体检测： 男配偶活动精子女配偶血清或宫颈粘液 供体活动精子(抗精子抗体阴性)待检精浆 供体活动精子(抗精子抗体阴性)待检宫颈 粘液 供体活动精子(抗精子抗体阴性)待检血清,MAR、IBT结果观察,5、男性免疫性不育的确诊 MAR与IBT试验结果并非经常一致，IBT更 特异。 男性免疫性不育的确证需要在MAR或IBT阳 性基础上附加其他试验，附加试验可以是 前者的重复试验、精子-宫颈粘液接触试 验、精子-宫颈粘液毛细管试验。 MAR: 10%的活动精子被包被为阳性； IBT: 50%的活动精子被所包被则有临床 意义。,精子膜表面抗体试剂盒比较,FertiPro N.V.（400X）,Irvine Scientific（400X）,MoonBay/Carecome（400X）,BioScreen,2.精浆免疫抑制物,精浆免疫抑制物主要由精囊和前列腺分泌 对精子抗原起遮蔽和修饰作用，可以防止精子在男性生殖道中遭到破坏，能保护精子在女性生殖道内正常运行、受精以及受精卵和胚胎在母体内的发育. 若男性精浆中缺乏免疫抑制物质，可导致抗精子抗体的产生而不育，其妻也可对精子产生过敏反应，也会产生抗精子抗体。临床上某些原因不明性不育者，其精液中免疫抑制因子的质或量的缺陷，可能是导致不育的真正原因。,由于精浆中的免疫抑制因子能抑制抗体、NK细胞、T杀伤细胞和巨噬细胞对生殖道病原微生物（如淋球菌、梅毒螺旋体）的识别和杀伤，从而有利于性病的传播。一些与性传播疾病有关的病毒（如HIV、疱疹病毒及巨细胞病毒）均能长期存在于男性生殖道内而无明显临床症状。 此外精浆的免疫抑制作用还与生殖道肿瘤的发生有关。免疫抑制物活性增高时，男性患者由于自身生殖道免疫受抑，易患前列腺癌。,2.分泌功能检测,前列腺分泌功能指标（WHO推荐） 精浆柠檬酸定量( 酶法） （Seminal plasma citric acid ） 浆酸性磷酸酶定量（PNPP法） （Seminal plasma acid phosphatase ） 精浆锌定量（5-Br-PAPS法） （Seminal plasma zinc ）,1. 精浆柠檬酸 临床意义 柠檬酸来自前列腺，其作用是络合钙离子，通过与钙离子结合，而调节精浆钙离子浓度，并影响射精后精液凝固与液化过程的功能。参与维持精浆渗透压。对精子活力及透明质酸酶的活性也起重要作用。研究表明，精浆柠檬酸含量与睾酮水平相关。精浆柠檬酸含量是帮助判断雄激素分泌状态及评价前列腺功能的重要指标。,检测方法 a) WHO 推荐方法反应原理: CL Citrate Oxaloacetate + acetate (柠檬酸盐) (草酰乙酸) (醋酸盐) L-MDH Oxaloacetate + NADH +H+ L-malate + NAD+ (草酰乙酸盐) (苹果酸脱氢酶)(苹果酸盐) L-LDH Pyruvate + NADH +H+ L-Lactate + NAD+ (丙酮酸) (乳酸盐),WHO推荐方法不足: 试剂稳定性差(4C ,1 week); 反应方向向下,不利于手工操作; 测定范围较窄; 精浆标本检测前必须去蛋白处理;,精浆柠檬酸定量检测试剂盒性能比较,2.精浆酸性磷酸酶 临床意义： 前列腺炎患者精浆酸性磷酸酶含量降 低,前列腺肥大或早期前列腺恶性肿瘤者 其含量增高。,检测方法 (WHO推荐) ACP PNPP PNP (405nm) 存在的问题: 底物稳定性 标准品与反应不同步 解决方法: 质控品,3. 精浆锌 临床意义 锌缺乏可引起性腺发育不良,长期缺锌会直 接影响垂体的反馈机制，致使睾丸发育不良、 性腺功能减退。 锌可调节雄激素代谢，锌含量降低时可促进 睾酮转变为双氢睾酮。, 锌直接参与精子生成、成熟、激活和获能过程， 对精 子活力、代谢 及其稳定性都具有重要作用. 精子活力 良好者与低下者相比，精子锌有显著性差异。锌对顶 体酶可逆性抑制使精子免于男女生殖道对其潜在的损 伤。锌也是超氧化物歧化酶(SOD)中金属 之 一，通 过SOD清除精浆中自由基，从而抑制细胞膜发生脂质 过氧化反应，保证精子的形态结构和功能正常。锌与 精子核染色质解聚功能有关. 锌是前列腺功能指标之一，与抗细菌感染有关。 精液 不液化者精浆 锌含量降低，而精液不液化者多有前列 腺炎。病原微生物感染对前列腺分泌功能有影响，有 时虽然没有明显的前列腺症状，但可能存在亚临床性 前列腺炎，致使精浆锌降低。故精浆锌含量可作为前 列腺的功能指标。,检测方法学 a) WHO推荐方法 Zn2+ + 5-Br-PAPS 5-Br-PAPS-Zn复合物 不足之处: 需要特殊波长(560nm)酶标仪,b) 改良PAR法 pH9.5 Znic + PAR 锌-色原复合物 (490nm) PAR：4-（2-吡啶偶氮）间苯二酚一钠 优点: 方法学综合指标接近5-Br-PAPS法要求; 可在普通酶标仪完成比色.,c)改良5-Br-PAPS法 一种试剂盒两种不同操作方法可供选择； 可同时满足560nm、450nm两种波长比色； 重复性得以改善。,锌试剂盒(5-Br-PAPS法)性能比较,附睾分泌功能指标,精浆中性-葡糖苷酶 Seminal plasma neutral alpha- glucosidase 临床意义： 中性-葡糖苷酶是附睾分泌功能的指标。较左旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱对附睾更特异更灵敏。结合激素和睾丸其他指标，对远端输精管阻塞有较好的诊断价值。果糖结合中性-葡糖苷酶检测，可大大提高其诊断阻塞性无精子症的价值。,检测方法学 a) WHO 推荐方法（Cooper法） a-葡糖苷酶 p-nitrophenol-a-glucopyranoside p-nitrophenol 不足之处: 试剂稳定性； 反应时间（4小时或2小时） 标准品问题。,b)改良Cooper法(新酶法) 优点： 方法学达到或优于Cooper法； 反应迅速（25min); 定值质控品； 结果准确性与WHO推荐产品无显著性差异。,中性-葡糖苷酶试剂盒比较 FertiPro N.V./BioScreen: 采用Cooper法(WHO,3d. Edition) ,但反应时 间缩短一半(2小时),结果准确性受到一定影响. 华康: 采用改良Cooper法,反应时间仅25min,与原 Cooper法检测结果无显著性差异.,精囊分泌功能指标,精浆果糖 Seminal plasma fructose 临床意义： 精囊分泌的果糖是精子能量的主要来源。睾酮的水平影响精囊果糖的分泌，雄激素不足可造成果糖含量降低，因此果糖含量能间接反映睾丸间质细胞分泌睾酮的功能。先天性精囊缺如果糖测定为阴性。精囊炎时，果糖含量降低。不完全射精或射精过频，果糖含量亦降低。可用于鉴别单纯性输精管阻塞所致的无精症（果糖含量正常）和输精管、精囊发育不良引起的无精症。因此检测精浆果糖可作为精囊分泌功能的指标。,检测方法 a) 吲哚法（WHO推荐） 原理 果糖与吲哚在强酸、加热环境中生成有色复合物，该有色物质在470nm波长有最大吸收峰 。 不足 非常温反应（50C）； 标本须去蛋白处理； 使用浓盐酸。,b) 酶法 原理 精浆果糖在特异性酶的催化作用下脱氢，脱下的氢与NADP结合成NADPH 。 NADP:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,辅酶 NADPH:还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,还原型辅酶 优点 结果准确可靠； 常温反应（37C）； 清洁环保。,精浆果糖试剂盒性能比较,3.静止性生殖道感染性检测,精液白细胞过氧化物酶染色 （Leukocyte Peroxidase） 精液白细胞群组化酶免定量 （Leukocyte Subpopulations ） 精浆粒细胞弹性硬蛋白酶定量 （PMN-elastase）,精液圆细胞： 生殖道上皮细胞、生精细胞和白细胞 统称之。 正常精液： 圆细胞数5106/ml; 白细胞数1106/ml。,精液白细胞过氧化物酶染色 WHO推荐检测方法 正甲苯胺法 原理 多形核粒细胞特有的过氧化物酶可将H2O2 分解，产生新生态氧，使正甲苯胺被氧化成正甲 苯胺蓝，后者进而形成棕色物使细胞着色。,精液白细胞过氧化物酶试剂盒: FertiPro N.V.: LeucoScreen:邻甲苯胺法(非WHO推荐方法) 华康: 白细胞过氧化物酶染色:正甲苯胺法,精液白细胞过氧化物酶染色(正甲苯胺法),精液白细胞群酶免组化定量 原理 CD45为精液白细胞群共同抗原。通过CD45单克隆抗体与精液白细胞结合后，再经一系列的酶免放大反应，最终指示精液中白细胞的存在及数量。,精液白细胞群酶免组化定量检测图谱,精浆粒细胞弹性硬蛋白酶 检测方法：ELISA定量 原理 包被于固相载体的抗弹性硬蛋白酶单抗可与 精浆中弹性硬蛋白酶相结合，结合的待测物再与 特异性酶标记物反应，最后通过底物显色，其吸 光度大小与精浆标本中弹性硬蛋白酶浓度相关。,精浆弹性硬蛋白酶研究进展： 经ROC分析： 判定生殖道感染临界值(Cut-off): 290ng/ml 灵敏度：79.5% 特异性：74.4% 292例不育病人，34% Elastase290ng/ml； 20例正常生育者，5% Elastase290ng/ml； 264例非白细胞精子症者，25% Elastase290ng/ml； 60例阳性者经Norfloxacine治疗后, 25%Elastase Human Reproduction Vol.15(9):1948-1984,2000,精浆弹性硬蛋白酶（ELISA）试剂盒,三种感染性检测方法比较,4.精子功能质量检测,1.精子低渗膨胀试验 (HOS),临床意义 WHO不主张将HOS作为精子功能试验予以应用，认为它是一种可供选择的检查精子存活力的补充试验方法。而部分学者认为HOS可作为精子膜功能指标之一使用。有研究结果表明：HOS与去透明带地鼠卵穿透试验之间有较好的符合率，对继发性不育者更有价值。大多数学者认为HOS是一项有价值的检测指标，并赞成将HOS列为不育精液的常规检验项目。,2.乳酸脱氢酶同工酶X定量,临床意义 测定精液 LDH-X并结合激素水平测定，可作为评价生精上皮状态指标。严重少精症者，精液 LDH-X活性很高，提示病人精子发生正常。而不育患者精子计数正常，精液 LDH-X活性低下，则提示精子分化受到损害或抑制。 可评价精子膜的完整程度 。不育组LDH-X可通过膜破损处大量外漏到精浆。精浆/精子LDH-X: 生育组=0.528;精液常规正常不育组=0.88;精液常规不正常的不育组=2.85;少精症组=4.01;各不育组与生育组间均有显著性差异。,检测方法：速率法 原理 LDH-X对于碳链长于丙酮酸的a-酮酸的亲合 力强于其他LDH同工酶。 LDH-X 长链a-酮酸 + NADH NAD,3.精子顶体酶,临床意义 顶体酶是受精过程中不可缺少的蛋白水解酶，它 能促进精子的运动最终与卵子融合。顶体酶活性可反 映精子质量，顶体酶活力不足可导致不育。 临床精子成活率低、死精子症以及严重生殖系统 感染，特别是溶脲支原体严重感染时可造成精子顶体 酶活性降低。 此外，更有意义的是通过精液常规难以鉴别不育 原因者，往往顶体酶活性低。顶体酶活性是判断男性 精子功能和生育力强弱的重要评价指标。,检测方法： Kennedy法（BAPNA法）： 精氨酸酰胺酶 BAPNA 硝酰基苯胺 （BAPNA： N-苯甲酰-DL-精胺酸-硝酰基苯胺 ） 不足之处： 反应时间过长（3小时） BAEE（苯甲酰精氨酸乙酯）法：,精子顶体酶活性定量检测试剂盒,FertiPro N.V./BioScreen: AcroScreen: BAPNA法，室温反应1.5h，不提供正常参考值。 华康: 改良BAPNA法，24反应1h (反应强度远高于原BAPNA法）。提供正常参考值。 后期试剂盒配备顶体酶标准品，一定程度可纠正反应条件变化引起的检测差异，并实现以微孔板上酶标仪比色,4.精子表面凝集素受体定量,临床意义： 精子膜在受精过程中起着关键作有。精子膜上的特异决定簇一旦与卵子透明带表面精子受体相识别，将会激发顶体反应等一系列连锁过程，最终完成受精。 精子膜麦芽凝集素（WGA）受体与精子受精功能密切相关。WGA受体位置改变及数量减少可引起不育 WGA受体缺失男性不育症可有两种类型：型是精子膜WGA受体缺失伴膜结合精子抗体阳性，即抗精子抗体遮盖了精子膜表面的WGA受体，这是精子膜WGA受体假性缺失；型是WGA受体真性缺失，属精子膜分子病。 WGA受体检测降低，应检测精子抗体是否阳性。,检测方法： 酶标记法原理 精子表面存在麦芽凝集素受体，外源性麦 芽凝集素（WGA）有与麦芽凝集素受体结合的 专一性。辣根过氧化物酶(HRP)WGA结合物, 与精子膜表面糖萼中的唾液酸和 N-乙酰葡糖胺 结合，通过底物反应，使精子显色。,5.精子核蛋白组型转换,临床意义: 睾丸精子发生过程中,精原细胞和精母细胞内的核蛋白主要为体细胞型的组蛋白,富含赖氨酸。但到精子细胞阶段, 则组蛋白将逐渐被富含精氨酸与胱氨酸的鱼精蛋白所取代。鱼精蛋白能中和DNA电荷, 并能抑制RNA的合成,也即抑制了基因表达。精子核携带着全部来自父方的遗传信息，这些基因必须在受精后才开始表达。受精前精子基因在鱼精蛋白特殊保护下,紧密浓集,无任何DNA转录作用,无疑有重要生理意义.