课件：肿瘤标志物的检测及临床应用.ppt

肿瘤标志物的检测及临床应用,石河子大学医学院一附院检验科 丁进,肿瘤发病率和死亡率,WHO：全世界每年肿瘤死亡人数为630万。 1997年全国肿瘤防治研究所办公室的统计资料：我国恶性肿瘤的死亡率为108.39/10万，占死亡人数的17.94%，居死亡原因的第二位。,肿瘤免疫学( tumor immunology) 是研究肿瘤抗原性质、机体对肿瘤的免疫应答、机体免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系以及肿瘤免疫学诊断和免疫学防治的科学。,肿瘤抗原,肿瘤抗原（tumor antigen） 是指在肿瘤发生、发展过程中新出现的或过度表达的抗原物质。,机体产生肿瘤抗原的可能机制为： 基因突变。 细胞癌变过程使原本不表达的某些基因被激活。 抗原合成过程的某些环节发生异常 如糖基化异常。, 胚胎时期抗原或分化抗原的异常、异位表达。 某些基因产物尤其是信号转导分子的过度表达。 外源性基因（如病毒基因）的表达。,根据肿瘤抗原的特异性分类,1肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen, TSA） 是肿瘤细胞所特有的新抗原，它只表达于肿瘤细胞，而不存在于正常组织细胞。,2肿瘤相关性抗原 ( tumor associated antigen, TAA) 是指非肿瘤细胞所特有的，正常组织或细胞也可表达的抗原物质，但此类抗原在癌变细胞的表达水平远远超过正常细胞。,根据肿瘤抗原产生机制分类,1理化因素诱发的肿瘤抗原 2病毒诱生的肿瘤抗原 3自发性肿瘤抗原,4正常细胞成分的异常表达 分化抗原 过度表达的抗原 胚胎抗原 细胞突变产生的独特型抗原,机体抗肿瘤的免疫学效应机制,机体抗肿瘤的免疫学效应十分复杂，涉及特异性和非特异性抗肿瘤机制相互交错，体液免疫与细胞免疫机制相互协调和补充，从而共同执行免疫监视功能。,一、抗肿瘤的细胞免疫机制, T细胞 1. CD4+T细胞 2. CD8+T细胞(在抗肿瘤效应中起关键作用) 3. + T细胞 NK细胞 巨噬细胞,二、抗肿瘤的体液免疫机制,1补体的溶细胞效应 2抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应 3抗体的免疫调理作用,4抗体封闭肿瘤细胞表面某些受体 5抗体干扰肿瘤细胞粘附作用 6其他机制,肿瘤免疫学检验,肿瘤免疫学检验是指用免疫学的方法检测肿瘤抗原、抗体等肿瘤标志物和肿瘤患者的免疫功能状态，为肿瘤的诊断、观察病情、评价疗效及预后具有重要价值。,肿瘤的早期诊断虽有可能(因为肿瘤潜伏期可长达数月至数年)，但实际上十分困难，因为目前大多数的诊断技术都不适合肿瘤的早期诊断。,用生物物理方法，如X线，CT和超声等检查，只有当肿瘤大小至少到12cm时才能发现，而此时肿瘤细胞数已达109以上。,用免疫学方法检测，肿瘤细胞需达到106才可检出，但此时可能已经发生肿瘤转移，而且并不是所有肿瘤在此时都能被检出。 长期以来人们致力于寻找一种能够尽早检出恶性肿瘤的指标，并将已经发现的一些物质称之为肿瘤标志物（Tumor Marker, TM）。,一、肿瘤标志物,近年来随着现代科技的不断发展，免疫学，分子生物学，细胞生物学，生物化学的深入研究，发现了许多特异性较强，有一定临床价值的肿瘤标志物100多种，受到国内外学者的高度重视。,1. 肿瘤标志物的定义,肿瘤标志物（tumor marker，TM）是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因产物等。,患者血液或体液中肿瘤标志物的检测，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价具有一定的价值。,理想的肿瘤标志物应具有： 特异性100% 灵敏度100% 器官特异性 与肿瘤的大小或分期有关 与预后有关 至今尚无任何肿瘤标志物能满足所有上述标准,2. 肿瘤标志物的分类,体液肿瘤标志物的分类和命名尚未完全统一，一般分为： 胚胎抗原类：如AFP，CEA等。 糖链抗原类：如CA125，CA15-3，CA19-9等。 激素类：如患甲状腺髓样癌时降钙素升高，患绒毛膜 细胞癌时hCG明显升高。, 酶和同工酶类：GT，PAP等。 蛋白质类：2微球蛋白，铁蛋白，本周蛋白等。 癌基因产物类如ras基因蛋白，myc基因蛋白，p53抑癌基因蛋白等。,3.影响血液和体液中肿瘤标志物浓度的因素, 肿瘤的大小和肿瘤细胞的数目。 肿瘤细胞合成和分泌肿瘤标志物的速度。 肿瘤组织的血液供应好坏。 肿瘤细胞是否有坏死和坏死的程度。, 肿瘤细胞的分化程度和肿瘤的分期。 肿瘤细胞是否表达和合成肿瘤标志物。 肿瘤标志物在体内的降解和排泄速度。,肿瘤标志物的临床应用,正常人群中的筛查 有症状者的辅助诊断 癌症的临床阶段的分期 疾病进程的预后指标 评估治疗方案 判断癌症是否复发 治疗应答的监测,肿瘤标志物用于普查的五项原则,应十分清楚该肿瘤的发病率 应能检测早期肿瘤 该肿瘤的早期治疗比晚期治疗更经济有效 测定方法的灵敏度、特异性和重复性良好 普查所需费用能被接受,定 位,TM基本上不能对肿瘤定位 极少数TM如PSA, 甲状腺球白等具器官特异性，但不是肿瘤特异性。,确 诊,通常不能进行确诊 因为TM无足够的灵敏度，不能排除假阴性结果。但本周蛋白(多发性骨髓瘤）、AFP (肝癌)、-HCG（绒毛膜癌）和降钙素（C-细胞癌）等有助确诊。,分 期,大多数TM与疾病分期有关，且浓度与肿瘤大小通常存在关联但并不能根据个体测得值来判断肿瘤大小，也不能以TM 浓度精确指示各期肿瘤，因为各期肿瘤的TM浓度范围极广，且互相重叠。,预 后,术前TM浓度增加，术后降低，表示这些TM对此肿瘤有预后价值。 在病程监测中，TM的浓度增加或降低与疾病的预后密切相关。,TM评价治疗有效性方案 （Beastall, 1991),无效：TM浓度与治疗前相比下降50% 有效：TM浓度与治疗前相比下降90%,预 测,敏感性 阳性结果在肿瘤患者中的比例 敏感性 特异性 非癌症患者个体中(如健康人或良性疾病患者), 阴性实验结果的比例 特异性,真阳性结果数,患病人群总数,真阴性结果数,对照组人群总数,实验结果的期望值 期望值： 阳性期望值(PV+)：在阳性结果的病人中， 癌症存在的可能性 PV 阴性期望值(PV)：在阴性结果病人中, 非 癌症存在的可能性 PV 临界值： 把健康人和癌症病人分开的TM的 浓度,真阳性结果数,阳性结果总数,真阴性结果数,阴性结果总数,参考值与临界值,对TM 而言，以参考值表示基本无意义，应以临界值来表示。 TM 在实际应用中注重的是最佳临界值，即区分“正常”与否的分界线。它不同与参考值，因为参考值来自一组对照人群，而临界值是根据金标准确诊为病人和对照两组人群所确定的。,金 标 准,“金标准”主要指活体组织检查、病原学检查、细胞学检查、特殊影像诊断、长期随访及临床医学专家共同制订的公认的综合诊断标准。,敏感性和特异性常常是一对矛盾，提高了敏感性，降低了特异性，即提高了肿瘤的检出率，同时提高了肿瘤的假阳性率；反之，提高了特异性，降低了敏感性，即提高了肿瘤诊断的准确性，同时降低了肿瘤的检出率(漏诊)。,临 界 值,临界值由三方面决定 根据金标准确定病人和对照两组例数相似的人群，并测出各组的实验数据。 用该实验数据的不同域值区分阳性和阴性的不同分界点，分别计算灵敏度和特异性。 绘制ROC曲线，最接近左上角的点即为最佳临界值，其灵敏度最高，特异性最强。,ROC曲线,受试者工作特征曲线(ROC曲线),ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标。 ROC曲线真阳性率为纵坐标,假阳性率为横坐标,在座标上由无数个临界值求出的无数对真阳性率和假阳性率作图构成。,临界值应根据需要确定,选择临界值不能同时提高灵敏度和特异性。 将临界值提高，特异性增加但灵敏度降低。 将临界值降低，灵敏度提高但特异性下降。 体检时应选择较高的灵敏度，将有问题的人尽量多地检出；确诊时应选择较高的特异性，以减少假阳性结果。,肿瘤标志物的检测方法,标记免疫学的基本原理 示踪物的标记技术+免疫学技术 根据示踪剂的不同可分为 化学发光免疫分析 酶免疫分析 荧光免疫分析 放射免疫分析 金标记免疫分析,肿瘤标志物的检测最好能做定量测定,临床免疫检测的选择,当然是灵敏度更高，同时特异性更高的方法（化学发光及电化学发光）！,二、常见肿瘤标志物,1. 胚胎抗原类肿瘤标志物 甲胎蛋白（-fetoprotein，AFP） AFP是胎儿发育早期合成的一种糖蛋白(1球蛋白)，分子量70kD(生物大分子分子质量单位)，胎儿出生后不久即逐渐消失。 参考值：血清AFP 20g/L。, 原发性肝癌，77%的患者AFP300g/L，但有部分患者AFP始终不升高。 病毒性肝炎与肝硬化患者，血清中AFP可有不同程度的增高，但一般在300g/L以下。, 生殖系统肿瘤和胚胎性肿瘤，如睾丸癌、畸胎瘤等升高。 妊娠三个月后，血清AFP含量开始升高，分娩后三周恢复正常。若孕妇血清中AFP异常升高，应考虑有胎儿神经管缺损畸形的可能性。, 癌胚抗原（CEA） 1965年CEA发现于成人结肠癌组织中，分子量约为200kD，可溶性糖蛋白，主要存在于成人癌组织以及胎儿的胃肠管组织中，故名癌胚抗原，是一种广谱肿瘤标志物。 参考值：血清CEA 5.0g/L, 结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌，转移性恶性肿瘤也有不同程度的阳性率；在恶性肿瘤的随访，病情监测，疗效评价等方面有重要价值。, 肠道息肉、憩室炎、结肠炎、肝硬化、肝炎、胰腺炎和肺部疾病也可有不同程度的升高。 吸烟者中约有33%的人CEA5g/L。,CEA的浓度与癌症的早、中、晚期有关，越到晚期CEA值越高。,2. 糖链抗原类肿瘤标志物,（1）糖链抗原15-3 ( CA 15-3),CA15-3是一种乳腺癌相关抗原，属糖蛋白，分子量超过400kD，可用一对单克隆抗体（MAb115D8和MAbDF3）进行双抗体夹心法来识别。与CA15-3同类的多态性上皮粘蛋白抗原还有MCA，CA27-29，CA549等。 参考值：血清CA15-328kU/L。, 乳腺癌，但在乳腺癌的早期阳性率较低约为30%，转移性乳腺癌阳性率可达80%。 其他恶性肿瘤，如肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，子宫颈癌，原发性肝癌等，也有不同程度的阳性率。, 肝脏，胃肠道，肺，乳腺，卵巢等非恶性肿瘤疾病，阳性率一般低于10%。 乳癌初期敏感性约为60%，晚期可达80%。,（2）糖链抗原125 ( CA 125),CA125是很重要的卵巢癌相关抗原，1981年Bast发现。CA125是一种大分子多聚糖蛋白。 参考值 ：血清CA 125 35kU/L。, 卵巢癌，阳性率约为61.4%。手术和化疗有效者CA 125水平很快下降，若有复发，CA 125升高可先于临床症状出现之前。 其他恶性肿瘤，如乳腺癌40%，胰腺癌50%，胃癌47%，肺癌41.4%，结肠直肠癌34.2%，其他妇科肿瘤43%。 非恶性肿瘤，如子宫内膜异位症，盆腔炎，卵巢囊肿，胰腺炎，肝炎，肝硬化等疾病也有不同程度升高。 妊娠早期，CA 125有升高。,（3）糖链抗原19-9 (CA19-9),CA19-9是一种与胰腺癌，胆囊癌，结肠癌和胃癌相关的肿瘤标志物，又称胃肠癌相关抗原。 参考值：血清CA199 37 kU/L。, 胰腺癌，胆囊癌，胆管壶腹癌时，血清CA 19-9水平明显升高，阳性率约为74.9%，尤其是胰腺癌晚期病人，血清CA 19-9浓度可达40万kU/L，是重要的辅助诊断指标。 胃癌，阳性率约为50%，结肠癌，阳性率约为60%。 急性胰腺炎，胆囊炎，胆汁淤积性胆管炎，肝硬化，肝炎等疾病，CA 19-9也有不同程度的升高，注意与恶性肿瘤的鉴别。,3. 酶类肿瘤标志物, 前列腺特异性抗原 (PSA) PSA是一种由前列腺上皮细胞分泌的蛋白酶。在血清中PSA以两种生化形式存在： 一部分(5%40%)是以低分子量(33kD)的 游离PSA（f-PSA）形式存在。 大部分(60%90%)是以PSA和1抗糜蛋白酶、 2-巨球蛋白等结合的形式存在， 称复合PSA(c-PSA)。 总PSA（t-PSA）,包括血清中f-PSA和c-PSA。,血清PSA升高 前列腺癌患者升高，但大约25%患者，其PSA水平正常；而大约有50%的良性前列腺疾病患者PSA水平增高。为增加PSA对前列腺癌检测的敏感性和特异性，可使用PSA年龄特异性参考范围，PSA密度、PSA速率、f-PSA/t-PSA比值等。, 前列腺肥大，前列腺炎和泌尿生殖系统的疾病，也可见血清PSA水平升高，故当PSA在4.0g/L10.0g/L的灰区时，须进行f-PSA和 f-PSA/t-PSA比值的测定。,【注意事项】在采集病人的血标本前进行直肠指诊、前列腺按摩，导尿等，将会导致血清PSA升高，应注意避免。, 神经元特异性烯醇化酶（NSE） NSE是烯醇化酶的一种同功酶，烯醇化酶同功酶根据，三个亚基的不同，可分为、和五种二聚体同功酶。 亚基组成的同功酶属神经元和神经内分泌细胞特有，故命名为神经元特异性烯醇化酶， NSE是一种酸性蛋白酶，参与糖酵解。肿癌组织糖酵解作用加强，细胞增殖周期加快，细胞内的NSE释放进入血液增多，导致此酶在血清内含量增高。,参考值：血清NSE15g/L。,血清NSE升高见于 小细胞肺癌（SCLC）。可用于鉴别诊断，监测小细胞肺癌放疗、化疗后的治疗效果。 神经母细胞瘤，患者NSE水平异常增高， 而Wilms瘤则升高不明显，因此测定NSE的水平可用于上述疾病的诊断和鉴别诊断。, 神经内分泌细胞肿瘤，如嗜铬细胞瘤，胰岛细胞瘤，甲状腺髓样癌，黑色素瘤，视网膜母细胞瘤等血清NSE也可增高。 【注意事项】NSE也存在于正常红细胞中，标本溶血会影响测定结果，因此采血时要特别注意避免溶血。, -L-岩藻糖苷酶测定（AFU）,AFU是一种溶酶体酸性水解酶，以往主要用于遗传性AFU缺乏引起的岩藻糖贮积病的诊断。Deugnier等（1984）首先发现原发性肝癌患者血清中AFU活性升高。 参考值 ：血清 420 mol/L,原发性肝癌，患者血清中AFU活性明显升高，AFP阴性的肝癌患者中AFU也可见升高，因此，两者联合检测有较好的互补作用。 其他恶性肿瘤，如肺癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌等也可有部分病例升高。, 慢性肝炎、肝硬化患者中部分病例AFU升高，随病情好转AFU下降，动态监测有助于与肝癌的鉴别。 妊娠期间，AFU升高，分娩后迅速下降。,4. 激素类肿瘤标志物, 人绒毛膜促性腺激素 (hCG) hCG是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白类激素，是监测早孕的重要指标。在异常情况下，恶性肿瘤也可产生hCG。 参考值上限为: 5 IU/L。, 滋养层肿瘤和生殖细胞肿瘤hCG升高，如绒毛膜细胞癌、葡萄胎、精原细胞睾丸癌等。 其他肿瘤如乳腺癌、胃肠道癌、肺癌等也可见升高。 良性疾病如卵巢囊肿、子宫内膜异位症、肝硬化等hCG也可见增高。, 降钙素（calcitonin, CT）,CT是由甲状腺滤泡旁细胞即C细胞分泌的多肽激素，主要生理作用是降低血钙。 参考值100 ng/L。, 甲状腺髓样癌血清降钙素升高，其他肿瘤如肺癌、乳腺癌、胰腺癌等也见增高。 肾功能衰竭患者降钙素常升高。,【注意事项】由于降钙素在血液中的半寿期短约为10min，样本收集后应及时处理，冷冻保存。,5. 蛋白质类肿瘤标志物,(1)2-微球蛋白( 2M ) 2M是一种低分子蛋白，人体除成熟红细胞和胎盘滋养层细胞以外，所有的有核细胞都有2M。因为2M分子量小，易于由肾小球滤过，但几乎全部由近曲小管重吸收，因此正常人血和尿中2M含量很低。 参考值：血清 2.4mg/L；尿 320g/L。,2M升高见于: 恶性肿瘤，慢性淋巴细胞白血病等。 肾脏疾病：急慢性肾盂肾炎，肾小管药物性损害等。 肾移植排斥反应时。 免疫性疾病：系统性红斑性狼疮，艾滋病等。,【注意事项】尿标本采集后，为避免2M分解，应加适当的 NaOH缓冲液调PH至7.0左右，然后置4保存，2天内测定。,铁蛋白是判断体内是否缺铁的敏感指标。 Fer升高还与肿瘤有关，癌细胞具有较强合成铁蛋白的能力，因此也是一种肿瘤标志物。 血清参考值：男性 15200 g/L 。 女性 12150 g/L。, 铁蛋白（ ferritin , Fer), 各种恶性肿瘤和白血病可见血清铁蛋白升高。 各种炎症感染、急性心肌梗死、反复输血等，见铁蛋白升高。 铁蛋白 12 g/L 时即可诊断为缺铁。是诊断隐性缺铁性贫血的可靠指标。,6. 其它常用肿瘤标志物,6. 其它常用肿瘤标志物,肿瘤标志物 参考值 相关肿瘤 CA 50 24 kU/L 胰腺癌、结肠癌、胃癌等 CA 72-4 6 kU /L 胃癌、粘液性卵巢癌等 CA 242 20 kU /L 胰腺癌、结肠癌、胃癌等 前列腺酸性磷酸酶（PAP） 2.0g /L 前列腺癌 鳞状上皮细胞癌抗原（SCC） 1.5g /L 宫颈癌、肺和头颈部鳞癌等 组织多肽抗原（TPA） 80U/L 膀胱癌、前列腺癌、消化道 恶性肿瘤 细胞角蛋白19片段 3.3g /L 非小细胞肺癌（NSCLC） （CYFRA21-1） 唾液酸 1.8 mmol/L 肺癌、胃癌、黑色素瘤等,1. 标本采集: 各种物理检查对TM检测的影响 药物对TM检测的影响 标本保存对TM检测的影响 溶血标本对TM检测的影响 酶类和激素类肿瘤标志物的特点,（三）肿瘤标志物检测的注意事项,2. 检测方法和试剂： 方法学的差异 试剂盒的差异 测定标准化的问题 因此，在工作中要尽量使用同一种方法，同一种仪器和同一厂家的试剂盒进行测定。,3. TM检测的干扰因素 携带污染 (carry-over) “钩状效应”（hook effect）, 嗜异性抗体：可导致在无抗原的情况下，出现肿瘤标志物浓度增高的假象。嗜异性抗体可出现在曾被鼠或宠物咬过的人，以及使用过动物免疫剂（如单克隆抗体）治疗过的人。,（四）肿瘤标志物的联合应用,一种肿瘤可分泌多种肿瘤标志物，而不同的肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型可有相同的肿瘤标志物。因此，单独检测一 种肿瘤标志物，可能会因为测定方法的敏感性不够而出现假阴性，联合检测多种肿瘤标志物有利于提高检出的阳性率。,为此，选择一些特异性较高，可以互补的肿瘤标志物联合测定，对提高肿瘤的检出率是有价值的。常