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文献标识码:A1化学发光自从1877年首次发现化学发光现象以来,人们对化学发光现象的认识和研究,已经历了一个极其漫长的发展过程。化学发光是在没有光、电、磁、声、热源激发的情况下,由化学反应或生物化学反应产生的一种光辐射。以此为基础的化学发光分析,由于可以进行发射光子计量,又没有外来激发光源存在时散射光背景的干扰,因而具有很高的灵敏度(检出限可达10-2 -10-21mol),很宽的线性范围(3-6个数量级),同时仪器设备又很简单、廉价、易微型化,在二十世纪的最后十年发展非常迅速。1.1 化学发光的基础化学发光是指吸收了化学反应能的分子由激发态回到基态时所产生的光辐射现象,广义的化学发光也包括电致化学发光。一个化学反应要产生化学发光现象,必须满足以下条件:第一是该反应必须提供足够的激发能,并由某一步骤单独提供,因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光;第二是要有有利的反应过程,使化学反应的能量至少能被 种物质所接受并生成激发态;第三是激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子,或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。化学发光反应所以能用于分析测定,是因为化学发光强度与化学反应速度相关联,因而一切影响反应速度的因素都可以作为建立测定方法的依据。化学发光反应一般可表示为:A+B=C* (1)C*=C+hv (2)化学发光强度(ICL )取决于反应的速度(dPdt)和化学发光量子效率(CL)ICL(t)=CL dPdt (3)式由可表示为CL=rl,其中r为生成敬发态产物分子的量子效率,l为激发态产物分子的发光量子效率。对于一定的化学发光反应,CL为一定值,其反应速度可按质量作用定律表示出与反应体系中物质浓度的关系。因此,通过测定化学发光强度就可以测定反应体系中某种物质的浓度。原则上讲,对任何化学发光反应,只要反应是一级或假一级反应,都可以通过公式(1)进行化学发光定量分析。例如,在上述化学发光反应中,如果物质B保持恒定,而物质A的浓度变化并可视为一级或假一级反应,则:ICL= ICL(t)dt=CLdA(t)dtdt=CLCA即化学发光强度与A的浓度度成正比3。化学发光分析测定的物质可以分为三类:第一类物质是化学发光反应中的反应物;第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂;第三类物质是偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。这三类物质还可以通过标记方式用来测定人们感兴趣的其他物质,进一步扩大了化学发光分析的应用范围。1.2 应用1.2.1 无机离子化学发光分析法目前可测定的金属离子和其他无机组分已达40 多种, 涉及的分析试样极为广泛, 但以测定环境及生物样品中的无机组分为主。李卫华等基于Hg()置换Fe()-EDTA配合物中的Fe()和Fe()一鲁米诺溶解氧产生化学发光的反应,建立了置换偶合反应流动注射化学发光测定痕量汞离子的新方法,检出限为310-8gmol-1,方法成功用于工业废水中汞的测定。许申鸿采用CuC1-HzOz-邻菲罗啉一碳酸盐缓冲液作OH产生体系,研究了产生和检测OH的新化学发光体系,对于研究筛选清除OH的药物有一定应用价值。高岐将亚硝酸盐在酸性条件下氧化亚铁氰化钾为铁氰化钾的反应,和尿酸一铁氰化钾鲁米诺化学发光反应相偶合,建立了一种间接测定亚硝酸根离子的新方法,用于环境水样及食品中亚硝酸盐的测定,取得满意效果。1.2.2 有机物的分析(1) 有机酸的分析AGregorio Alapont等利用鲁米诺H2O2-Fe(CN)63-体系首次实现了4-乙酰氨基酚的间接测定。利用甲疏丙脯酸对鲁米诺-H2O2体系的增敏作用,可测定甲疏丙脯酸。高秀峰等还利用化学发光和固定化酶反应测定了尿中磺酸化胆汁酸,由此建立了一种临床快速分析法。(2) 有机碱的分析邓双根据金鸡钠碱能极大地增强H2O2和NaIO4体系的化学发光强度,建立了测定金鸡钠碱高灵敏化学发光法,适用于奎宁药物的测定。Kawatani等利用MoO42-和H2O2反应产生,用于吲哚化合物的测定,检出限达10-9molL-1。(3) 药物分析近年来,药物分析中化学发光法应用较普遍。可以利用其还原性,直接被氧化剂氧化发光测定。如用KMnO4作氧化剂可测定盐酸异丙嗪,核黄素,丙米嗪,氨基比林等。也可以利用药物对鲁米诺与次卤酸根化学发光体系的抑制或增强作用,测定L-多巴,潘生丁,甲氨蝶呤,乌拉地尔等。1.3 展望化学发光分析法的应用领域不断扩大,合成新的发光试剂, 建立新的发光体系, 与其它技术联用是其发展趋势。由过去的直接发光分析到与FIA、HPLC、CE等联用,克服了选择性差的弱点,达到灵敏、准确的分析目的。化学发光分析法因其仪器简单、操作方便,加上与其它技术的联用,其应用范围会不断扩大,它在食品、环境、生物、医学等领域都得到了广泛的应用。近几年来,化学发光的发展将主要表现在:(1)继续完善现有的化学发光体系,使其成为一种常规的分析方法;(2)新体系的不断建立和完善,主要是新体系增敏剂的研究,这是开发这些化学发光体系的关键;(3)化学发光与其他方法或技术联用,将化学发光与数学、物理学、生物学等三大学科结合,与流动注射技术,传感器技术、HPLC技术联用改善化学发光法的性能,拓宽化学发光体系的应用范围与许多有效的分离方法如高效液相色谱和毛细管电泳相结合,提高化学发光体系的选择性和灵敏度;(4)进一步研究有关的化学发光反应机理,从最初以化学反应方程式进行推测,发展到借助荧光光谱、吸收光谱、反应中间体的捕捉等证实;在实验基础上,运用分子轨道理论、热力学原理解释机理,为提高化学发光效率提供理论基础;(5)仪器的研究与开发迅速发展,制备高效的化学发光探针,以及化学发光仪器的微型化、智能化和遥控化,为化学发光的进一步发展创造条件;(6)扩大了化学发光分析的应用范围,将化学发光引向有机、冶金、药物、临床、食检、生命科学、环境和材料科学等各个领域42 荧 光某些物质的分子因吸收光后,它的能级跃迁到激发态,激发态分子在返回基态时以发光辐射的方式全部或部分地释放出所吸收的能量,其发射波长与吸收光的波长相同或更长,这种现象称为荧光。自然界有许多荧光物质。早在16世纪,人们就在矿物和植物抽提液中观察到荧光现象。但并不是所有的物质都会发荧光。随着科学研究和生产实践的进一步深入,荧光的本质逐步为人们所认识,荧光的理论和应用也得到长足发展。近年来在荧光分析方法和技术方面也取得重要进展,其应用领域也正不断拓宽,如阴离子的荧光光谱法测定。荧光法检测与色谱法联用,提供了高灵敏度和高分辨率或高选择性的分析方法,微分或导数荧光法、多维荧光光谱法、同步荧光法、同步导数荧光法、偏振荧光法、相分辨与时间分辨荧光光谱法、免疫荧光监测、固体表面检测、催化与非催化动力学荧光、激光诱导荧光光谱法等新兴及其复合联用方法与技术的出现又为荧光分析法的发展注入了新的动力。2.1荧光分析法基础1 分子在吸收光的能量后,从基态跃迁至激发态,由于处于激发态并不稳定,激发分子的激发单重态直接或经过振动弛豫降到有关的最低振动能级后,如果以发射光量子的形式由单重激发态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)的任一振动能级(包括最低能态),又经振动弛豫回到最低基态,这个过程为荧光发射。从荧光的发射过程可以明显地看到:荧光是从激发单重态的最低振动能级开始发射,与分子被激发至哪一个能级无关,因此荧光光谱的形状与激发光的波长无关;其次,荧光发射前后都有振动弛豫过程,因此荧光发射的能量比分子吸收的辐射能量低,所以溶液中分子的荧光光谱的波长与它的吸收光谱的波长比较,荧光的波长总是要长一些(Stocks位移或称红移);再者,由于单重激发态的平均寿命是10-9-10-7s,因而荧光的寿命也在同一数量级,一般为10-8s。2.1.1 影响荧光强度的因素溶液浓度与荧光强度的关系溶液的荧光强度与该物质的吸光程度和荧光效率有关。荧光效率是荧光物质发出荧光的光量子数与所吸收的激发光的光量子数的比值,即荧光效率j=发出荧光的光量子数Em/吸收的激发光的光量子数Ex荧光效率是衡量物质发射荧光能力的尺度。荧光强度与溶液浓度的关系,可以根据比尔定律推导出来,如果溶液很稀,被吸收的总激发光能不超过5%,亦即ebc=A0.05时,可以简化为,IF = jI0ebcI0 为入射光强度;e为荧光分子的摩尔吸光系数;b为荧光池厚度;c为溶液浓度当I0为一常数,且浓度c很小时IF = kc可以看到:荧光强度与荧光物质的浓度成正比,但荧光强度与溶液浓度呈线形关系仅限于极稀的溶液,当荧光物质浓度增大到某一限度后,溶液浓度再增大荧光强度也不再增加。自吸收是荧光发射的波长和该物质的吸收峰重叠,而导致荧光降低乃至熄灭的现象。荧光光谱的短波长一端常和其吸收光谱长波长一端重叠。当溶液浓度较大时,液池前部所发射荧光通过后部溶液时,短波长的荧光被自吸收,因而降低了荧光强度。2.1.2 物质结构与荧光强度的关系发光物质的分子吸收辐射后,由激发单重态最低振动能级降到基态发射出荧光。所以物质能否发生荧光取决于其分子结构:它必须具有吸收光量子的分子结构和有一定的荧光量子效率。(1)共轭键体系最强且最有用的荧光物质多是含有低能-*跃迁的有机芳香族化合物极其金属离子配合物,电子共轭程度越大,越容易产生荧光;环越大,发光峰红移程度越大,发光也往往越强。共轭环数相同的芳香族化合物,线性环结构的荧光波长比非线性者要长。(2)刚性平面结构强荧光物质的分子多数具有刚性平面结构,这样,可以减少分子自身的振动,并使分子与溶剂或其他溶质的相互作用减少,降低了碰撞去激的可能性或程度。(3)取代基效应取代基的种类和位置对荧光体的荧光光谱和强度有较强的影响。给电子取代基加强荧光,如OH、OR、CN、NH2、NHR、NR2、OCH3等;得电子取代基通常使荧光减弱,使磷光加强。如COOH、NO2、SH等;影响不明显的取代基有NH3、R、SO3H等。CN取代的芳烃通常都有荧光;取代基的位置也有影响,对位、临位取代增强荧光,间位取代抑制荧光。双取代和多取代基的影响较难预测,取代基之间如果能形成氢键增加分子的平面性,则荧光增强。两种性质和作用不同的取代基共存时,其中有一个起主导作用。不管何种类型的取代,随着共轭体的增大,其影响相应减少。(4) 电子跃迁类型含有氮、氧、硫杂原子的有机物都含有未键合的非电子,电子跃迁度为型,系间窜跃强烈,荧光很弱和不发荧光,易与溶剂生成氢键或质子化从而强烈影响它们的发光特性。不含氮、氧、硫杂原子的有机荧光体多发生*类型的跃迁,荧光辐射强,在刚性溶剂中常有与荧光强度相当的磷光。2.1.3 荧光猝灭荧光物质分子与溶质或溶剂分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理化学过程,称为荧光猝灭,这些引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。猝灭过程实际上是与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态寿命的过程猝灭剂存在对荧光分析有严重的影响,在荧光测定之前必须考虑猝灭剂的消除或分离问题。但是也可以建立对某一猝灭剂的荧光测定方法导致荧光猝灭作用的主要类型(1)碰撞猝灭:碰撞猝灭是荧光猝灭的主要原因,它是指处于单重激发态的荧光分子与猝灭剂发生碰撞后,使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态,因而产生猝灭作用。碰撞猝灭与溶液的粘度有关。在粘度大的溶剂中,猝灭作用较小。此外,碰撞猝灭将随温度升高而增加。(2)能量转移:这种猝灭作用是由于猝灭剂与处于激发单重态的荧光分子作用后,发生能量转移,使猝灭剂得到激发。(3)氧的猝灭作用:溶液中的溶解氧对荧光产生猝灭作用。这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光分子相作用,促进形成磁性的三重态分子,即加速系间窜跃所致。(4)自猝灭和自吸收:当荧光物质浓度较大时,常会发生自猝灭现象,使荧光强度降低。这可能是由于激发态之间的碰撞引起能量损失。2.1.4 环境因素对荧光的影响(1)溶剂的影响同一种荧光体在不同的溶剂中,其荧光光谱的形状和强度可能产生显著的变化。这是因为荧光体的基态与激发态的偶极矩不同,导致两者与溶剂的相互作用程度不同。溶剂的影响可以分为一般溶剂效应的影响和特殊溶剂效应的影响,往往后者引起的光谱移动要大于后者。(2)介质酸碱性的影响如果荧光物质是一种有机弱酸或弱碱,则介质的酸碱性对荧光光谱的形状和强度,有很大的影响。因为该荧光物质与其对应的离子可以看成两种不同的型体。具有酸性集团或碱性集团的芳香族化合物,当酸碱性变化时,可能改变与发光过程相竞争的非辐射跃迁过程的性质和速率。例如水杨醛在通常情况下发磷光,但是在强酸或者是强碱溶液中,其最低激发单重态为(,*)而发射荧光。质子离解作用或质子化作用均使得分子的基态和激发态之间的能量间隔发生变化,导致发光光谱移动。介质的酸碱性对荧光光谱和荧光强度的影响可以提高荧光分析的选择性。(3)温度的影响温度对荧光强度有显著的影响,温度升高引起荧光量子产率、荧光强度的降低。但是当温度升高,却有荧光强度下降的现象,这是由于非辐射跃迁的的速率增大;介质的黏度变小,增大了荧光分子与溶剂分子碰撞猝灭的机会和分子内部能量的转化作用的结果。(4)重原子效应重原子效应可以分为外重原子效应与内重原子效应。溶剂分子中含有高原子序的原子导致荧光减弱和磷光增强,但对跃迁的频率没有可觉察的影响,这种效应为外重原子效应;芳族化合物分子中的重原子取代集团,同样会引起荧光强度减弱、磷光强度增强的现象,这种原子效应被称为内重原子效应。(5)有序解介质的影响表面活性剂或环糊精溶液这样的有序介质,对发光性质有显著的影响,在发光分析中有广泛的应用。当表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度时,表面活性剂便会动态的蒂合形成聚集体,成为胶束。表面活性剂一般是非光学活性物质,毒性小,价格便宜,使用方便,其胶束溶液光学上透明稳定,对发光物质具有增溶、增敏和增稳的作用。对于极性小而难溶于水的荧光物质,可在胶束水溶液中加以测定。2.1.5荧光的测定方法(1)直接测定法如果待测的分析物质本身能发荧光,只要测定其荧光强度,就可知道它的浓度。许多芳族化合物和生物物质具有内在的荧光特性,可以直接进行测定。但是若有其他干扰物质存在,则预先掩蔽或消除。荧光强度的测量通常采用相对的测量方法,一般采用工作曲线法。(2)间接测定法荧光衍生法:通过某种手段使不发荧光的待测物质转化为另一种发荧光的化合物,通过测定该化合物的荧光强度,间接测定待测物质。荧光猝灭法:如果待测物质不发荧光,但能使某些荧光化合物猝灭,通过测定荧光化合物的荧光强度的下降程度,间接测定待测物质敏化荧光法:如果待测物质不发荧光,通过选择合适的荧光试剂作为能量受体,当待测物质激发后,将能量转移给荧光试剂,导致荧光试剂被激发,通过测定荧光试剂的荧光强度,可以对待测物质进行间接测定。2.2 荧光分析法的应用 荧光分析法目前还主要用于无机物和有机物的定量分析,但随着其研究的深入,在定性分析、结构分析及作为某些研究领域的手段也日渐增多,具有较为广阔的应用前景。2 (1)痕量分析荧光光谱法包括同步荧光光谱、导数荧光光谱、时间分辨荧光光谱和三维荧光光谱,都具有灵敏度高、选择性好和速度快等优点,它们已成为诸多领域中痕量和超痕量分析的重要方法。使用荧光探针,可以实现本身不发荧光的特定成分分析。根据待测组分的特性,除直接荧光法外,还可以用荧光猝灭法进行痕量分析。对于多组分试样,可以经色谱分离后进行柱后衍生-在线荧光检测,或采用同步荧光等手段进行多组分同时测量。(2)无机化合物分析直接能应用无机化合物自身的荧光进行测定的为数不多,无机化合物的荧光测定主要依赖于待测元素与有机试剂所组成的能发荧光的络合物,通过检测络合物的荧光强度以测定该元素的含量。测定无机离子时的常用的几种荧光试剂为:8-羟基喹啉、2-羟基-3-萘甲酸、2,2-二羟基偶氮苯及安息香等。铍、铝、硼、镓、硒、镁等元素的分析可采用直接荧光法;氟、硫、铁、银、钴、镍等元素可采用荧光猝灭法测定;铬、铌、碲等元素可采用低温荧光法测定。(3)有机化合物的分析脂肪族化合物的分子结构较为简单,能够发射荧光的为数不多,但也有许多脂肪族化合物与某些有机试剂反应后的产物具有荧光性质,可用于它们的测定。芳香族化合物具有共轭的不饱和结构,多能发射荧光,可以直接进行荧光测定。有时为了提高测定方法的灵敏度和选择性,常使某些弱荧光的芳香族化合物与某些试剂反应生成强荧光的产物进行测定。目前荧光分析法已成为测定肾上腺素、青霉素、苯巴比妥、维生素、普鲁卡因等药物的灵敏测定方法。对于不产生荧光的化合物,经浓硫酸处理后,可使其不产生荧光的环状醇类结构后测定。(4)荧光探针在分子荧光分析法中,利用激光诱导产生超灵敏度,已能实现检测到溶液中单分子的行为,如溶液中罗丹明6G分子、荧光素分子的单分子行为研究等,使该方面的研究工作受到广泛的关注。在生物和基因检测方面,由于DNA自身的荧光效率很低而不能直接检测到,但以某些荧光分子作为探针,可通过探针标记分子的荧光变化来研究DNA。典型的荧光探针为溴化乙锭,Tb3+、钌的络合物等也被使用。在基因检测方面,目前也逐步采用荧光染料作为标记物来取代同位素标记物。62.3 展望荧光分析法具有灵敏度高和选择性较好等优良性能并已得到广泛的应用,今后荧光分析的研究方向主要有:(1) 发展多种有效的样品收集技术,并使之与荧光分析法相结合,将为荧光分析法在分析方面开辟更广泛的应用前景。(2) 研究开发更多的荧光试剂,使荧光分析能测定更多的物质。(3) 荧光分析法与其他分析方法的联用是今后研究的一个热点方向。荧光分析与高效液相色谱 、固相萃取 、流动注射技术 、毛细管电泳的联用已经得到了广泛的应用,提高了荧光分析的灵敏度、选择性和分析过程的自动化。73 磷 光3.1 磷光的基础通常情况下,绝大多数的有机分子处于单线基态(S0),当分子被激发到较高能级并经历非辐射跃迁降落到第一电子激发单重态(S1,)的最低振动能级后,往往并不全部降落到基态而发荧光,而是继续经历非辐射的系间窜越到达亚稳的第一电子激发三重态(T1),在三重态逗留后,再发生辐射跃迁下降到基态的各振动能级,同时伴随着磷光的发射。现在广泛应用的磷光分析法有低温磷光分析法,固体基质室温磷光分析法,和流体室温磷光分析法。其中流体室温磷光又分为胶束增稳室温磷光,敏化淬灭室温磷光,环糊精诱导室温磷光等磷光分析法。与荧光发射相比,磷光处于长波,寿命较长,易于消除荧光背景及散射。83.2 应用 能够发磷光的物质并不多,磷光分析法主要用于有机化合物的测定,如稠环芳烃、染料、农药、医药、生物碱、植物生长激素等化合物的分析,在环境、农药和医药工业、精细化工、生物试剂等方面有较重要的应用。此外磷光分析技术也应用于生物活性物质的化验及细胞生物学、生物化学等方面的研究。 (1)稠环芳烃和石油产物的分析:由于许多具有稠环和杂环结构的化合物具有较大的致癌性,因而这些物质的高灵敏快速分析检测方法受到重视。通常这些化合物能够产生磷光,可以直接进行测定,使得室温磷光分析技术成为快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物的重要手段。 (2)农药和生物碱的分析:低温磷光法已经用于DDT等52种农药、烟碱、降烟碱、新烟碱等生物碱及2,4-D和萘乙酸等17种植物生长素的分析,方法的检测限为0.01mg/ml。(3)药物分析和临床分析:在药物和临床分析方面,磷光分析法得到广泛的应用。如血液和尿中阿司匹林、普鲁卡因、苯巴比妥、可卡因、盐酸氯普鲁麻金、对硝基苯酚、犬尿烯酸、磺胺嘧啶等药物和组分的测定;致幻剂、维生素、抗凝剂等药物分析,及腺嘌呤、鸟嘌呤、色氨酸、色氨酸甲酯、络氨酸等生物试剂的分析。93.3 结语磷光分析法以其独特的优点在氨基酸、核酸和蛋白质的分析测定中得以广泛应用。同时磷光测定中的发射峰特征偏振寿命等指标也可以为生物大分子与小分子的相互作用提供有用的信息。随着磷光探针技术发展,以及磷光分析法与其它分析方法技术的联用,磷光分析法将会发挥更重要的作用。参考文献:1徐金钩,王尊本等.荧光分析法M.北京:科学出版社,20062张华等.现代有机波普分析M.北京:化学工业出版社,20053李超,刘树元等.化学发光分析法的发展与应用J.分析测试技术与仪器,2006,12(2):75-814韩鹤友,崔华等.化学发光分析法应用新进展J.光谱实验室,2002,19(1):39-445张丽丽,臧利国.化学发光分析法应用进展J.理化检验-化学分册,2004,40(4):243-2486孙继红,钱丹青.荧光分析技术新进展J.唐山师范学院学报,2005,27(5):19-207范传刚,刘道杰.光化学荧光分析法研究进展J.理化检验-化学分册,2006,42:66-728魏玉霞,董川.磷光分析法在生命科学中的应用新进展J.生命的化学,2003,23(4):320-3229刘长松等.室温磷光分析法在我国的进展J.化学通报,1996,4:5-8责任编辑:韩金宏The Devolopment of Analysis About LuminescenceWANG Jian-hua DONG Jin-ping(Weifang Science and Technology Vocational College, Shouguang 262700, Shandong Province)Abstract: The paper was briefely about the type of luminescences analysis,and stressly introduced the

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