课件：手十二井穴刺络放血研究.ppt

手十二井穴刺络放血 的临床与实验研究 天津中医学院 湖南中医学院 北京中医药大学 天津医科大学总医院 天津市第一中心医院 天津市脑系科医院 天津市第三医院,（一）、手十二井穴刺络放血对中风患者神志、心率影响的临床观察(30例） （二）、手十二井穴刺络放血对中风患者神志、心率影响的临床观察（500例） （三）、手十二井穴刺络放血对高血压患者血压影响的临床观察,临 床 研 究,（一）、手十二井穴刺络放血对中风患者神志、心率影 响的临床观察 病例的选择与确诊条件：刺络放血组30例，全为发病后3日间有意识障碍的患者。选择脑出血与脑梗塞患者，病因不限。脑出血选择最为多见的基地节出血与脑叶内出血，出血量不限；脑梗塞选择除脑干出血以外的其他部位的出血，梗塞面积不限。确诊条件为典型的脑血管临床发病方式以及确切的CT诊断。对照组22例，选择与刺络放血组年龄、性别、病变的性质、部位以及病变的范围相似的患者.,刺络组与对照组都在正常治疗的基础上，仅刺络组增加井穴刺络放血。方法：先左手后右手，以三棱针针刺手十二井穴，出血量为一滴。刺络放血组观察刺络前、刺络后15min、30min、45min的意识、血压、呼吸、脉搏的变化；对照组在相同的时间进行同样的观察。意识的判定以Glasgow 意识障碍量表为基准（见表一）。,表二、手十二井穴刺络放血对中风患者神志的影响（XSD） 针刺后15分 针刺后30分 针刺后45分 大面积的损伤 0.100.32 0.200.42 0.300.62 n=10 中面积的损伤 0.000.00 0.450.73* 0.560.73* n=9 小面积的损伤 0.090.30 0. 370. 51* 0.630.81* n=11 *P0.05 X=Xt X0,表三、对照组中风患者45分钟神志的自然变化 （X SD） 针刺后15分 针刺后30分 针刺后45分 大面积的损伤 0.000.00 . 0.400.55 0.581.55 n=6 中面积的损伤 0.270.46 0.360.51* 0.550.52* n=11 小面积的损伤 0.200.45 0.400.55 0.400.55 n=5 * P0.05 X=Xt X0,表四、手十二井穴刺络放血对中风患者血压的影响（XSD）mmHg 针刺后15分 针刺后30分 针刺后45分 收缩期压 舒张期压 收缩期压 舒张期压 收缩期压 舒张期压 大面积的损伤 1.002.11 0.502.84 2.503.54* 0.002.36 3.507.09 -1.004.60 n=10 中面积的损伤 0.561.61 0.000.00 0.564.64 -0.571.67 0.004.33 -1.114.17 n=9 小面积的损伤 2.734.10* -0.469.25 6.369.25* -1.825.60 4.0912.01 0.000.00 n=11 *P0.05 X=Xt X0,表五、 对照组中风患者血压的自然变化（XSD） 针刺后15分 针刺后30分 针刺后45分 收缩期压 舒张期压 收缩期压 舒张期压 收缩期压 舒张期压 大面积的损伤 0.000.00 0.000.00 - 1.674.08 1.674.08 - 1.674.08 3.375.17 n=6 中面积的损伤 0.000.00 -1.824.05 1.824.05 3.646.74 1.824.45 4.456.17* n=9 小面积的损伤 2.004.42 0.000.00 2.004.47 0.000.00 2.004.47 0.000.00 n=5 *P0.05 X=Xt X0,表六、 手十二井穴刺络放血对中风患者呼吸的影响（XSD）次/分 针刺后15分 针刺后30分 针刺后45分 大面积的损伤 0.000.00 -1.171.60 -1.171.43 n=10 中面积的损伤 -0.270.65 -3.316.08 -0.550.93 n=9 小面积的损伤 -0.201.10 -0.401.67 -1.202.10 n=11 X=Xt X0,表七、 对照组中风患者50分间呼吸的自然变化 （XSD） 针刺后15分 针刺后30分 针刺后45分 大面积的损伤 0.301.16 0.501.27 0.101.37 n=6 中面积的损伤 0.002.24 0.451.95 0.112.26 n=9 小面积的损伤 0.091.82 0.462.25 0.551.57 n=5 X=Xt X0,表八、 手十二井穴刺络放血对中风患者心率的影响 （XSD次/分） 针刺后15分 针刺后30分 针刺后45分 大面积的损伤 2.402.63* 3.203.29* 3.402.84* n=10 中面积的损伤 0.781.39 3.452.19* 2.332.74* n=9 小面积的损伤 1.912.91* 3.851.87* 5.003.65* n=11 *P0.05 *P0.01 X=Xt X0,表九、对照组中风患者心率的自然变化（XSD次/分） 针刺后15分 针刺后30分 针刺后45分 大面积的损伤 -0.170.98 -1.503.39 1.614.01 n=6 中面积的损伤 -0.370.81 -1.093.39 -0.051.17 n=11 小面积的损伤 -0.600.89 -1.001.00* -0.081.30 n=5 *P0.05 X=Xt X0,1、本实验对照组与刺络组的年龄分别为66.7310.51%、66.277.12%，统计学处理无显著性差异。中等以上的出血分别为76%和70%，中等以上的梗塞分别为58%和66%，因此，两组的缺血程度近似，具有可比性。 2、手十二井穴刺络放血后，损伤面积小的患者意识状况好转(见表二、表三)；,3、手十二井穴刺络放血后，损伤面积小的患者收缩期血压上升，这可能是意识好转的原因之一(见表四、表五)； 4、手十二井穴刺络放血，可使患者的心率加快(见表八、表九)； 5、手十二井穴刺络放血对中风初期患者的呼吸影响 不大(见表六、表七)。,（二）手十二井穴刺络放血对中风患者神志、心率影响的临床观察（500例）略 （三）手十二井穴刺络放血对高血压患者血压影响的临床观察 略,实验研究,脑血流,脑生化,脑分子 生物学,中风患者颅 内血 流动力学影响,实验性脑缺血、脑血肿和高血压 家兔脑血流图,影响脑血流的作用机制,H+、O2、K+、Na+、Ca2+ NO、CaM、Glu、Asp,C-foc基因、HSP70等,一.手十二井穴刺络放血 对脑血流的影响及其作用途径.作用机理的研究 。,(一).手十二井穴刺络放血对中风患者颅内血流动力学的影响 中风急性期的患者大多数有脑血流的异常，脑血流的改善对中风患者的神志及预后具有重要的意义。我们利用彩色经颅多普勒，对中风患者施加手十二井穴刺络放血后的颅内血流动力学进行了观察,1.1资料与方法：经临床CT确诊为脑梗塞和脑出血患者30例，其中男22例，女8例，平均年龄66.27岁。用西德EME公司生产的彩色三维颅内超声多普勒诊断仪（3D-TCD型），以2MHz的脉冲多普勒探头，全面探测颅内主要动脉的血流状态。采用平卧位经颞窗探测大脑前动脉（ACA）、大脑中动脉（MCA）、大脑后动脉（PCA）的血流状态；采用右侧位经枕窗分别探测双侧椎动脉（VA）及基底动脉（BA）的血流状态。然后以三棱针点刺手十二井穴，放血12滴，再探测针后颅内各主要血管的血流状态。探测所得信息输入计算机频谱分析系统，在计算机内重建颅内血管的三维分布图，结果以t检验统计分析。,1.2结果：30例中风患者中，22例TCD检测结果为流速减低型，占73.33%； 8例为流速加快型，占26.67%。手十二井穴刺络放血法可使血流减速型中风患者颅内主要血管的血流速度加快，与针前相比具有非常显著性差异 (P0.01)；使血流加速型中风患者的血流平均流速减慢，与针前相比亦有显著性差异 (P0.01)，表现出良好的双向性良性调整作用。,（二）、手十二井穴刺络放血法对 实验性脑缺血、脑血肿和高血压家兔脑血流图的影响,2.1模型制作：家兔急性实验性脑缺血模型制作：健康成年家兔，体重1.82.5公斤，雌雄不拘。在普鲁卡因局麻下，分离右侧颈总动脉，制作颈总动脉皮桥。实验时用微型动脉夹夹闭右侧颈总动脉皮桥，阻断血流。实验结束后，放开动脉夹，恢复脑血流循环。家兔急性实验性脑血肿模型制作：以家兔自身血液注如入内囊部位脑实质中造成脑血肿，以模拟脑出血模型。家兔实验性高血压模型制作：于家兔静脉缓慢注入去甲肾上腺素造成高血压动物模型。,2.2实验方法：以硬脑膜外埋藏电极的方法引导家兔脑血流图（REG）讯号。在3%戊巴比妥钠麻醉下（1ml/kg），于家兔额顶部矢状线两侧约5mm，冠状线前约5mm处各钻一孔至硬脑膜，分别安装一枚约4.3mm，高约8mm的园柱形铜质电极以引出信号。以JX-74A型晶体管血流图仪引出REG信号后输入SJ-42多道生理记录仪记录。分别对正常家兔、实验性脑缺血、脑血肿、高血压家兔进行双肢相当于人手十二井穴的解剖位置点刺放血，出血量为每穴一滴。,10 20 30 40 50 60 手十二井穴刺络放血对正常家兔脑血流图的影响,140 130 120 110 100,t分,REG波幅,（%）,夹闭前 夹闭后 5 15 25 35 45 55 60 t(分) 井穴放血、烟酸对实验性脑缺血家兔脑血流的影响,170 150 130 110 100 90,REG波幅 放血 对照 烟酸,即时 5 15 25 45 t(min) 手十二井穴刺络放血对实验性脑血肿家兔脑血流的影响,130 120 110 100 90,注血侧 非注血侧 对照,REG波幅,2.3实验结果：十二井穴放血可使正常家兔REG波幅升高，且时间持久，至1h尚未恢复到针前水平。第20min时波幅最高，为针前的123.2%，与针前相比，有极显著性差异（P0.01） 。说明此法对正常家兔脑血管有扩张作用，且时间长，表现出明显的后效应。在脑缺血性 家兔模型中观察到，当夹闭家兔一侧颈总动脉造成急性脑缺血后REG波幅明显下降，若施加井穴放血则REG波幅明显升高，各观察值与夹闭后即刻REG波幅比较，均有极显著性差异（P0.01），且持续时间较长，明显优于西药烟酸组和对照未处理组。,在脑血肿家兔模型上亦观察到脑血肿后 REG波幅降低，而手十二井穴放血对REG波幅有显著升高作用。手十二井穴放血还可使高血压家兔已降低的REG波幅显著升高（P0.05），并持续30分钟以上。以上结果表明，手十二井穴放血疗法无论对正常脑血流抑或是脑缺血、脑血肿家兔脑血流供应，均表现出良好的改善作用，且作用迅速、稳定、持久，明显优于临床常用的烟酸，为临床上用于中风病的急救，提供了一定的客观依据,（三）.井穴放血法对中风初起脑血流影响的作用机理研究 1.手十二井穴刺络放血影响脑血流作用的外周刺激因素研究,以夹闭右侧颈总动脉造成的急性实验性脑缺血模型家兔为实验对象，以直接埋藏电极于家兔硬脑膜外引出的REG讯号为观察指标，研究放血、疼痛、穴位三种因素在手十二井穴刺络放血影响REG中的作用 .,1.1放血因素在井穴放血法对脑缺血家兔REG影响中所起的作用,1.1.1实验方法：实验分非放血组与放血组两组。非放血组用毫针针刺各井穴，不出血，放血组用三棱针点刺井穴放血，放血量为每穴1滴。分别观察夹闭后即刻及第5、10、15、20分钟的REG波幅变化。,夹前 夹后 5 10 15 20 t(min),170 150 130 110 90,放血 非放血,REG波幅,1.1.2实验结果：放血组各观察时间的放血组变化均明显大于非放血组（P0.01）。放血组REG波幅平均升高340.9%，且稳定持久。非放血组REG波幅平均升高仅为5.1%，且不稳定。说明“放血”因素对于脑缺血家兔REG波幅升高起了重要作用。,1.2疼痛刺激因素在井穴放血法对脑缺血家兔REG影响中所起的作用 1.2.1实验方法：实验分为井穴加吗啡组、吗啡组、疼痛刺激组。井穴加吗啡组在静脉注射吗啡（5mg/kg）15分钟后，夹闭右侧颈总动脉，然后马上施予井穴放血处理；吗啡组为静脉注射吗啡15分钟后，夹闭右侧颈总动脉；疼痛刺激组为夹闭右侧颈总动脉后，用止血钳夹住家兔双前肢背侧皮肤4分钟，以施加疼痛刺激。三组采用同体对照实验，即每只家兔分别进行井穴加吗啡、吗啡、疼痛刺激三种处理因素的实验，按交叉顺序处理以排除顺序误差。,夹前 夹后 5 10 15 20 t(min),170 150 130 110 90,井穴组 井穴+吗啡组 疼痛组 吗啡组,REG波幅,1.2.2实验结果：在用吗啡阻断痛觉情况下，井穴放血对REG波幅的影响明显减弱，且吗啡加井穴组各观察值与井穴组比较，均有极显著性差异，说明在排除疼痛刺激因素后，井穴放血对REG波幅影响效应显著下降，疼痛刺激在井穴放血中起了主要作用。但井穴加吗啡组在第15、20分钟时与井穴放血前比较有极显著性差异，而吗啡组无显著性差异，提示疼痛刺激不是唯一因素。疼痛组在第15，20分钟时也有显著性差异，直接证明了疼痛刺激可使REG波幅升高，但远不如井穴组明显，可能与疼痛刺激的性质和部位有关。实验结果说明在应用手十二井穴刺络放血改善中风初起脑血流状态过程中，疼痛刺激因素起了一定的作用。,1.3穴位因素在井穴放血法对脑缺血家兔REG影响中所起的作用 1.3.1井穴与它穴放血对脑缺血后脑血流改善作用的影响 方法为造模后，在家兔双前肢点刺曲池穴或各井穴，分别观察夹闭右侧颈总动脉后即刻、第5、10、15、20分钟的REG波幅变化。结果显示井穴放血组使脑缺血家兔REG波幅的升高幅度，明显优于曲池穴放血组（P0.01）。说明曲池穴放血对急性脑缺血家兔REG波幅的升高作用远不如井穴明显，穴位特异性在放血疗法发挥作用中起重要作用，这也与中医多选用井穴泻热开窍、活血通络、醒脑安神的传统急救作用相符合。,夹前 夹后 5 10 15 20 t(min),170 150 130 110 90,井穴组 曲池组,REG波幅,1.3.2手十二井穴刺络放血的简化研究（不同井穴放血对脑血肿后脑血流改善作用的影响） 以急性实验性脑血肿家兔REG变化为指标，观察手十二井穴刺络放血、手六井穴放血、手三阳经刺络放血、手三阴经刺络放血的效果。首次发现，手十二井穴刺络放血可简化为手六井穴放血，即单侧和双侧井穴放血疗效相似，均可对脑缺血后的脑血流供应表现出良好的改善作用，且以脑血肿侧的井穴放血效果为优，此结果为临床应用缪刺法提高疗效提供了实验依据。单侧手六井穴刺络放血还可进一步简化为手三阳经井穴放血，亦可取得较好效果，但手三阴经井穴放血基本无效，对REG波幅仅有短时微弱升高效应。这从一个侧面证明了“阳经上头，阴经不上头”理论的正确性。,以上结果说明井穴较之其它经穴在急性脑缺血或脑血肿后的血流改善方面具有独到的优势，穴位特异性因素在应用放血法急救中风的作用疗效发挥方面占据重要影响。根据情况单、双侧井穴放血均可采用，若为简便起见，亦可仅选择三阳经井穴放血，但不宜仅在三阴经井穴放血。,放血前 即时 5 10 15 20 25 30 45 t(min),125 120 115 110 105 100,12井穴 6井穴 3阳经井穴,REG波幅,%,(四).手十二井穴刺络放血影响脑血流作用的外周传入途径研究 模型制作与观察指标同上。观察到当切断脑缺血家兔双侧桡神经、尺神经、正中神经后，手十二井穴刺络放血疗法提升REG波幅、改善脑血流的作用效应还存在（P0.01），但较之未切断躯体神经组效应有所下降；若切断以上神经的同时用利多卡因阻断肱动脉和肱静脉的血管壁交感神经后，则井穴刺络放血的效应消失。说明神经确实是针灸效应的主要传入途径，而上肢躯体神经、血管壁交感神经是则井穴刺络放血改善脑血流的重要传入途径。,夹前 夹后 5 10 15 20 t(min),170 150 130 110 90,放血 放血+切断神经 放血+切断神经+利多卡因,REG波幅,(五)手十二井穴刺络放血影响脑血流作用的中枢递质机理研究 采用家兔脑室插管及注射技术，以生理盐水为对照，观察了脑室注射阿托品、酚妥拉明、心得安三种受体阻断剂对REG的影响及脑室注射以上药物后施加手十二井穴刺络放血对REG波幅的影响。结果表明阿托品在注射15分钟后明显升高REG波幅（P0.05），酚妥拉明则显著降低REG波幅，心得安则明显升高REG波幅（P0.05）。表明胆碱能M受体兴奋可降低REG波幅，肾上腺能受体兴奋可升高REG波幅，而肾上腺能受体兴奋可降低REG波幅。脑室注射以上药物并施加手十二井穴刺络放血后观察到，阿托品和酚妥拉明降低了放血引起的REG波幅升高效应，心得安则进一步加强了放血引起的REG波幅上升效应。说明井穴放血对REG的影响主要受胆碱能神经和肾上腺素能神经的调控，其中受体、M受体发挥重要作用。,二、井穴放血法治疗急性实验性脑缺血的脑生化基础研究,(一)井穴刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织氧分压影响的动态观察 脑缺血诱导的局部脑组织缺氧状态为缺血性脑损伤的首要病理环节，我们利用针型氧传感器对脑缺血及井穴放血干预后的局部缺血区脑组织氧分压（PaO2）变化进行了动态观测。 1.1动物分组：健康Wistar大鼠30只，雌雄不拘，体重250300g。购回后适应性喂养一周后，随机分为模型组（以下称凝结组）10只、手十二井穴刺络放血组（以下称刺络组）10只及正常对照组10只。,1.2模型制作及测试方法：将大鼠用3戊巴比妥钠腹腔麻醉后，侧卧位，于眼眶后至耳的连线中点纵形切开皮肤约1cm，分离并切去部分颞肌，暴露颞骨，作一个约35mm的骨窗，轻抬脑可见到横过嗅束向上走行的大脑中动脉（MCA）；再将头顶上的软组织向两侧翻开，暴露颅骨，将颅骨上的筋膜钝性剥离干净，用颅骨钻钻一直径为3mm的圆孔，其圆心位置在距颅骨矢状缝1mm处的冠状缝上，将钻起的圆形骨片用细探针挑起，再用镊子将骨片夹住取出。用微型镊子提起硬脑膜，用眼科剪将硬脑膜剪成数瓣，外翻至颅骨上，暴露出软脑膜。将制作好的测试过的性能良好的复合针型固体氧电极固定在大鼠冠状缝上的脑圆孔上，深度为0.5mm，再连接同置于屏蔽箱中的双通道氧分压仪（天津中医学院研制），监测氧分压的变化。正常对照组观察15min；凝结组用烧红的电阻丝轻轻接触靠近嗅束上缘的MCA，使之快速凝闭造成MCAo模型，动态观察15 min；刺络组在MCAo后，即刻予以手十二井穴刺络放血，每穴使出血1滴，然后以消毒棉球按压针孔，连续观察15 min。,1.3实验结果：正常对照组15 min内脑组织PaO2始终保持稳定（P0.05）；凝结组与刺络组的缺血区脑组织内PaO2与MCAo前相比从3min开始明显减少（P0.01），且PaO2的减 少随缺血时间的延长愈加明显，与正常对照组相比有非常显著的差异。但刺络组脑组织氧分压的下降幅度比凝结组下降幅度小，在7min前两组无显著的差异（P0.05），715min内两组达显著的差异（P0.05）。表明手二井穴刺络放血延缓了脑组织低氧状态的发展，从而对脑组织具有一定的保护作用,3 5 10 15 时间（min),0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 -0.5,PO2(mv),假手术组 刺络组 凝结组,大鼠脑缺血区组织养分压变化及手十二井穴刺络放血对其之影响,(二)井穴刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织氢离子浓度影响的动态观察 脑缺血缺氧状态下，能量代谢转变为无氧代谢，葡萄糖无氧代谢产生大量乳酸，同时二氧化碳潴留可产生H+，使酸碱平衡失调。H+浓度堆积可造成血管通透性增加，引起血管源性水肿，这是急性脑血管病的一个重要病理过程。故我们对脑缺血及井穴放血治疗后局部脑组织H+浓度变化进行了动态观察。 2.1实验方法：动物分组及模型制作同前。测试方法基本同氧分压检测，但微型传感器改用小型复合式PH传感针，监测仪器采用DM-6011A型万用表（香港产），各组动态监测20min内缺血区域H+浓度的变化。,2.2实验结果：假手术组H+浓度在20min内保持稳定，刺络组与凝结组H+浓度在20min内与缺血前比较和与假手术组比较均明显升高，有非常显著差异（P0.01）。但刺络组H+升高的幅度比凝结组小，在8min前组间比较达统计学差异（P0.05或P0.01），8min后虽无统计学差异，但其升高幅度仍小于凝结组。此结果提示缺血后即刻施与井穴放血，可一时性抑制H+浓度的堆积，调节缺血局部的酸碱平衡，延缓酸中毒的发展，对脑组织起到一定的保护作用。,5 10 15 20 时间（min),0 -5 -10 -15 -20,PH(mv),假手术组 刺络组 凝结组,大鼠脑缺血区PH变化及手十二井穴刺络放血对其之影响,(三)井穴刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织钾离子、钠离子浓度影响的动态观察 脑缺血缺氧使ATP产生不足，能量很快耗竭，细胞内外离子的浓度差遭到破坏，引起电解质紊乱和脑水肿发生。为观察井穴放血法在调整电解质紊乱中的干预作用，我们利用针型离子选择性电极技术，对缺血区脑组织细胞外的+、Na+浓度进行了动态监测。 3.1实验方法：暴露出软脑膜后，将制作好的、用任氏标准系列液测试过的、性能良好的K+或Na+选择性针型微型电极插入缺血区大脑皮层0.5mrn，固定在大鼠颅顶冠状缝上的脑圆孔上，连接同置于屏蔽箱中的PXS-215型离子活度计，监测15min内K+或Na+浓度的动态变化。各组处置方法同前。,3.2实验结果：正常对照组细胞外K+、Na+浓度15分钟内无明显变化。刺络组与凝结组缺血区脑组织细胞外K+浓度在缺血后15min内较缺血前上升，Na+浓度较缺血前下降，缺血前后比较达非常显著差异（P0.01），两组与正常对照组比较均有明显差异；但在15分钟内刺络组胞外K+浓度上升的幅度和Na+浓度下降的幅度比凝结组小，K+在8min后、Na+在12min后两组比较达显著差异（P0.05或P0.01）；说明井穴放血法可使缺血区细胞内外K+、Na+稳态失衡的状况得到调整。缺血区细胞外液中Na+浓度大幅度降低，很可能是Na+进入细胞内，以至水分子大量进入脑细胞内造成脑细胞水肿。而井穴放细胞外液Na+浓度下降幅度减小，说明进入细胞内引起脑水肿的Na+也相应变少，从而可能缓解了因细胞内外离子失衡而引起的细胞毒性脑水肿的发生与发展。,0 5 10 15 时间（min),0 -5 -10 -15 -20,K+(mv),假手术组 刺络组 凝结组,大鼠脑缺血区K离子浓度变化及手十二井穴刺络放血对其之影响,0 5 10 15 时间（min),0 5 10 15 20,Na+(mv),假手术组 刺络组 凝结组,大鼠脑缺血区Na离子浓度变化及手十二井穴刺络放血对其之影响,(四)井穴刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织兴奋性氨基酸浓度的影响 脑缺血后神经细胞兴奋性提高，胞外兴奋性氨基酸（EAA）浓度升高，EAA的神经毒性作用可引起神经细胞的各种损害。我们对脑缺血后胞外谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的含量进行了测定。 4.1实验方法：采用微透析法对各组大鼠相应部位脑组织进行灌流，用高压液相色谱仪上柱微量测定。 4.2实验结果：模型组和刺络组大鼠在缺血后30min内缺血局部Glu和Asp均升高，随后在6090min后开始回落，但井穴放血组下降的幅度较模型组大（P0.05），提示井穴放血法可调节胞外EAA浓度，对缺血诱导的兴奋性氨基酸毒性作用有一定的抑制功效。,(五)井穴刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织一氧化氮浓度的影响 近年NO在缺血性脑损伤中的作用日受重视，NO对神经系统的作用具有双向性，通常情况发挥其生理效应，但在病理情况下可产生广泛的毒性作用。为考察井穴放血法对缺血后NO损伤的干预效应，我们又做了进一步观察。 5.1实验方法：对各组大鼠相应部位脑组织进行灌流固定，将缺血区脑组织取材后，用改良的Gress法免疫测定仪（318MC型上海三科仪器公司）对NO浓度进行测定。 5.2实验结果：在脑缺血后10min内，模型组缺血区NO浓度显著上升，而刺络组的缺血区NO浓度亦显著上升，上升幅度大于模型组。脑缺血30min后，模型组缺血区NO浓度仍居高不下，与缺血前比较有显著差异（P0.05），井穴放血组则回落，与缺血前比较无统计学差异。提示刺络放血在脑缺血初期刺激NO产生增多，对扩张脑血管、增加脑血流起到一定作用，而随后NO浓度的回落，又可降低NO过度上升导致的神经毒性作用。,(六)井穴刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织细胞内外钙离子浓度的影响 细胞内外Ca2+浓度失衡致大量Ca2+内流引起的胞内Ca2+超载是缺血性脑损伤神经细胞死亡的共同途径，为此，我们对缺血损伤及井穴放血干预后脑细胞内、外的Ca2+活度进行了观测。 6.1实验方法：细胞外液Ca2+浓度的测试方法基本同K+、Na+检测，微型传感器改用Ca2+选择性针型电极，连续20min监测模型组、刺络组脑缺血部位的细胞外液Ca2+变化，并与正常对照组相应部位的Ca2+做同期观察对照。细胞内Ca2+浓度的测定采用荧光探针Fura-2法对相应部位脑组织突触体内Ca2+浓度进行检测。,6.2实验结果：造成脑缺血后，缺血区细胞外Ca2+活度下降，从缺血后第7分钟开始，胞外Ca2+活度的降低与缺血前相比出现显著的统计学差异（P0.05），从第9分钟开始，与正常对照组相比出现统计学差异。而手十二井穴刺络放血可抑制Ca2+的下降趋势，与模型对照组比较，从第7分钟开始出现统计学差异。说明手十二井穴刺络放血有阻止胞外Ca2+浓度降低的作用。细胞内Ca2+在脑缺血30min后，胞内Ca2+浓度升高，与正常对照和假术组比较有非常显著差异，说明此时确存在胞内“钙超载”现象。刺络组细胞内Ca2+浓度在脑缺血30min后亦升高，与正常对照比较有显著统计学差异，但其升高幅度不及模型组，两组比较亦有极显著性差异，说明手十二井穴刺络放血有阻止胞内“Ca2+超载”的作用，从而减轻细胞损害、保护脑细胞。,(七)手十二井穴刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织钙调素活性的影响 脑缺血后兴奋性氨基酸胞外堆积等因素，激活细胞膜上Ca2+通道，使大量Ca2+从细胞膜外进入细胞膜内，造成神经细胞内Ca2+稳态失调，胞内Ca2+超载，钙调素（CaM）活性异常增高，Ca2+与CaM结合后可激活一系列靶酶，引起一系列的病理反应，是造成细胞结构与功能损害，导致细胞死亡的“共同通路”。在观察了手十二井穴刺络放血调整神经细胞内外Ca2+活度的基础上，我们又观察了此法对脑缺血后神经细胞内CaM含量的影响。 7.1实验方法：对凝结组与刺络组大鼠在凝结后15分钟或刺络后12分钟进行血管灌注, 然后分别用手术刀片切下三组大鼠MCA供血区大脑皮层组织，分别放在电子天平秤上称取200mg。采用依赖于CaM的磷酸二脂酶法测定CaM的活性（试剂盒由北京协和医科大学基,础研究所药理室提供）。测定步骤如下：定量称取待测组织，用50mM Triton缓冲液（含1mM EGTA pH7.0）制成匀浆（200mg组织m1），4保存。18000rpm50分钟离心；取上清，100煮沸5分钟；再离心12000rpm30分钟；取上清，用4.5mM CaC12水溶液对半稀释，4保存。测定时，将样品用测定用缓冲液稀释成不同浓度，用液闪仪计数测定。,大鼠脑缺血区细胞内活性CaM含量变化及手十二井穴刺络放血对其之影响,7.2实验结果：MCAO后，凝结组与刺络组有活性的CaM含量均比假手术组显著升高，经组间对照t检验，有非常显著的差异（P0.01）；但刺络组有活性的CaM含量比凝结组低，经组间对照t检验，有非常显著的差异（P0.01）。说明CaM- Ca2+复合物启动的Ca2+通道异常增加，确实在脑缺血后脑细胞损害的发生发展中起重要作用，井穴刺络放血可抑制活性CaM含量的增加，在一定程度上减缓了缺血后脑损害的发展。,C-foc.HPS70,三、井穴放血法治疗急性实验性脑缺血 的分子生物学机制的研究,附 天津中医学院刺络放血研究组简介,课题组单位 天津中医学院 湖南中医学院 北京中医药大学 天津医科大学总医院 天