课件：山医临床病原学检查.ppt

临床病原学实验诊断,山东大学齐鲁医院检验科 孙恩华,感染性疾病: 指各种病原体(病原微生物、寄生虫)感染机体后所引起的传染性和非传染性疾病,临床病原学检查的目的,是确定感染的发生和性质，及早明确诊断，尽早选择适当的治疗方案，采取有效的预防措施，防止感染可能广泛传播所造成的危害,细菌、病毒、螺旋体、支原体、 衣原体、立克次体、放线菌、真菌、 寄生虫,导致感染性疾病的病原体,现代感染性疾病的流行病学特点,新传染病陆续被发现，如O 157 大肠杆菌出血性肠炎、疯牛病、埃博拉出血热、新型肝炎病毒 、SARS病毒、甲型H1N1流感病毒等 一些业已绝迹的老传染病又重新出现，如梅毒、霍乱、结核等 细菌出现多重耐药性，导致抗感染治疗困难。 医院感染和条件致病菌感染增加，免疫功能低下人群增多,临床病原体检查的基本程序,医生、护士、病人、检验师：正确采集运送标本。 检验科：直接镜检、免疫学和分子生物学检测、病原体分离培养鉴定、药敏实验报告结果。 医生：明确诊断、合理用药。,第一节 标本采集、运送和检测方法,标本采集的基本原则,发现感染应及时采集微生物标本作病原学检查。 二、三级医院微生物标本送检率不应低于70%。 尽量在抗菌药物使用前采集标本。采集标本前应至少停药3天。如病人不能停药，应在下次抗生素使用前采集标本。 标本采集时，应严格执行无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其它杂菌的污染。,标本采集后应立即送至微生物实验室，放置时间过长会影响检验结果。如不能立即送检，一般应放在冷藏条件下保存送检。但某些菌株（如淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、嗜血杆菌、肺炎链球菌等）不仅要及时送检，而且在送检过程中要注意保温。 盛标本的容器必须经灭菌处理，但不得使用消毒剂和酸类处理（到细菌室领取），以免残留液体影响细菌的生长。送检时，标本切勿污染容器的瓶口和外壁，防止污染和传播。 送检标本应注明标本来源和检验目的，使实验室能正确选用相应的培养基和适宜的培养环境。,血液 标本的采集,1.采血时机及次数: 采血时机是明确诊断的第一重要因素。无论何时，采集血培养应该在使用抗生素之前进行。,怀疑原发性菌血症、真菌菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或肺炎的患者：在寒战或发烧初期立即采集2或3份血培养。 不明病因的发热，如隐性脓肿，伤寒热和波浪热：发热开始采集2或3份血培养。24h至36h后，估计温度升高之前（通常在下午）立即采集2份以上血培养。 感染性心内膜炎，对急性心内膜炎患者1h（2h内）采集3份血培养，如果所有结果24h后阴性，再采集2份血培养。入院前两周内接受抗生素治疗的患者，连续三天采集血培养，每天2份。 * 一份血培养定义：同一穿刺所获得的血液接种到2瓶血培养瓶中（需氧瓶和厌氧瓶）,2.采血部位,多次采血时, 应在不同部位进行。 不要从血管插管内采血。 3. 采血量 成年人采血量为10 20ml, 新生儿与婴幼儿为15ml。,脑脊液标本的采集,由临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中立即送检，不能暂时保存于冰箱中。 （因引起脑膜炎的病原体脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等抵抗力弱，不耐冷，易死亡）,胸腹水等穿刺液标本,无菌注射器穿刺抽取，置于抗凝与不抗凝无菌容器中立即送检（或直接注入血培养瓶）。 脓性标本应考虑同时做厌氧培养.,尿液标本的采集,应在用药前或停药3天后留取标本, 并使尿液在膀胱内停留68h以上,起床后第一次尿样阳性率较高. 无菌采集中段尿 如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本。 排尿困难者考虑导尿采集标本。,呼吸道标本采集,类型：鼻咽拭、痰和经气管采集的标本。 上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑。,痰标本的采集,采集时间：晨痰，且在取痰前用清水反复漱口。 方法： （1）自然咳痰法： （2）气管镜下采集 （3）气管穿刺法。,创伤及脓肿标本的采集,无菌生理盐水擦洗表面后，无菌棉拭子采集病灶深部的脓液和分泌物，置运送培养基送检。 瘘管可用无菌手术取组织块或碎片放入无菌管内立即送检。 脓肿标本用碘酒、酒精消毒皮肤后，无菌注射器抽取脓液，也可切开排脓后用无菌棉拭子沾取，或将沾有脓汁的最内层敷料放入无菌容器内送检。封闭性脓肿怀疑厌氧菌感染，应隔绝空气采集。 采样前病灶局部应避免使用抗菌药物或消毒剂。,粪便标本的采集,自然排便，挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。 排便困难者，采用直肠拭子采集。 怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养液送检。 传染性腹泻应连续送检3次。,生殖道标本,男性：无菌采集尿道口分泌物或前列腺液。 女性：用无菌棉拭子采集阴道或宫颈分泌物。怀疑厌氧菌感染，应采用阴道后穹隆穿刺法，并立即接种于厌氧平板。 疑似梅毒螺旋体感染，直接从外生殖器硬下疳蘸取渗出液，置于盖玻片上，立即送检。,厌氧菌培养,厌氧菌是人体许多部位（如皮肤、口咽部、肠道和泌尿生殖道）正常菌群中的一部分，因此下列标本不能做厌氧培养： （1）咽、鼻、尿道或直肠拭子。 （2）咳出的痰，通过支气管镜取的分泌物，排出或导出的尿、粪及胃内容物。,病原体检测方法：,直接显微镜检查 病原体分离培养和鉴定 病原体抗原检测 病原体抗体检测 病原体核酸检测,直接显微镜检查的目的与评价（1）,染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。 评价：为临床初步诊断提供依据。,革兰氏染色,革兰阴性双球菌：在生殖道标本或脑脊液中多为奈瑟菌属；在下呼吸道分泌物中提示为卡他莫拉菌,革兰阳性双球菌提示肺炎链球菌,抗酸染色,墨汁染色找新型隐球菌,直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，是寄生虫感染的主要诊断依据。,直接显微镜检查的目的与评价（2）,不染色标本：用于观察病原体的大小、形态与运动等特性。 结果评价：部分病原体可借此初步诊断 1.暗视野显微镜下见弹簧状螺旋体，应怀疑梅毒螺旋体的感染； 2.直接镜检是诊断浅部真菌感染的主要手段。,病原体分离培养与鉴定的目的：,明确感染病原体。 为临床提供体外抗微生物药物敏感试验结果。,细菌分离培养与鉴定的结果评价,无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染的病原体。 存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合细菌的量考虑是否为致病菌。 如临床表现支持感染，但培养阴性，应考虑为标本不合格、培养不恰当等因素。 直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考虑有L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。,病毒分离培养与鉴定的结果评价,必须结合流行病学资料、临床表现、标本来源及病毒种类加以分析。 从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明确诊断。 从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人体不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒、流感病毒等。反之需相应的临床表现，才有病原学意义，如巨细胞病毒，肠道病毒等。 阴性不能排除病毒感染。,病原体抗原与抗体的检测,特异性 IgM可作为感染性疾病的早期诊断指标，且可区分原发与复发感染。 特异性 IgG，尤其双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体感染。 排除交叉抗原的影响，病原体抗原检测可明确感染的病原体。,病原体核酸的检测,聚合酶链式反应(PCR)：扩增病原体微生物特异的DNA或 RNA片段。 探针杂交法：通过已知序列的探针与病原体的核苷酸杂交，用以了解病原体的有无。,病原体核酸检测结果评价,是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。 阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。,临床常见病原体检查方法：,细菌： 普通细菌：常采用直接镜检、分离培养与鉴定明确病原体。 难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物学检测，如军团菌感染以及幽门螺杆菌感染等。 流行病学调查：病原体抗体检测，如ASO试验与Widal反应等。,真菌：,直接显微镜检查：初步明确真菌感染。 分离培养：明确何种真菌感染。 真菌抗原检测：GM试验、 G试验,病毒、支原体、衣原体、螺旋体等病原体多进行病原体抗原、特异性抗体或核酸的检测方法。,第二节 临床耐药细菌的检测,抗微生物药物敏感试验(antimicrobial susceptibility test, AST)：对敏感性不能预测的临床分离株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物。,Automated AST Systems 自动化药敏系统,Vitek 2,MicroScan,Sensititre,Phoenix,体外抗菌药物敏感性试验的目的,临床分离菌株，如不能对抗生素敏感性进行预测，必须常规进行药敏试验。 临床治疗效果差而考虑调整抗菌药物时。为经验用药提供可靠依据。 了解细菌耐药的流行病学情况，为医院感染控制部门提供防治依据。 评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等。,体外抗菌药物敏感试验的方法,体外抗菌药物敏感试验主要包括抑菌试验、 杀菌试验、联合药敏试验和检测细菌产生的抗生 素灭活酶等。常用方法有: 纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 杀菌试验 体外联合药物敏感试验,CLSI AST Standards 2010,MIC最低抑菌浓度,纸片扩散法,The Tables表格,CLSI表1用于检测/报告的药物,CLSI表2A肠杆菌科菌的解释标准,药敏试验结果的解释（1）,敏感 S（susceptible）：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。 耐药 R（resistant）：表示测试菌不能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。,药敏试验结果的解释（2）,中介I (intermediate) : 该范围作为敏感与耐药之间的缓冲区.避免由于微小技术误差影响实验结果。 最低抑菌浓度（MIC）：能够抑制检测菌肉眼未见生长的最低药物浓度称为测定药物对检测菌的最低抑菌浓度。,细菌培养的重要性,细菌获得性耐药机制的迅速发展，使细菌耐药问题变得十分复杂。某些细菌，在同一体内同时存在多种耐药机制，导致细菌多重耐药，治疗失败，给感染性疾病的控制带来巨大的障碍。临床医生单凭经验治疗的状况发生巨大变化，医生需要从实验室得到必要的信息来推测判断感染部位的病原菌及用药规律，使经验用药有依据。,抗菌药物临床应用指导原则 要求抗菌药物应用以病原学监测为基础。根据细菌药物敏感试验选择抗菌药物。危重患者等先给予抗菌经验治疗，获得敏感试验结果后调整给药方案。,革兰阳性菌主要耐药类型：,耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）和万古霉素敏感性降低的MRSA（VISA）和VRSA 耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP） 肠球菌的耐药问题(VRE),革兰阴性菌主要耐药类型：,ESBLs（+）的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及奇异变形杆菌 持续高产染色体型-内酰胺酶(AmpC酶)的阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、吲哚阳性变形杆菌、铜绿假单胞菌等 多重耐药的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌等 产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌,（一）MRS（耐甲氧西林葡萄球菌）(methecillin resistance staphylococcus),MRS的特点是它们都具有一外来基因mecA，负责编码PBP2a，当PBP2a占优势时，由于-内酰胺类药对其亲和力低，使得MRS对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯、单环内酰胺类、 -内酰胺/ -内酰胺酶抑制剂类抗生素均耐药。并提示对氨基糖甙类、大环内酯类、克林霉素和四环素等多种抗生素耐药。,MRS 的治疗 轻度感染 利福平、SMZ-TMP、环丙沙星 严重全身感染 万古霉素,VISA/VRSA (vancomycin resistant S.aureus),万古霉素作为治疗革兰阳性菌感染的最后一道防线，近年来由于大量使用，也发现对万古霉素或替考拉宁中介和耐药的葡萄球菌。日本（1997）首先报告金黄色葡萄球菌对VAN的敏感性降低（MICs 48g/ml），美国和法国也相继报告。耐药机制可能涉及细胞壁和PBPs亲和力的改变，往往在MRSA中出现。如果MRSA对VAN的疗效不好,应考虑VISA/VRSA。,（二）PRSP（耐青霉素的肺炎链球菌） (penicillin resistant S.pneumoni),耐药机制主要是PBPs的变化,使细菌与青霉素的亲和力降低，从而导致对该药的敏感性下降. PRSP对氨苄西林、 氨苄西林/舒巴坦、 头孢克肟、 头孢唑啉的临床治疗疗效很差，治疗时参考药敏结果选择药物，经验治疗重症感染时，可用头孢曲松或头孢噻肟联合万古霉素用药。,(三)VRE(vancomycin resistant enterococcus),肽聚糖交联靶位点改变导致肠球菌对万古霉素耐药： 获得性耐药：从其表型分为两类：VanA型和 VanB型。 VanA型：万古霉素和替考拉宁均高度耐药， VanB型：万古霉素呈不同水平耐药，对替考拉宁敏感。 天然耐药：又称VanC型耐药，主要包括鹑鸡肠球菌、铅黄 肠球菌和微黄肠球菌，其对万古霉素呈低水平耐药， 对替考拉宁敏感。,临床意义,耐万古霉素肠球菌目前尚无有效的治疗方法，但是对青霉素敏感的VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉素和庆大霉素。另外氯霉素、红霉素、四环素（或多西环素、或米诺环素）及利福平可用于VRE株。,（四）HLAR （high level aminoglycoside resistant ),对血培养和脑脊液培养中万古霉素敏感或中介的肠球菌，要用120g的庆大霉素或300g的链霉素纸片检测是否高水平耐药(HLAR)。 高水平氨基糖甙类耐药（ HLAR ）表明当青霉素、氨苄西林或万古霉素联合一种氨基糖甙类抗生素时不会对该肠球菌产生协同效果。,（五）ESBLs(超广谱-内酰胺酶) (extend spectrum -lactamase ),是由质粒介导的-内酰胺酶基因的突变形成。常见于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌。,ESBLs(超广谱-内酰胺酶),灭活（水解）超广谱-内酰胺药物 不水解碳青霉烯类和头霉素类 可被内酰胺酶抑制剂抑制（如克拉维酸） 携带ESBL基因的质粒会同时携带多个耐药基因-氨基糖苷类，甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，氟喹诺酮类，氯霉素，四环素,M100-S20纸片扩散法折点更新(mm): 抗菌药物 旧 (M100-S19) 新 (M100-S20) 敏感 中介 耐药 敏感 中介 耐药 头孢唑啉 18 15-17 14 NA NA NA 头孢噻肟 23 15-22 14 26 23-25 22 头孢唑肟 20 15-19 14 25 22-24 21 头孢曲松 21 14-20 13 23 20-22 19 头孢他啶 18 15-17 14 21 18-20 17 氨曲南 22 16-21 15 21 18-20 17,对于一般不在美国使用或销售的头孢菌素，如头孢孟多，头孢尼西，头孢哌酮和拉氧头孢，其折点没有重新评估。因此，当测试这些药物对大肠杆菌、克雷伯菌属和奇异变形杆菌的抗菌活性时，需要进行ESBLs筛选和确证试验。对于ESBL确证试验阳性的菌株，这些药物的敏感结果均需报告为耐药。,(六）AmpC酶,一些细菌如阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、枸橼酸杆菌属、粘质沙雷菌和铜绿假单胞菌等，可产生低水平染色体介导的AmpC酶，这类细菌有较高频率自发突变，常发生于ampD基因.当存在诱导剂时，AmpC酶的表达水平可增高数十甚至数百倍。三代头孢菌素是弱诱导剂，不会直接导致细菌耐药,当连续使用三代头孢菌素治疗时，可使细菌去阻遏持续高产AmpC酶，水解包括第三代头孢菌素在内的多种抗生素，从而导致临床治疗失败。,治疗,使用第三代头孢菌素及含酶抑制剂的复合抗生素治疗通常导致临床治疗失败，应选用第四代头孢菌素或碳青霉烯类或联合氨基糖甙类（或氟喹诺酮类）治疗。,（七）产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌 （New Delhi Metallo-lactamase 1, 型新德里金属-内酰胺酶）,是由细菌质粒上携带的blaNDM-1基因编码的。 金属-内酰胺酶其水解底物包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等，表现为产酶细菌对这些药物广泛耐药。金属-内酰胺酶首先在铜绿假单胞菌、不动杆菌中发现。迄今为止已经确定的金属-内酰胺酶除NDM-1外，还包括IMP、VIM、GIM、SIM、SPM等型。,主要菌种为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其它细菌还有阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等； 在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时以及我国香港地区等都已经有感染病例报道。,临床特点：,产NDM-1细菌感染患者临床表现与敏感菌感染没有差别，这些细菌主要引起尿路、血流、伤口、肺部和导管相关感染等。感染患者抗菌治疗无效，特别是碳青霉烯类治疗无效， 与其它多重耐药菌感染相似，产NDM-1细菌感染的易感人群：疾病危重、入住重症监护室、长期使用抗菌药物、插管、机械通气等。 传播方式：根据患者感染情况以及细菌本身特点，可能主要通过密切接触，如污染的手和物品等方式感染。,治疗,目前有关产NDM-1细菌感染治疗的临床研究较少。产NDM-1细菌几乎对所有-内酰胺抗菌药物耐药，同时由于细菌具有其它耐药机制，对氨基糖苷类、喹诺酮类等也多耐药，对粘菌素/多粘菌素和替加环素具有较高体外敏感性。,(八)非发酵革兰阴性杆菌,铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌 嗜麦芽窄食单胞菌 洋葱伯克霍尔德菌 脑膜炎败血黄杆菌,粘菌素/多粘菌素B对大多数多药耐药铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌和其他革兰阴性菌有抗菌活性，是最后求助药物。, 合理使用抗生素,世界卫生组织曾发出警告：滥用抗菌药 将使人类回到无抗菌药的时代,第三节 医院感染的实验诊断,医院感染（ hospital infection）： 是指患者在入院时既不存在，也不处于潜伏期，而在医院内发生的感染包括出院后发病而又证实是在住院期间受到的感染又称医院获得性感染,医院感染的高危人群,慢性疾病，如肿瘤、糖尿病以及肝硬化等。 免疫抑制剂及激素的使用者。 化疗及放疗患者。 手术及麻醉患者。 使用介入性诊断与治疗的患者。 广谱抗生素使用者。,医院感染的感染源,病原体来自住院病人、医务人员、探视者、陪护者。 医院环境、未彻底消毒灭菌的医疗器械、血液制品的污染等。,医院感染常见的病原体,细菌为主要病原体。 细菌的种类因时、地和人而异。 不同临床类型其感染细菌的构成比不同。,目前引起院内感染的病原微生物以革兰阴性杆菌居多（约占），主要是铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、不动杆菌、克雷伯杆菌、肠杆菌属等，革兰阳性球菌占左右，如金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属等目前，随着临床使用免疫抑制患者的增多，使真菌患者的发病率显著增高,医院感染检查内容,基本原则与病原体感染类似，但更应注意正常菌