毕业设计（论文）-富油微藻的诱变与遗传转化.doc

毕业设计说明书(论文) 作 者： 学 号： 0904150116 院 系： 化学工程学院化学工程学院 专 业： 生物工程生物工程 题 目： 富油微藻的诱变与遗传转化富油微藻的诱变与遗传转化 指导者： 副教授 评阅者： 2013 年 6 月 吉 林 摘 要 i 摘摘 要要 温室效应与石化能源紧缺已成为全球问题，生物燃料作为一种可再生且环境 友好型的替代能源受到人们的广泛关注。不少微藻含油量高，环境适应能力强， 净碳值几乎为零，尤其是生物柴油最重要的原料来源之一。本论文对高油脂微藻 藻种筛选、高密度培养，实验中利用了苏丹黑染色法将藻细胞染色，在645nm波长 光下测量吸收峰并进行比对，最高的吸收峰值即可得出藻种富油最佳的培养基， 即富油微藻的最优代谢生长环境条件；同时利用酸热萃取法提取测量该最优富油 环境下藻细胞中含油量为38.16mg/g。 通过本课题实验，会对提高微藻生物柴油的经济性提出一条极有可能实现工 业化的潜在高效的生产途径。 关键词关键词 生物柴油 富油微藻 代谢条件 苏丹黑染色法 酸热萃取法 abstract ii abstract the greenhouse effect and petrochemical energy shortage has become a global issue, biomass as a renewable and environmentally friendly alternative energy attention. a lot of microalgae with high oil content, strong adaptive capacity to environment, net carbon value is almost zero, it is the most important source of biodiesel. in this paper, the high oil microalgae screening, high density culture, the sultan black staining the algae cell staining, measuring the absorption peak and compared in the 645nm wavelength, the maximum absorption peak to the medium of algal oil rich best, that is the optimal metabolic oil-rich microalgae growth condition at the same time, the optimal extraction; measurement of oily algae oil environment for 38.16mg/g by using acid hot extraction method. through the experiment, put forward a potentially efficient production way is very likely to achieve industrialization to improve the economy of microalgae biodiesel. keykey wordswords biodiesel; oil-rich microalgae; metabolic conditions; sultan black staining; acid hot extraction method 目 录 iii 目 录 摘摘 要要i abstract.ii 目 录.iii 第 1 章 绪 论.1 1.1 课题研究背景 1 1.1.1 研究项目背景1 1.1.2 微藻固定 co2 及与油脂代谢的关系 2 1.1.3 基因工程技术微藻脂类代谢途径2 1.1.4 基因工程方法改造微藻3 1.2 课题研究目的和意义 5 1.3 国内外研究现状和发展趋势.5 1.4 主要研究内容与技术路线 .9 1.4.1 主要研究内容.9 1.4.2 实验中可能遇到的困难和解决办法.9 1.4.3 采用的技术路线.9 第 2 章 实验材料和方法.11 2.1 实验材料.11 2.1.1 藻类培养基的配制方法11 2.2 微藻藻种采集分离纯种培养及保存方法 12 2.2.1 藻种采集及富集培养12 2.2.2 藻种的分离13 2.2.3 藻种的纯化培养14 2.2.4 藻种的保藏14 2.3 筛选获得实验藻类.15 2.4 实验流程.15 2.4.1 接种15 2.4.2 不同代谢条件驯化16 2.4.3 苏丹黑染色16 目 录 iv 2.4.2 苏丹黑 b 染色液的配制.16 3.2.3 染色后微藻细胞的吸光值与油脂含量17 2.4.4 测量含油量18 第 3 章 不同碳氮比下培养微藻产油结果.19 3.1 不同代谢条件驯化.19 3.2 苏丹黑 b 染色测微藻油脂20 3.3 不同碳氮比条件下微藻吸光度数据 21 3.4 实验数据分析.22 第 4 章 微藻富油脂化培养的初步探讨.23 结 论.24 参考文献.25 致 谢28 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 1 - 第第 1 章章 绪绪 论论 1.1 课题研究背景 1.1.1 研究项目背景 能源是国民经济可持续发展的动力，是现代工业的支柱。现今石化燃料资源 日益枯竭给全球经济发展带来危机，其燃烧产物 co2造成的温室效应也给全球环 境敲响警钟，人们逐渐开始寻求替代能源。生物质能是地球上最普遍的一种可再 生能源，它通过植物光合作用将太阳能，以化学能形式储存在生物体内，被称为 绿色能源。现今欧洲国家广泛使用的生物柴油便是一种生物质能，其原料主要来 自高油脂农作物，如大豆、葵花籽等，但它们都存在产量低、成本高、经济性差、 与其他农作物争夺土地等缺点，所以在原料的选择上应更加审慎和全面考虑。 藻类，尤其微藻，能有效利用太阳能，将 h2o、co2和无机盐转化为有机资 源，在能量转化和碳循环中十分重要。微藻富含蛋白质、脂肪、糖以及氨基酸、 高不饱和脂肪酸等多种生物活性物质，是人类向海洋索取食品、药品、精细化工 产品等重要材料的一把金钥匙。就全球来说，微藻是巨大的可再生资源，同时也 是生物燃料的重要来源。微藻可生产几种生物燃料:一些微藻富含类似矿物油的烃 类物质，可加工成汽油、柴油使用1;利用微藻生物质厌氧消化可以生产甲烷等 气体燃料2;一些蓝藻和绿藻能在特定条件下通过光合作用产氢3;另一些微藻能 将光合产物转化成油脂储存在细胞质中，该油脂与高等植物油相似，都属甘油三 酯(tag，又称中性脂，油脂)，可加工转化为含硫量、黏度及熔点较低的酯类，如 脂肪酸甲酯(c14c22)，即生物柴油4。微藻具有光合效率高，零净碳值，易培 养，生长周期短，油、烃含量高等优点5，并且“不与农争地，不与人争粮” ，不 影响全球能源分配，其作为生物能源，已引起各国政府和学者的高度关注。 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 2 - 1.1.2 微藻固定 co2 及与油脂代谢的关系 自养微藻以 co2为碳源，了解微藻固定 co2及其与油脂代谢的关系，采用基 因工程尽可能将 co2转化为油脂，达到固碳和产油双重功效，成为基因工程的研 究方向。 还原戊糖磷酸途径(c3 途径)、双羧酸途径(c4 途径)，景天酸代谢途径(cam 途径)、是植物的三大光合碳代谢途径。其中，c3 途径较简单较古老，是大多数植 物的碳固定机理;c4 和 cam 途径则比较复杂，一般只在一些高度进化的植物中出 现，没有 c3 途径广泛，尤其 cam 机理只存在于仙人掌等耐旱植物中。微藻为低 等单细胞生物，被认为普遍依靠 c3 途径，现在仅在 phaeodactylum tricornutum 等 少数硅藻中发现了 c4 途径存在的证据。c3 循环中，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶催 化核酮糖-1，5-二磷酸固定 co2，生成 3-磷酸-甘油酸，该分子也是糖酵解的中间 体，可进一步生成油脂。这个酶催化反应是光合作用碳固定以及油脂合成过程中 关键的限速步骤，因此核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶是该过程的重要调节酶6，采 用 ge 使核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶高效表达，很可能会提高微藻固定 co2和油脂 积累能力。 1.1.3 基因工程技术微藻脂类代谢途径 油脂生物合成是生物界广泛存在的多酶催化过程，属初级代谢的一部分。微 藻大多为真核细胞，其产油脂的过程，本质上与动植物产油脂的过程相似，细胞 中油脂生物合成路径如图 1 所示，由两个主要步骤组成:脂肪酸生物合成和油脂生 物合成。 脂肪酸生物合成 脂肪酸生物合成是油脂生物合成的基础过程，如图 1-1 中间虚线框所示，起始 于乙酰 coa 羧化酶(acetyl-coenzyme a carboxylase，accase)催化乙酰 coa 转化为 丙二酰 coa，然后脂肪酸合酶(fatty acidsynthetase，fas)便以丙二酰 coa 为底物 进行连续聚合反应。丙二酰 coa 转移到 fas 的亚基，即酰基载体蛋白(acyl-carrier 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 3 - protein，acp)，与 acp 上的硫醇基团形成硫酯产生丙二酰 acp;同样，乙酰 coa 也与 acp 形成乙酰 acp，再转移到 fas 上形成乙酰合酶。丙二酰 acp 与乙酰合 酶经 fas 的另一个亚基，即 -酮酰-acp 合酶催化缩合形成乙酰 acp，随后经过 羰基还原、脱水、还原三步连续反应形成丁酰 acp。丁酰 acp 取代乙酰 acp，与 丙二酰 acp 缩合，进入第二轮碳链延伸。这个循环不断重复，以每次循环增加两 个碳的频率延长碳链，直到形成碳 16 或碳 18 的碳链，最后脂酰 acp 硫酯酶切掉 酰基链，释放脂肪酸7。 油脂生物合成 油脂在微生物细胞内以脂滴或脂肪粒形式储存于细胞质中8。油脂是以甘油- 3-磷酸(glycerol-3-phosphate，g3p)和脂酰 coa 为主要前体。如图 1-1 下部虚线框 所示，首先 g3p 和脂酰 coa 在甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-sn-3-phosphate acyl-transferase，gpat)作用下酰化形成溶血磷脂酸，然后在溶血磷脂酸酰基转移 酶(lysophosphatidate acyl-transferase，lpat)作用下与另一个脂酰 coa 进一步酰化 形成磷脂酸，再由磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acidphosphatase，pap)催化去磷酸化 形成甘油二酯，最后二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyl-transferase，dgat) 催化将第三个脂酰 coa 加到甘油二酯分子上形成油脂9。参照图 1-1。 1.1.4 基因工程方法改造微藻 乙酰 coa 羧化酶(accase) accase 乙酰 coa+co2+h2o+atp丙二酰 coa+adp+pi (1) 二酰基甘油酰基转移酶(dgat) dgat 甘油二酯+脂酰 coa甘油三酯+coa (2) 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc) pepc 丙酮酸+co2+h2o+atp草酰乙酸+adp+pi (3) 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 4 - co2储存 co2 葡萄糖 c3 系统 糖酵解 甘油醛-3-磷酸 糖酵解 磷酸烯醇丙酮酸盐（或酯） pepc 苹果酸盐（或酯） me 丙酮酸盐（或酯） 草酰乙酸盐（或酯） 醋酸盐；醋酸酯 acs 乙酰辅酶 a acl 柠檬酸盐 accase 乙酰磷酸酶 丙二酰辅酶 a 乙酰合成酶 fas 丙二酰 acp 乙酰乙酰基 acp 脂肪酸的生物合成 酮酰 acp 脂肪酸 3-磷酸甘油 反应 gpat 脂肪酰基辅酶 a liso 磷脂酸 lpat 磷脂酸 tga 的生物合成 pap 甘油二酯 dgat 三酰基甘油 图 1-1 微藻脂肪酸和油脂生物合成途径 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 5 - 1.2 课题研究目的和意义 化石能源危机与二氧化碳排放已成为人类的两大难题，生物柴油是环境 友好的可再生替代能源。在其原料中，藻类油脂产率高且容易培养，被认为 是潜在的最佳生物柴油原料之一。国内外学者经过选育、诱变，获得了含油 量达到 2060%的微藻菌株；然而大多数微藻含油量并不高，为进一步提高含 油量，尤其是适合低温生长的本地微藻。 通过诱变与遗传转化等手段提高本地微藻菌株的产油量。尤其是在对营 养条件和培养条件的代谢途径优化方法上着手，会大大提高微藻在产油环节 上的产油率。通过本课题实验，我们相信这会对提高微藻生物柴油的经济性 提出一条极有可能实现工业化的潜在高效的生产途径。 1.3 国内外研究现状和发展趋势 除了基因工程改造藻种，通过对营养条件和培养条件进行优化，也可引导细 胞代谢进入脂合成过程，从而实现微藻高产油。 表 1 显示了一定培养条件下不同微藻的生长和产油情况，以及氮浓度、温度、 通气等对藻生长和产油的影响。 实际生产中可以通过改善培养条件使产油率达到最高，如表 1 所示采用葡萄 糖异养 chlorella protothecoides，藻的生长速度快、油含量高，产油率最高可达 3 679.1mgl1d110，远超过其余几种培养结果; 但异养微藻消耗葡萄糖等有机碳源，成本较高，并且释放 co2，不能转化太 阳能和利用空气中 co2。如表 1 所示，氮源种类、氮源浓度、盐浓度、铁离子浓 度和光强等都会影响细胞内油脂积累。 黄建忠等3发现 nh4no3、尿素等适合细胞生长但不适合油脂合成;蛋白胨、 牛肉膏不适合细胞生长但利于油脂合成;酵母膏不仅适宜细胞生长，也是油脂合成 的最佳氮源。 li 等11研究了氮源种类和浓度对 neochloris oleoabundans 细胞生长和脂积累 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 6 - 的影响，硝酸盐、氨、尿素是最普遍的氮源形式，其中 nano3是该藻生长和脂积 累的最适氮源，脂含量、脂产率、生物质产率分别出现在 nano3浓度为 3mm、5mm 和 10mm 时。 takagi 等12在高盐条件下培养 dunaliella，当初始盐浓度从 0.5m 增至 1m 时，含油量由 60%增至 67%;当初始盐浓度为 1m，并在对数期中期或末期加入 0.5m 或 1m 盐时，含油量可增至 70%。 刘志媛等13在高浓 fe3+条件下培养 chlorella vulgaris，改变了藻株的代谢途 径，使油脂出现两次积累高峰，含油量提高了 7 倍，达细胞干重的 56.6%，并且高 fe3+浓度对藻株生长影响不大。 台湾成功大学 wu 和 hsieh14采用嵌有透明隔间的敞口槽来自养培养 nannochlorosis oculata，在最适的盐度、氮源和光强下油脂含量达 60%，比传统的 分批培养增加了 76%。 研究发现能源、碳源充足而其他营养成分(如氮、硅、磷)胁迫可诱导某些微藻 积累油脂，其中氮是报道最多的营养限制因子。虽然处于“饥饿”状态的大部分 微藻积累油脂，但此时藻体生长缓慢，导致产油率下降，实际生产中要使产油率 最高，必须在微藻总生物量和细胞油脂含量间寻求平衡。 营养成分胁迫诱导微藻积累油脂的可能原因是:氮是细胞大分子(如酶、膜)或 细胞结构的成分，硅是硅藻细胞壁组成成分，氮硅胁迫使细胞分裂和增殖受到抑 制，并且营养限制时细胞对碳的同化将更多地流向脂肪，其他非脂类成分也会逐 渐向脂肪转化，油脂积累;磷对细胞能量的生物转化相关过程(如光合磷酸化)非常 重要，光合作用需大量蛋白，蛋白合成需要富含磷的核糖体，磷胁迫使光合作用 受限，细胞代谢将倾向于脂合成。微藻产油脂可分为两个阶段，即藻体增殖期和 油脂积累期，这两个阶段对营养盐要求不同。 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 7 - 表 1-1 不同培养条件下部分微藻的产油脂情况 种类培养条件 生物生产力( mgl1 d1) 脂质 含量 (%) 生物生产力( mgl1 d1) 参考 10%co226.55215.5165 bottyococcus 藻 5.5% co2废气772420.65 足够的氮412510.2511 低氮363412.24 足够的氮27.9298.0910 chlorella emersonii 低氮79.36349.96 足够的氮32.93110.2 微小小球藻 低氮15.7578.95 杜氏盐藻高盐506733.560 半连续自养49730.415123 在 15自养61.114.929.1171 在 20自养126.77.910.01 在 25自养72.713.8910.1 微绿球藻 自养在 20/还 原氮含量 75% 103.515.8616.41 neochloris oleoabundans 硝酸钠作为氮源4003413359 pleurochrysis carterae 户外滚道池塘长 期培养 1903362.721 10%co2217.5920.6565 斜生栅藻 5.5% co2 废气2031839.44 足够的氮2253476.572 nannochloris sp. 低氮97.542.441.34 在连续光自养18030.954.869 在连续光自养21029.661微绿球藻属 在连续光自养17035.760.9 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 8 - 种类培养条件 生物生产力( mgl1 d1) 脂质 含量 (%) 生物生产力( mgl1 d1) 参考 在连续光自养1412 异养性葡萄糖/分 批培养 548.657.8317.113 异养性葡萄糖/初 级 2191.355.2 1 209.6 异养性葡萄糖/改 进的补料 chlorella protothecoides 分批培养 7314.350.33 679.1 无 fe3+7.867 高浓度 fe3+56.6 自养15.3768 异养性32.85 10%co2104.766.66.9165 在连续光自养20018.436.969 在连续光自养17019.232.6 自养 15d36.6726.719.7570 自养 20d4329.5312.77 在 25条件下自 养 13614.720.2271 在 30条件下自 养 1365.98.16 自养在 30/还 原氮含量 75% 132.615.3120.3 足够的氮29.3185.2710 低氮37.14014.84 足够的氮402811.211 普通小球藻 低氮245813.92 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 9 - 1.4 主要研究内容与技术路线 1.4.1 主要研究内容 本课题以前期工作者完成的微藻吸收高浓 co2的研究为基础，着重微藻的选 育和高浓度培养。其研究内容主要包括以下几个方面： （1）高浓度微藻的分离纯化。 （2）苏丹黑 b 法测定微藻的油脂含量。 （3）不同碳氮比培养基微藻的生长状态和油脂含量。 1.4.2 实验中遇到的困难和解决办法 1.4.2.1 实验中遇到的困难 （1）从自然界中分离并纯化得出优良藻种； （2）细胞增殖期是微藻消耗培养基中的氮源，吸收利用蛋白质，以保证藻体 代谢旺盛;当藻体细胞增殖率剧增，以消耗碳、氮源为主，并合成积累大量油脂。 所以对微藻产油过程中培养基中最佳的碳氮比、温度以及酸碱度等有待研究； （3）初期培养时因气温低而生长缓慢。 1.4.2.2 解决办法 （1）采用稀释法再接种的方法实现分离，在改变影响因素的代谢条件中生长 完成对其代谢的驯化； （2）针对各种影响条件还需做大量的正交试验来得出所需的数据；培养前期 宜采用完全培养使细胞快速生长获取大量藻体，产油阶段宜采用营养盐限制以积 累更多脂肪。 （3）使用苏丹黑染色法将其染色，利用分光光度计测出不同代谢环境藻的吸 收峰值，经行对比得出最高值，进而得出该峰值所对应的代谢条件为最优。 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 10 - 1.4.3 采用的技术路线 分离 扩大培养 离心 藻类 纯化 实验用藻 正 苏丹黑染色 测量吸光度 交 实 整理数据 比较吸收峰 max 改变代谢环境因素 验 当下吸收峰对应的代谢环境最优 利用酸热萃取法提取，测含油量 图 1-2 实验技术路线示意图 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 11 - 第第 2 章章 实验材料和方法实验材料和方法 2.1 实验材料 2.1.1 藻类培养基的配制方法 本实验使用的是从自然界中采集的普通藻类，通过查阅大量文献，培养基的 配制方法是水生四号培养基。培养基配方如表 2-1： （1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外） ，如氨盐、硝酸盐、有机氮等。 （2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。 （3）要考虑各种盐类总浓度和 ph 是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节 ph。 （4）要加入各种藻类需要的微量元素（土壤浸提液） 。 （5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。 （6）要添加适量生长物质如维生索 b1、b2 等（土壤浸提液） 。 表 2-1 为水生四号培养基配方 化学药品用量 nh4no30.2gl ca(h2po4)20.03gl mgso40.08gl kcl0.025gl nahco30.1gl k2hpo4 . 3h2o0.01gl fecl31%水溶液1 滴l 土壤浸提液0.50mll 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 12 - 2.1.2 实验所用试剂 本实验所用药品及试剂见表 2-2： 表 2-2 为本实验所用试剂 名称纯度生产商 氢氧化钠（颗粒状）分析纯天津市北方天医化学试剂厂 氯化钠分析纯天津市北方天医化学试剂厂 硝酸钠分析纯天津市北方天医化学试剂厂 铁氰化钾分析纯天津市北方天医化学试剂厂 氯化钾分析纯天津市北方天医化学试剂厂 磷酸氢二钾分析纯沈阳市华东试剂厂 磷酸二氢钾分析纯沈阳市华东试剂厂 硫酸镁分析纯天津市北方天医化学试剂厂 氯化钙分析纯天津市北方天医化学试剂厂 三氯化铁分析纯天津市北方天医化学试剂厂 酵母膏分析纯天津市北方天医化学试剂厂 (nh4)6mo7o24 . 4h2o分析纯天津市北方天医化学试剂厂 edta分析纯天津市北方天医化学试剂厂 2.2 微藻藻种采集分离纯种培养及保存方法 2.2.1 藻种采集及富集培养 水样的采集主要通过对池塘水进行收集。将水样取到实验室以后，这时立刻 将水样转移到宽大的水生生物专用的培养箱内。采样和预备培养：采集含有所需 分离的微藻水样，并在显微镜下检查。若发现所需微藻含量较多，则可立即分离； 否则，需进行预备培养，待其增多，再分离。 预备培养应注意，当培养液含有不同的微藻，对于难以培养的微藻，加入土 壤抽出液有利于培养。一般的预备培养液营养成分浓度较低，为原配方的 1/41/2。当水样中含有多种微藻，最好使用几种不同的培养液，提高微藻遇到适 合其繁殖的培养液的几率，从而促进微藻在其中的繁殖。在三角烧瓶或试管中加 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 13 - 入容量的 1/41/3 的培养液，然后把经筛绢过，滤除了大型浮游生物的水样接种 进去，然后将其放在室内靠北窗口下培养，同时保持温度合适。根据培养微藻不 同，每天采用不同操作，例如，对于附着藻，容器可静置不动，而对于浮游藻， 每天应摇动一次。 通过以下方法得到土壤抽出液：在试管底部加入高 1cm 左右的土壤（需要腐 殖话的农田或庭院土） ，之后加入水至 5cm 处，塞上棉塞，121 摄氏度高压蒸汽灭 菌 20 分钟。 2.2.2 藻种的分离 稀释分离法 清洗灭菌五只试管，标号 1-5 号，1 号试管中加入 9ml 无菌水，2-5 号试管分 别加入 8ml 无菌水。无菌工作台上取 1ml 样藻加入 1 号试管，摇匀后再取 2ml 加入到 2 号试管中，重复操作至 5 号试管。依次将五只试管取样在显微镜下血球 计数，得到将样藻稀释 106倍时视野中存在 6 个细胞。 以此为基础，取 8 支试管标明 1-8 号，1-5 号分别装入 10ml 无菌水，另配制 水生四号培养基 100ml。无菌环境下取 100ul 样藻于 1 号管内，摇晃均匀后从 1 号管内取 100ul 于 2 号管，重复操作至三管。 将三号管取样置于显微镜下镜检，拍照。 计算后取 3 号管中 200ul 于 4 号管中摇匀，再取 1ml 于 5 号管中，摇匀。 将锥形瓶中水生四号培养基取各自加入 6、7、8 号试管中，每只试管中加入 5ml 培养基，再分别接种 5 号试管中的样藻 1ml。 将 6、7、8 号试管放入培养箱中观察培养，得到纯种微藻。之后倒入 250ml 锥形瓶中培养。 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 14 - 图 2-1 显微镜下分离后的球形微藻 2.2.3 藻种的纯化培养 当获得单种培养后，一方面需要进一步扩大培养，另一方面也可把藻种作较 长时间保存，当需要时随时取出使用。对于藻种培养要求还是比较严格，所有培 养容器可用各种不同大小的三角烧瓶，容量应该有 100、300、500、1000 毫升， 这样适于逐渐扩大培养。所有的培养容器和工具都需经煮沸灭菌或者使用化学药 品灭菌后，接着用煮沸水冲洗，并且培养液也用加热灭菌法灭菌。最后按种后瓶 口用灭菌纸包扎封口，将其放在适宜光、温条件下培养，每天轻轻摇动二次。这 样大约二周后进行一次移植。而且藻种在培养过程中必须定期用显微镜检查，保 持不受其他生物污染，保证收获到较纯的单种微藻。 2.2.4 藻种的保藏 扩培好的微藻可接在固体培养基上，在常温、弱光下通常可以保藏半年到一 年；也可在低温下（比如冰箱内）保藏，但是每天接受短时间（比如几个小时） 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 15 - 的弱光，可保藏 23 年；但是如不照光，则只能保藏几个月。所有保藏藻种所用 培养基的营养成分的浓度应比正常培养基高一些，通常一般可增加一倍，其中琼 脂量为 11.5。同时也可在固体培养基上，之后再加培养液，然后接种到培养 液中，就可以避免固体培养基的干涸，使用保藏效果比单用固体好。 2.3 筛选获得实验藻类 根据目前藻类处理烟气方面的文献，经过综合考虑后，本课题实验研究选用 东北电力大学池塘里的微藻作为实验研究的藻种。图 2-1 和图 2-2 是实验中两种藻 类细胞的图片。 图 2-2 为线形微藻细胞显微图片 图 2-3 为球形微藻细胞显微图片 2.4 实验流程 实验流程如下：水样采集藻种分离纯化扩大培养形成实验用藻接种 不同营养环境下驯化苏丹黑染色测吸光度比较分析最佳代谢环境测含 油量。 2.4.1 接种 在将所需药品、设备等准备好后，根据实验将锥形瓶编辑号码（从 1 至 9） ， 根据所需数据称量药品，注意氮源所取不同，配置 1l 培养基 9 瓶，塞棉花绑线封 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 16 - 口，放入灭菌锅中进行灭菌，根据灭菌锅的安全使用操作完成操作，保持在 121124mpa,20min，自然冷却至一定温度，取出放入洁净工作台，在配制的培养 基温度降至 30左右时，开启紫外灯照射灭菌 20min 后，开始经行接种。 用酒精棉擦拭双手及工作台，点燃酒精灯，打开培养基的封口，并用枪头吸 取分离后经行第一次扩大培养的藻液，按 2%（v/v）的接种量接种，再一次完成 所有的接种实验操作，封口处理，清理实验工作台。 放到阳光充足的地方。 2.4.2 不同代谢条件驯化 4 月份以后，温度保持 2527（基本上培养地点在寝室、化学楼二楼） 实验操作按照表 2-3 完成。 表 2-3 改变碳氮驯化实验数据表 序 号 nh4no3(g)cacl2(g)mgso4(g)kcl(g)nahco3(g)fecl(aq)k2hpo43h2o(g) 10.10.030.080.0250.11 滴0.01 20.120.030.080.0250.11 滴0.01 30.140.030.080.0250.11 滴0.01 40.160.030.080.0250.11 滴0.01 50.180.030.080.0250.11 滴0.01 60.20.030.080.0250.11 滴0.01 70.220.030.080.0250.11 滴0.01 80.240.030.080.0250.11 滴0.01 90.260.030.080.0250.11 滴0.01 2.4.3 苏丹黑染色 2.4.2.1 苏丹黑 b 染色液的配制 称取 0.3 g 苏丹黑 b 粉末,溶于 100 ml70% (v /v,下同)乙醇中，室温下放置 46 d, 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 17 - 期间经常摇动,让其充分溶解后过滤,于 4下保存备用。 3.2.2 染色后微藻细胞的吸光值与油脂含量 将分离、纯化后的藻液置于光照强度为 3 5007 000lx；温度为 2027；ph = 7. 68. 2 环境下，称取 0.5g 经脱盐处理的湿藻样,加入 50ml 的蒸馏水,充分混合均 匀,然后按体积比 1：2、1：3、1：4、1：5、1：10 稀释成 5 个藻浓度. 每个浓度 分别取 2 支试管,各加入 5ml 藻液和 5mlhcl 溶液（1m ol/l）,充分混合后,一管加 入 0.4ml 的苏丹黑 b 染色液,另一管(对照管)加入 0.4ml70% 乙醇,充分混匀,在沸 水浴中加热 10min(不时摇动,使加热均匀),冷却后于 10000 r/min 下离心 10min.取出 微藻细胞沉淀物,用 50%（v /v,下同)乙醇洗涤 3 次后,加入 5ml70%乙醇混匀微藻 细胞,在 645nm 波长光下测定其吸光值(染色后的微藻细胞在此波长光下具有最大吸 收峰值),比色皿光程为 1 cm。 图 2-4 苏丹黑法染色后的藻细胞实物图 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 18 - 2.4.4 测量含油量 采用常规的酸热萃取法，测定微藻细胞油脂含量。 称取一定质量微藻细胞湿重，按每克藻体加入 15 ml 盐酸溶液（4 m ol/l ）的比 例混和均匀，室温下静置 25 h；然后沸水浴中加热 30 m in，冷却后分别加入等体 积的氯仿和甲醇，混匀摇动、充分萃取,离心后取上层液，在旋转蒸发器上挥发除 去溶剂后得到微藻油脂，称取微藻油脂重量。基于微藻湿重,微藻细胞油脂含量单 位为 m g /g。 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 19 - 第第 3 章章 不同碳氮比下培养微藻产油结果不同碳氮比下培养微藻产油结果 实验流程如下：水样采集藻种分离纯化扩大培养接种不同营养环 境下驯化苏丹黑染色测吸光度比较分析最佳代谢环境测定含油量。 3.1 不同代谢条件驯化 实验材料：锥形瓶9（1l） 、棉花塞、量筒（1000ml） 、移液枪、灭菌锅等。 实验方法：配制不同碳氮比的水生四号培养基于 1l 锥形瓶中，并进行高压蒸汽灭 菌，之后无菌条件下分别接种纯种样藻， 3 月份时，因为室温温度过低，造成藻类生长过慢； 4 月份以后，温度保持 2527（基本上培养地点在寝室、化学楼二楼） ； 5 月份，得到大量不同条件驯化下的藻类，为染色准备； 驯化实验数据如表 3-1： 表 3-1 驯化实验数据表 序 号 nh4no3(g)cacl2(g)mgso4(g)kcl(g)nahco3(g)fecl(aq)k2hpo43h2o(g) 10.10.030.080.0250.1 1 滴 0.01 20.120.030.080.0250.1 1 滴 0.01 30.140.030.080.0250.1 1 滴 0.01 40.160.030.080.0250.1 1 滴 0.01 50.180.030.080.0250.1 1 滴 0.01 60.20.030.080.0250.1 1 滴 0.01 70.220.030.080.0250.1 1 滴 0.01 80.240.030.080.0250.1 1 滴 0.01 90.260.030.080.0250.1 1 滴 0.01 不同条件下培养大约 3 周，得到大量微藻以进行后续测量实验。 1、7、8、9 组的生长情况不好，在第一周的时间内，发生大量死亡现象，瓶中呈 现白灰色。 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 20 - 3.2 苏丹黑 b 染色测微藻油脂 实验材料：锥形瓶（250ml） 、小试管8、移液枪、.水浴锅、量筒（500ml） 、 分析天平、离心机、分光光度计、滤纸、漏斗等。 实验方法：取 0.18g/lnh4no3培养基为样藻，利用漏斗、离心机将锥形瓶中 的微藻浓缩，稀释为五种浓度 1x、2x、3x、4x、5x，加入浓盐酸及苏丹黑 b 染液 混匀，沸水浴 10min，冷却静置后 10000r/min 下离心 10min。再用 50%乙醇洗涤三 次，加入 70%乙醇混匀微藻细胞在 645nm 波长下测定吸光值。 浓度单位为 mg/g，实验数据如表 3-2： 表 3-2 645nm 光波下的吸光度 序号 123456 设定浓 度 1x2x3x4x5x 实际浓 度 369121536.39 a6450.0760.1470.1980.2980.3430.572 截距 -0.19428 斜率 63.62229 相关性 0.994183 根据所测吸光度制作散点图，如图 3-1： 苏丹黑 b 染色实验散点图 0 10 20 30 40 00.20.40.60.8 a645 吸光度 油脂含量 mg/g 图 3-1 苏丹黑 b 染色散点图 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 21 - 经 excel 计算后得油脂含量与苏丹黑染色后微藻 a645 吸光度关系为 油脂含量=63.62a6450.1943 3.3 不同碳氮比条件下微藻吸光度数据 实验材料：分光光度计、移液枪、漏斗、离心机、分析天平等。 实验方法：将锥形瓶中的微藻微藻浓缩离心数次，达到除盐的状态。然后称 取一定质量经脱盐、洗涤、离心处理的微藻细胞(湿重)，按 1g 微藻细胞加入 100ml 蒸馏水的比例加入蒸馏水，充分混合均匀，取一只试管，加入 5ml 藻液和 5ml 的 hcl 溶液(1mol/l )，充分混合后，加入 0. 4ml 的苏丹黑 b 染色液，充分混 匀，沸水浴中加热 10min(不时摇动，使加热均匀)，冷却后于 10000r/min 下离心 10min。 取出微藻细胞沉淀物，用 50%乙醇洗涤 3 次后，加入 70%乙醇混匀微藻细胞， 在 645nm 波长光下测定其吸光值，比色皿光程为 1cm。吸光值 a645 代入相应的 回归方程计算，求得微藻细胞油脂含量值。 根据吸光度的不同，对比得出在氮源浓度 0.12g/l 的代谢环境下，所得含油量最高， 相关数据如表 3-3： 表 3-3 不同代谢环境、对应条件下藻的吸光值及其含油量的关系 序号123456789 氮源浓度 g/l0.10.120.140.160.180.20.220.240.26 湿藻质量/g0.5450.6120.6410.7980.8330.8270.8890.9100.965 a6450.5970.6030.5950.5780.5720.5660.5330.4980.493 油脂含量37.7838.1637.6636.7736.3936.0133.9131.6831.36 根据数据制作得出在不同氮源下微藻油脂含量高低的分布，如图 3-2： 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 22 - 0 10 20 30 40 50 123456789 氮源浓度 油脂含量 油脂含量 a645 湿藻质量 图 3-2 不同氮源下微藻油脂含量折线图 实验所得微藻细胞油脂含量和氮源的关系与文献中富油微藻的培养理论相吻 合，证明实验数据比较正确。 3.4 实验数据分析 采用苏丹黑 b 染色法测吸光度测定微藻油脂含量，相较传统酸热法测定油脂 含量更加方便快捷。经苏丹黑 b 染色处理的微藻细胞对 645nm 波长光具有最大吸 收峰值，微藻油脂含量与经苏丹黑 b 染色处理后微藻细胞的吸光值 a645 呈显著的 线性相关性，通过建立两者的线性回归方程，对于任一待检微藻样品，只要测定 其经苏丹黑 b 染色后的吸光值 a645，代入线性回归方程式，就可方便获知微藻样 品的油脂含量。 根据不同碳氮比培养基下微藻含油的测定，得到数据显示碳源一定时，氮源 在 0.12g/l nh4no3时有最高油脂含量，在 0.26g/l 时有最高产量 结果表明： (1)苏丹黑 b 法测定微藻含油量较传统方法更加简便易行，但缺点在于准确度 不如传统酸热法。 (2)微藻在培养过程中，虽然处于“饥饿”状态微藻积累油脂，但此时藻体生 长缓慢，导致产油率下降，实际生产中要使产油率最高，必须在微藻总生物量和 细胞油脂含量间寻求平衡。 (3)实验结论与文献中氮元素含量越低产油量越高相同，证明实验可行。 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 23 - 第 4 章 微藻富油脂化培养的初步探讨 氮源对微藻的生长、发育、繁殖及油脂的积累等生理活动都有重要的影响。 通常可以被微藻利用的氮源有铵盐、硝酸盐及尿素等，但在吸收速度与利用程度 上有所差别。根据文献中的描述，本实验决定采用含氮最高的硝酸铵作为氮源进 行微藻培养。 随着氮元素浓度的升高，微藻的比生长速率先增大后减小，说明高浓度氮元 素对其生长有一定抑制作用。这与尹翠玲等27的报道相一致，原因可能是由于生 长后期，磷源被耗尽，氮/磷比例失调，而藻细胞对氮源的过量吸收，不利于细胞 的分裂28。小球藻的油脂含量一般为 8%27%29，本研究中出现较高油脂含量可 能是由于当氮含量较低时，产油微生物的腺苷一磷酸(amp)脱氨酶的酶量增加， amp 脱氨酶将 amp 大量转化为肌苷一磷酸 (imp)和氨，相当于微生物对缺氮的 一种应激反应 30，而线粒体中异柠檬酸脱氢酶 (icdh)多为 amp 依赖性脱氢酶， 细胞内 amp 浓度的降低将减弱甚至完全停止该酶的活性31。柠檬酸更多被柠檬酸 裂解酶催化生成合成脂肪酸的原料乙酰辅酶 a，从而使细胞内脂肪的积累量增加。 鉴于氮元素浓度对细胞生长和油脂含量的积累具有相反的作用，综合考虑生 物量产率和油脂含量，确定优化氮源浓度为 0.12g/l，此时的油脂含量最高为 38.16 mg/g。 东北电力大学本科毕业设计说明书（论文） - 24 - 结结 论论 实验中利用了苏丹黑染色法将藻细胞染色，在645nm波长光下测量吸收峰并进 行比对，最高的吸收峰值即可得出藻种富油最佳的培养基，即富油微藻的最优代 谢生长环境条件。 本实验结果表明：培养前期宜采用完全培养使细胞快速生长获取大量藻体， 光照强度为3 5007 000lx；温度为 2527；ph = 7. 68. 2环境下，产油阶段 宜采用营养盐限（0.12g/lnh4no3）以积累更多脂肪；同时利用酸热萃取法提取测 量该最优富油环境下藻细胞中含油量为38.16mg/g。 参考文献 - 25 - 参考文献 1殷大聪(yin d c), 耿亚红(geng y h), 梅洪(mei h)等. 微藻的高油脂化技术 研究进展j. 武汉植物学研究(journal of wuhan botanical research), 2008, 26(1):6469 2孙俊楠(sun j n), 张建安(zhang j a), 杨明德(yang m d)等. 利用微藻热解生 产生物燃料的研究进展j. 科技导报(sciencetechnology review), 2006, 24(6):2627 3梅洪(mei h), 张成武(zhang c w), 殷大聪(yin d c)等. 利用微藻生产可再生 能源研究概况j.武汉植物学研究(journal of wuhan botanical research), 2008, 26(6):650660 4demirbas a. algae as a new source of biodieselj. energy convers.manage., 2009, 50:1434 5程丽华(cheng l h), 张林(zhang l), 陈欢林(chen h l)等. 微藻的高油脂化技 术研究进展j. 生物工程学报(chinese journal of biotechnology), 2005, 21(2): 177181 6郑洪立(zheng h l), 张齐(zhang q), 马小琛(ma x c)等. 基于模糊综合评价 的产生物柴油微藻藻种筛选j. 中国生物工程杂志(china biotechnology), 2009, 29(3):110116 7王镜岩(wang j y), 朱圣庚(zhu s g), 徐长法(xu c f). 生物化学(biochemistry). 第 3 版(3rd ed).北京:高等教育出版社(beijing:higher education press)，2002 8马艳玲(ma y l). 微生物油脂及其生产工艺的研究进展j. 生物加工过程 (chinese journal of bioprocess engineering), 2006, 4(4):711 9courchesne n m d, parisien a, wang b, et al. lipid biosynthesis and metabolic regulation in microalgaej. j.biotechnol, 2009 10xiong w, li x f, xiang j y, et al. high-density fermentation of microalga chlorella protothecoides in