DNA的粗提取与鉴定修改.ppt

5.1 DNA5.1 DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 一、基础知识一、基础知识 （一）提取（一）提取DNADNA的的方法方法 1.1.提取生物大分子的基本思路提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同 物理或化学性质的生物大分子。 2.2.提取提取DNADNA的基本思路的基本思路 提取提取DNADNA，去除其他成分，去除其他成分 利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质蛋白质和和脂质脂质等等在物理和 化学性质方面的差异 DNADNA的溶解性的溶解性 DNADNA和和蛋白质等成分在不同浓蛋白质等成分在不同浓 度的度的NaClNaCl溶液中溶解度不同溶液中溶解度不同, , 利用这一特点，选择适当的利用这一特点，选择适当的 盐浓度就能使盐浓度就能使DNADNA充分溶解，充分溶解， 而使杂质沉淀；或者让其他而使杂质沉淀；或者让其他 成分溶解，成分溶解，DNADNA析出。析出。 3.DNA3.DNA等大分子的理化性质等大分子的理化性质 DNADNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液 DNADNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶 于酒精。将于酒精。将DNADNA与蛋白质进一步分离。与蛋白质进一步分离。 DNADNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶蛋白酶水解蛋白质，水解蛋白质，对对DNADNA没有影响没有影响 高高 温温大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60608080 而而DNADNA在在8080以上才会变性以上才会变性 洗涤剂洗涤剂溶解细胞膜溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质去除脂质和蛋白质 但对但对DNADNA没有影响没有影响 （二）（二）DNADNA的鉴定的鉴定 沸水浴条件下，沸水浴条件下，DNADNA遇遇二苯胺被染成二苯胺被染成蓝色。蓝色。 二、实验设计二、实验设计 （一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 从下列材料中选取23种 原则原则 ： 菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜； 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞； 在液体培养基中培养的大肠杆菌 凡是含有凡是含有DNADNA的生物材料都可以考虑的生物材料都可以考虑 选用选用DNADNA含量相对较高的组织含量相对较高的组织 要容易取得、细胞分散或容易分散、细胞容易破碎或要容易取得、细胞分散或容易分散、细胞容易破碎或 容易研碎、细胞核中的容易研碎、细胞核中的DNADNA容易释放。容易释放。 （二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液 1 1、动物细胞、动物细胞 容易破碎容易破碎 鸡血细胞溶液：鸡血细胞溶液： 加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后 收集滤液。收集滤液。 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量 进入血细胞，使血细胞胀裂； 加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从 而释放出DNA。 2 2、植物细胞、植物细胞 需要溶解细胞膜需要溶解细胞膜 加入一定的洗涤剂和食盐加入一定的洗涤剂和食盐 充分的充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 洗涤剂洗涤剂离子去污剂，能溶解细胞膜，利于离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNADNA释放释放 食食 盐盐NaClNaCl，利于，利于DNADNA的溶解于研磨液中。的溶解于研磨液中。 研磨不充分，研磨不充分，核内的核内的DNADNA释放不完全，提取的释放不完全，提取的DNADNA量少，量少， 导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理。 讨论：滤液讨论：滤液/ /研磨液中可能含有哪些成分？研磨液中可能含有哪些成分？ 可能含有核蛋白、多糖和可能含有核蛋白、多糖和RNARNA等杂质等杂质 1. DNA1. DNA的溶解性的溶解性 2. DNA2. DNA对对酶酶、高温高温和和洗涤剂洗涤剂的耐受性的耐受性 （三）除去滤液中的杂质（三）除去滤液中的杂质 利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开； 利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性与DNA分离 。 为什么反复地溶解与析出 DNA，能够去除杂质？ （四）（四） DNADNA的的析出与鉴定析出与鉴定 与滤液与滤液体积相等体积相等的的冷却冷却的的酒精溶液酒精溶液( (体积分数体积分数9595) )， 静置静置2 23min3min，溶液中会出现白色丝状物。，溶液中会出现白色丝状物。 粗提取粗提取DNADNA 1 1、DNADNA的析出的析出 用玻璃棒沿一个方向搅 拌，（以利于DNA分子 的附着和缠绕）卷起丝 状物，并用滤纸吸取上 面的水。 2. DNA2. DNA的鉴定的鉴定 向两支试管中分别加入向两支试管中分别加入 2mol/L 2mol/L NaClNaCl 溶液溶液5ml5ml 其中一支试管中加入其中一支试管中加入DNADNA丝状物丝状物 各加入各加入二苯胺二苯胺试剂试剂4ml4ml 混匀后，置于沸水浴中加热混匀后，置于沸水浴中加热5min5min 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色 观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物， 说明DNA中的杂质较多； 二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功， 如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或 是实验操作中出现错误，需要重新制备 1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的 。 （1）材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的 生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造 成检测的困难； （2）DNA的释放和溶解，是实验成功与否的关键，要尽 可能使细胞内的DNA全部溶解； （3）DNA的纯化，根据DNA的溶解特性、对酶及高温的 耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开； （4）对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。 共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌” 加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精 ” 方法步骤骤加入物质质实验实验 原理及现现象 1.制备鸡备鸡 血细细胞液柠柠檬酸钠钠溶液防止血液凝固 2.提取鸡鸡血细细胞细细胞核物质质蒸馏馏水使血细细胞过过度吸水而破裂 3.溶解细细胞核内的DNA2 m1L的NaCI溶液 DNA在高浓浓度NaCI溶液 中溶解度大 4.析出含DNA的黏稠物蒸馏馏水 将NaCl溶液稀释释至0.14mol/L ，使得DNA最大限度地释释出 5.滤滤取含DNA的黏稠物使含DNA的黏稠物留在纱纱布上 6.将DNA的黏稠物再溶解2 molL的NaCl溶液同3 7.过滤过滤 含DNA的NaCl溶液除去含DNA的滤滤液中的杂质杂质 8.提取含有杂质较杂质较 少的 DNA 冷却的95的酒精50 mLDNA不溶于酒精，出现现沉淀 9.DNA的鉴鉴定 (1)向两支试试管中各加入2 molL的NaCl溶液 5mL (2)将丝丝状物放入A试试管 中，搅搅拌使其溶解 (3) 向两支试试管中各加入 4 mL二苯胺试剂试剂 。 混合均匀后沸水浴5min A出现蓝现蓝 色，B无变变化 2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取 DNA一样容易吗？ 提取蛋白质比提取DNA的难度大。 （1）与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH 等条件要敏感得多，很容易失活； （2）并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质 各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方 法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件 ，设计特定的方法。 一、基础知识一、基础知识 （一）（一）DNADNA分子的结构分子的结构 C C、HH、OO、N N、P P 1 1、组成元素、组成元素 脱氧核苷酸脱氧核苷酸2 2、基本单位、基本单位 3 3、脱氧核苷酸结构、脱氧核苷酸结构 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5 3 3 5碱基 碱基 脱氧核糖脱氧核糖 磷酸基团磷酸基团 碱基碱基 脱氧核糖脱氧核糖 碱基碱基 脱氧核糖脱氧核糖 5 3 多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图 （二）（二）DNADNA的复制的复制 2 2、时期、时期 有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期 3 3、场所、场所细胞核（主）、线粒体、叶绿体细胞核（主）、线粒体、叶绿体 4 4、模板、模板 DNADNA母链母链 1 1、概念、概念 由一个 由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNA DNA的过程的过程 5 5、原材料、原材料脱氧核苷酸脱氧核苷酸 6 6、基本条件、基本条件 酶、 酶、ATPATP、原料、模板原料、模板 7 7、复制过程、复制过程（半保留复制）（半保留复制）边解旋边复制边解旋边复制 8 8、遵循原则、遵循原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则 9 9、复制的意义、复制的意义使遗传信息从亲代传给了后代，使遗传信息从亲代传给了后代， 从而保持了遗传信息的连续性。从而保持了遗传信息的连续性。 （三）（三） PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应） 1 1、 DNADNA聚合酶聚合酶特性特性 不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从只能从DNADNA的的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链， 因此，因此， DNADNA复制需要引物复制需要引物 2 2、 DNADNA聚合酶聚合酶作用过程作用过程 当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后， DNADNA聚合酶聚合酶 就能从引物的就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链， DNADNA的的合成方向总是合成方向总是 从子链的从子链的55端向端向33端延伸端延伸 3 3、 PCRPCR原理原理 在在8080100C100C的温度范围内，的温度范围内， DNADNA的的双螺旋结构将解体双螺旋结构将解体 ，双链分开。，双链分开。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链链 又会重新结合成双链。又会重新结合成双链。 PCRPCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通的热变性原理，通 过控制温度来控制双链的解聚与结合。过控制温度来控制双链的解聚与结合。 靶序列靶序列 靶序列靶序列 PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性 靶序列靶序列 靶序列靶序列 引物引物 引物引物 55 33 55 55 33 55 33 33 PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火 靶序列靶序列 靶序列靶序列 引物引物 引物引物 55 3 3 55 55 33 55 33 33 TaqTaq DNA DNA 聚合酶聚合酶 PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸 靶序列靶序列 靶序列靶序列 第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的：得到两个拷贝的 靶序列靶序列 利用PCR技术扩增目的基因 二、二、 PCR PCR 的的实验操作实验操作 1 1、PCRPCR仪仪 （一）设备及用具（一）设备及用具 实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器 2 2、微量离心管、微量离心管 一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml 3 3、微量移液器、微量移液器 用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其上的一次其上的一次 性吸液枪头用一次更换一次性吸液枪头用一次更换一次 一、基础知识 蛋白质提取与分离的依据:(蛋白质的物化理性质) 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。 提取 分离 方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 1.凝胶色谱法 （1）原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流 动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 （2）材料:多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等 （4）缓冲溶液洗脱剂 组成： 配制： 作用： 调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 2凝胶电泳法： 1）原理： 不同蛋白质微粒带电性质（正电荷或负电荷）、 电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小 、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场（或介质 ）中的运动方向和运动速度不同。 思考：蛋白质为什么带有电荷？ 在一定的PH下，蛋白质可电离的基团会带上电荷 决定 运动方向 电场 作用力 介质中形 成阻力 决定 运动速率 电电荷性 质质 电电荷量 分子形状 分子大小 2）蛋白质分子在电场作用下运动的影响因素 3）方法:a.琼脂糖凝胶电泳（如PCR产物的检测） b.聚丙酰胺凝胶电泳（测蛋白质分子量的方法 ） c.聚苯乙烯凝胶电泳 如：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 “蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取 决于分子大小。 二、实验操作 样品处理 和粗分离 纯 化 纯度鉴定 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.