高产纤维素酶菌种的筛选鉴定与发酵产酶优化.docx

硕 士 学 位 论 文高产纤维素酶菌种的筛选鉴定与发酵产酶优化Screening, characterization of efficient cellulase producer and optimization of cellulase production作 者 姓 名： 孙 鸿 金 学科、 专业： 生物工程 学 号： 30918022 指 导 教 师： 赵心清 副教授 完 成 日 期： 2011年11月 大连理工大学大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目： 作 者 签 名 ： 日期： 年 大连理工大学硕士学位论文摘 要纤维素酶在食品、饲料及生物能源生产等多个领域都有重要应用，因此其生产菌的开发和发酵生产受到各国学者的重视。本论文从山西玉米秸秆堆积处土壤和大连海泥样品中分离得到10株具有纤维素水解活性的丝状真菌和放线菌，其中一株木霉菌M20活性最好，ITS序列分析结果表明，该菌种与绿色木霉（Trichoderma viride）很相近，ITS序列最大相似度为97%。M20的产酶培养基发酵液具有降解纤维素的能力，对滤纸、羧甲基纤维素钠等纤维素的水解能力较强，也可以降解玉米秸秆、草坪草、落叶、菊芋秸秆等木质纤维素原料。进一步研究了所产纤维素酶的酶学性质，并优化了M20的产纤维素酶条件，主要实验结果如下：M20摇瓶发酵产纤维素酶的最佳诱导物为微晶纤维素，最佳添加量为0.5%。替代氨基酸的最佳氮源为蛋白胨，当初始pH为6，培养温度为28，发酵培养第7天时，滤纸酶活力（FPA）可以达到9.2 IU/ml。通过正交设计软件设计培养基组分添加量方案，滤纸酶活力（FPA）最优结果可以达到9.89 IU/ml，比对照提高了12%。M20所产纤维素酶在低温条件下保存2周酶活性变化不明显，但对60以上的高温较为敏感，其最佳酶反应条件是：温度50，pH为4.8。利用5L发酵罐培养M20进行发酵产酶实验，结果表明，产纤维素酶的酶活在第6天达到最高值，FPA可以达到8 IU/ml左右。调控pH先为4.8，生长2.5天以后，调控pH为6，并且在第三天一次性加入终浓度为5g/L的微晶纤维素，在发酵第5天FPA可以达到8 IU/ml，达到最高酶活时间提前了一天。用M20的发酵液可以水解不同的木质纤维素原料，利用HPLC测定还原糖其释放含量，结果表明，玉米秸秆释放的葡萄糖与木糖含量最多，草坪草释放的葡萄糖含量比菊芋秸秆多，而落叶最少，从水解释放的木糖含量来看，菊芋秸秆要多于落叶，而草坪草最少。这些结果表明，M20的发酵液可以水解不同来源的木质纤维素原料。关键词：绿色木霉菌；纤维素酶；滤纸酶活力；发酵优化；木质纤维素；还原糖Screening, characterization of efficient cellulase producer and optimization of cellulase productionAbstractCellulosic enzymes have important applications in various fields including food processing; feed industry and biofuel production, therefore, development of efficient producer strains and cellulase production have attracted the attention of researchers worldwide. In this study, filamentous fungi and strepotmycete strains were isolated from corn stover compost in Shanxi and marine sediment samples in Dalian, one of which showed superior cellulosic enzyme activity and was named M20. ITS sequence analysis showed that M20 showed the highest identity to that of Trichoderma viride. Fermentation broth of M20 exhibited good hydrolytic activities against not only filter paper, sodium carboxyl methyl cellulose, and cotton fiber, but also corn stover, lawn grass, fallen leaves, and Jerusalem artichoke stalk. The properties of the cellulosic enzymes were studied, and the cellulase production conditions were further optimized, the main results were listed below:The best elicitor of cellulase in M20 is microcrystalline cellulose, and the optimum final concentration is 0.5%. The best nitrogen source in replace of amino acid is peptone. At 28 and when the initial pH value was 6, Filter Paper Activity (FPA) reached 9.2 IU/ml within 7 days. The optimum media composition was obtained by orthogonal design, and the highest FPA attained 9.89 IU / ml, with 12% increase comparing with the control. The optimum pH for enzyme reaction was 4.8 and the optimum temperature 50. The activity of the cellulase did not change significantly at 50 within 2 weeks, while the enzyme activity was lowered significantly under the temperatures higher than 60. Next, celluase production was tested in a 5L fermentor. The results showed that FPA reached the highest value of 8 IU / ml within 6 days. Optimum operation condition was proved to be first cultivating at pH 4.8, after 2.5 days, changing the pH value to 6, and adding 5 g/L (final concentration) of microcrystalline cellulose on the 3rd day. Under this condition, the FPA reached the highest activity of 8 IU/ml in the 5th day. Hydrolysis of different lignocellulosic materials was carried out using the broth of M20, and the sugar release was investigated by HPLC. The results showed that corn stover contains highest amount of glucose and xylose, lawn grass released more glucose than Jerusalem artichoke stalks and fallen leaves. On the other hand, Jerusalem artichoke stalks released more xylose than fallen leaves and lawn grass.Key Words: Trichoderma viride; cellulase; filter paper activity; Optimization of fermentation conditions; lignocelluloses; reducing sugar目 录摘 要IAbstractII引 言11 文献综述21.1 纤维素酶研究意义21.2 纤维素酶简介31.3 纤维素酶作用机理41.4 纤维素酶的影响因素51.5 生产纤维素酶的生物61.6 生产纤维素酶菌种的研究现状81.7 纤维素酶的合成机理91.8 纤维素酶的生产及分离纯化101.8.1 固体发酵产纤维素酶101.8.2 液体深层发酵101.8.3 纤维素酶的分离纯化111.9 纤维素酶的应用121.9.1 在发酵工业上的应用121.9.2 在饲料工业中的应用121.9.3 在纺织工业的应用131.9.4 在造纸工业的应用131.9.5 在纤维素乙醇开发利用方面应用131.9.6 在其他方面的应用141.10 木质纤维素141.10.1 木质纤维素的组成141.10.2木质纤维素的预处理151.11利用基因工程途径构建高产纤维素酶的工程菌181.11.1纤维素酶基因的克隆表达181.11.2 纤维素酶分子改造191.12 本课题的研究内容及意义222 产纤维素酶的微生物筛选与鉴定242.1 引言242.2 实验材料与设备242.2.1实验菌种及培养基24-2.2.2 主要化学试剂252.2.3 主要实验仪器262.3 实验方法262.3.1 山西土壤样品与大连小平岛海泥样品的预处理262.3.2 分散与差速离心法（DDC）262.3.3筛选样品中产纤维素酶微生物的技术路线272.3.4 山西土壤样品与大连小平岛海泥样品中的微生物的分离培养272.3.5 霉菌M20的DNA提取292.3.6 霉菌M20 rDNAITS 区PCR的引物扩增302.4 实验结果与讨论312.4.1 降解纤维素菌种纤维素酶活力定性比较结果312.4.2 产纤维素酶菌种的鉴定结果312.5 本章小结323 纤维素酶活测定与产酶条件优化343.1 引言343.2实验材料与设备343.2.1实验培养基343.2.2 主要化学试剂353.2.3 主要实验仪器363.3 实验方法373.3.1 DNS试剂的配制373.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制373.3.3 DNS法测定纤维素酶活力373.3.4 M20摇瓶培养与发酵条件383.3.5 M20发酵产纤维素酶流程383.3.6 M8的摇瓶培养与发酵条件及产酶流程393.3.7 多因素对微生物摇瓶发酵产纤维素酶活性的影响393.3.8 发酵罐实验条件403.3.9多因素对微生物上罐发酵产纤维素酶活性的影响403.3.10 纤维素酶水解反应过程中温度对酶活力影响413.3.11 纤维素酶水解反应过程中pH值对酶活力的影响413.3.12 纤维素酶的稳定性实验413.4 实验结果与讨论413.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制结果413.4.2 发酵时间对纤维素酶活力的影响结果423.4.3不同诱导物对微生物发酵产纤维素活力酶的影响结果453.4.4 发酵培养基初始pH值对M20产纤维素酶影响结果463.4.5 发酵温度对M20产纤维素酶影响结果473.4.6 不同的氮源对M20产酶活力大小的影响结果483.4.7微晶纤维素的添加量对M20产纤维素酶活力影响结果493.4.8发酵培养基成分的正交实验结果503.4.9 发酵时间对发酵罐实验pH值与FPA影响533.4.10 调控发酵罐pH实验结果543.4.11发酵过程中的补料实验结果553.4.12纤维素酶水解反应过程中温度对酶活力影响结果563.4.13纤维素酶水解反应过程中pH值对酶活力的影响573.4.14纤维素酶的稳定性实验结果583.5 本章小结594 木质纤维素原料的水解614.1 引言614.2实验材料与设备614.2.1 实验培养基614.2.2 主要化学试剂614.2.3 主要实验仪器624.3 实验方法624.3.1木质纤维素原料的预处理624.3.2 M20发酵产纤维素酶62-4.3.3 DNS法分析M20纤维素酶水解落叶与草坪草生成还原糖含量634.3.4 还原糖标准曲线的绘制634.3.5 HPLC法分析M20纤维素酶水解木质纤维素原料生成的还原糖634.4 实验结果与讨论634.4.1 木质纤维素原料预处理结果634.4.2 M20发酵产纤维素酶的结果634.4.3 DNS法分析M20纤维素酶水解落叶与草坪草生成还原糖含量结果634.4.4 还原糖标准曲线的绘制结果654.4.5 HPLC法分析M20纤维素酶水解木质纤维素原料生成的还原糖结果674.5 本章小结72结 论73展 望74参 考 文 献75攻读硕士学位期间发表学术论文情况80致 谢81大连理工大学学位论文版权使用授权书82VII- -引 言随着世界石油储备量的逐年减少，国际石油价格的不断攀升，石油对我国能源安全与经济的可持续发展产生了巨大的影响，因为我国石油每年的进口量超过了2.39亿吨，已经超过了石油总加工量的一半。石油燃烧所产生环境问题也变得日益严重，汽车在使用汽油或柴油作为动力的过程中，产生了大量的碳氧化物与氮氧化物，并且铅等重金属也以气体的形态散逸到空气中，这对环境与人类的健康产生了巨大威胁，汽车的生产与使用量正逐年增加，其所带来的后果必将是更加严重的环境污染。为了解决化石燃料的使用而带来的环境问题，纤维素乙醇的生产代替化石燃料是一个不错的选择。所谓纤维素乙醇的生产，是以木质纤维素为原料通过预处理、纤维素酶水解、酵母发酵产生乙醇等的一系列生化反应过程。木质纤维素原料的含量在自然界中相当广泛，包括玉米秸秆、菊芋秸秆、稻草等，甚至城市中的落叶与绿化的草坪草残留都可以作为木质纤维素原料的来源。如果这些木质纤维素原料可以被合理利用而不是当作垃圾处理，那么其产生的经济效益将是十分可观的，甚至可以改变当今世界的能源结构。但目前的问题是生产纤维素酶的成本较高，并且酶活力偏低。因此，找到一株能够高产纤维素酶的菌种并且研究其产酶优化条件是十分重要的。本实验以大连小平岛的海泥样品、山西秸秆堆积处土壤样品、拉萨高山日照强烈的土壤样品为实验对象，从中筛选出约10株能够产纤维素酶的菌种，经过定性与定量测定其纤维素酶活力，选择其最优的纤维素酶生产菌株。最后分离筛选得到一株高产纤维素酶的菌株M20，经过鉴定为绿色木霉菌（Trichoderma viride）。经过优化培养后的M20发酵粗酶液，对木质纤维素原料如玉米秸秆、草坪草、落叶与菊芋秸秆等具有一定的水解能力。本课题将高产纤维素酶的菌种M20优化培养，其产生的纤维素酶用于木质纤维素原料水解，得到了还原糖。可以用于酵母发酵产乙醇，为纤维素乙醇的产业化生产与开发打下了坚实的基础。1 文献综述1.1 纤维素酶研究意义能源与环境问题将是人类在21世纪首要面临的严峻问题，自英国经历了工业革命至今，人类社会迅猛发展，但是环境污染与能源短缺的问题也随之而来了。众所周知，当今社会的绝大部分能源来自于化石燃料，它们都是有限并且不可再生的，如石油，天然气和煤炭等。根据已探明的储量和现在的开采开发速度预计，全球化石燃料仅够维持大约40年700年的开采量，全球能源安全正面临着巨大的威胁，有限的资源迫使人类社会寻找可再生的能源，比如生物质能源1。同时，因为大量使用化石燃料，环境污染问题日益严重，全球气候也受到严重影响。在使用化石燃料的过程中，生成了大量的CO，CO2 等气体。机动车在运行时，排出的尾气中含有大量的重金属铅。这些气体都被排入了大气中，但使用生物质能源可以有效减少这些气体的排放2。为了减少环境污染，缓解能源短缺，可再生能源的研究发展显得尤为重要，世界各个国家都在积极努力寻找能够有效替代化石燃料的可再生资源，其中纤维素乙醇的研究开发已经成为全世界的热点3。地球上每年由光合作用而生成的产物高达1.5101121011吨，是人类社会赖以生存的基本物质资源来源，而纤维素又是自然界中存储量最大的可再生资源（占光合作用产物90%以上）4。农作物秸秆的主要成分为纤维素，我国作为一个农业生产大国，每年产秸秆约7亿吨，约占全世界秸秆总量的30%左右5。然而纤维素的如何降解利用问题却亟待解决。因为纤维素是一种结构致密的化合物，存在很多高能的氢键，因此很难被水解利用。纤维素自1838年被发现以来其研究和应用就引起了国内外学者的广泛关注和极大兴趣6。纤维素的化学结构在1930年已经被研究清楚，它是由它是由D-吡喃式葡萄糖基通过-1,4-糖苷键连接而成链状高分子线性不分枝同聚多糖7。纤维素分子本身化学结构并不复杂，由碳、氢、氧三种元素构成，分子式见于图1.1。纤维素化学性质很稳定，常温下比较不易溶于水、稀酸稀碱，聚合度变化很大，一般由800012000个葡萄糖残基组成。天然纤维素材料都具有复杂的超分子结构，由于次级键的作用，许多纤维素分子链交联而结合成为结构严密的原纤维，其内部可分为结晶区和无定型区。结晶区内分子排列有规则而其整齐，因此密度较大，为1.588g/cm3 ,无定形区分子排列相对松散，密度较低，为1.5g/cm3。不同植物细胞壁的结构和组分差异很大，但纤维素在其干重中的含量一般为3550%8。在植物细胞壁中，存在大量的木质素，半纤维素，果胶，单宁，这些物质共同组成了天然纤维和其它细胞壁结构。半纤维素与纤维素形成连接，与微纤丝一起构成网状结构9。这些复杂的超分子结构增加了产纤维素酶的微生物分解纤维素的难度。天然纤维物质的复杂结构使得单一种纤维素酶高效降解它变得十分困难，因此能够高效水解天然纤维素类物质的纤维素酶绝大多数都是多酶体系，它是由具有独立结构、功能、折叠的单元构成，这些不连续的单元被称为纤维素分子结构域10，因此，研究与应用纤维素酶是十分有意义的。纤维素酶作为水解纤维素的一组酶，将结晶区的纤维素分子变成非结晶的，松散的纤维素分子，然后水解为较小的葡聚糖，纤维二糖，最后水解为葡萄糖用于酵母发酵而生产乙醇。30年前主要以粮食作物如谷物、甘蔗等作为原料直接发酵生产生物燃料，比如美国、巴西等。这些生物燃料混合汽油供汽车使用，被称为第一代生物燃料11，20世纪80年代以后生物燃料的原料研究应经从粮食作物转变为木质纤维素，这时的生物燃料被称为第二代生物燃料即纤维素乙醇12。在当今能源与资源日趋短缺的社会，合理有效利用纤维素酶降解天然纤维物质而生产纤维素乙醇变得十分迫切和有意义，世界各个国家正努力研究纤维素酶的生产与开发利用。图 1.1 纤维素的分子结构Fig. 1.1 The molecular structure of cellulose1.2 纤维素酶简介1906年Seilliere 首次在蜗牛消化液中发现纤维素酶，纤维素酶的发现引起了当时学者的广泛关注13。纤维素酶是能将纤维素水解成为葡萄糖的一组多酶体系，其相对分子量是4500075000，是由三种相互起协同作用的酶组合而成14。三种酶分别为：（1）内切葡聚糖酶（endo-1,4-D-glucanase，EC.3.2.1.4，简称 EG），这类酶作用在纤维素分子内部非结晶区，随机水解 -1,4-糖苷键，将长链的纤维分子截断，产生了大量有着非还原性末端的小分子纤维素。（2）外切葡聚糖酶（exo-1,4-D-glucanase，EC.3.2.1.91简称CBH），这类酶能作用在纤维素分子的非还原性末端，依次水解 -1,4-糖苷键，每次水解生成一个纤维二糖分子。（3）-葡萄糖苷酶（-glucosidase，EC.3.2.1.21，简称 BG），这类酶水解纤维二糖与短链的纤维寡聚糖作用而生成葡萄糖。对纤维二糖与纤维三糖的水解速率很高，随着葡萄糖聚合度的升高反而水解速率缓慢下降15。1.3 纤维素酶作用机理纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖的详细过程至今仍然不是十分清楚。但是有三种理论被普遍接受，包括协同理论，原初反应假说，碎片理论。其中协同理论最为广泛接受16。该理论认为在纤维素水解过程中，首先由内切葡聚糖酶（EG）进攻纤维素的无定形区，生成较小的葡聚糖单位并且形成外切葡聚糖酶（CBH）需要的新的游离末端，然后再由外切葡聚糖酶（CBH）从葡聚糖链游离末端水解生成纤维二糖；最后-葡萄糖苷酶（BG）会将纤维二糖水解为葡萄糖。纤维素酶作用过程如图1.2所示17。纤维二糖会结合外切葡聚糖苷酶（CBH）活性部位附近的色氨酸残基，阻止纤维素分子进入酶的活性中心，从而对纤维素酶的催化作用造成强烈的抑制18，因此降低纤维二糖的积累效果，解除其抑制作用是提高纤维素酶水解效率的重要条件。在纤维素酶解过程中添加一定量的-葡聚糖苷酶可以加快纤维二糖的降解来消除其对外切葡聚糖苷酶（CBH）的抑制，增加纤维素酶水解速率。葡萄糖的积累也会对纤维素酶的水解作用产生反馈抑制作用19。纤维素酶的重要特征之一就是协同作用，协同作用与底物的结晶度成线性关系，大部分协同作用发生在结晶区。这种协同作用比较复杂，一切的外切酶之间有协同作用，不同的外切酶与内切酶之间有着协同作用，不同酶系组分之间也存在着协同作用。其中以内切外切酶之间的协同作用为纤维素酶之间的主要协同作用方式20。图1.2 纤维素酶水解纤维素过程图Fig. 1.2 The process of cellulose hydrolyzed by cellulase1.4 纤维素酶的影响因素通过研究发现，底物浓度与酶解速率的关系符合米氏酶促动力学方程。当底物浓度很低时，表现为一级反应，纤维素酶的水解速率与底物浓度成正比例关系，当升高到一定水平时，表现为零级反应，会对纤维素酶的水解作用造成强烈的抑制21。纤维素的结晶度，木质素的含量以及预处理的方式都会对纤维素酶的水解速率造成影响。由于木质素的存在，阻遏了纤维素酶与纤维素的结合造成纤维素酶的无效吸附22，这在很大程度上降低了纤维素酶的水解速率。因此如何有效的出去纤维类物质中的木质素，对于提高纤维素酶的水解效果有着重要意义。在纤维素酶水解过程中，pH值, 温度，表面活性剂，金属离子等会对酶的水解作用造成很大影响。一般的纤维素酶的最适作用温度为4565，最适pH值一般为4.05.523，极端的温度和pH值会使纤维素酶失活，造成不可逆的影响，从而极大降低了酶的水解效果。表面活性剂可以增加细胞膜的通透性，使纤维素酶能够较快的释放到细胞膜外部。一定浓度的表面活性剂如吐温80能够提高发酵液中的纤维素酶含量。对于金属离子来说，K+，Ca2+等对酶的催化具有一定抑制作用，而Zn2+，Cu2+等对酶的催化具有一定的促进作用24。一般来说，较低的金属离子浓度对纤维素酶的活性具有促进作用，较高的金属离子浓度则具有抑制纤维素酶活性作用25。1.5 生产纤维素酶的生物自然界中很多生物都能够产生纤维素酶，其中包括，昆虫，微生物等。昆虫中主要有白蚁，蜗牛等。微生物中主要包括真菌类，细菌类及放线菌类。自1912年Kellerma 等首次从土壤中筛分出一株纤维素的分解菌以来，各种分解纤维的菌种被陆续的发现, 20世纪4050年代科学家对产纤维素酶菌种进行了大量分离和筛选工作，建立起了较为完整的筛选方法26。当代工业大规模生产纤维素酶主要依靠微生物的发酵完成。微生物中木霉属真菌是研究最广泛的纤维素酶产生菌，大规模工业化生产纤维素酶的微生物主要包括：绿色木霉（Trichoderma viride）、瑞氏木霉（Trichoderma reesei）、康宁木霉（Trichoderma koningii）、黑曲霉（Aspergillus niger）27，其中绿色木霉（Trichoderma viride）与里氏木霉（Trichoderma reesei）是已知产纤维素酶最强的菌种。全世界纤维素酶市场中20% 的纤维素酶产品是来自木霉与曲霉属28。产纤维素酶的微生物类群如下列1.1，1.2，1.3表所示29。表1.1 降解纤维素的部分真菌Tab. 1.1 Some fungi of cellulose degradationGroupMicroorganismFungiTrichoderma reeseiT. pseudokoningiiT. virideT. harzianumT. lignorunT. longibrachiatumT. koningiiPenicillium citrinumP. funiculosumP. irensisP. janthinellumP. notatumP. verruculosumP. variabilaAspergillus nigerA. flavusA. foetidusA. fumigatusA. oryzaeMyrothecium verrucariaMyceliophtora cellulophilumSclerotinum rolfsiiPhanerochaete chrysosproium表1.2 降解纤维素的部分细菌Tab. 1.2 Some bacteria of cellulose degradationGroupMicroorganismBacteriaClostridium acetobutyliumC. lochheadiiC. longisporumC. thermocellulmC. thermomonosporaC. thermocellulaseumC. stercoraiumPseudomonas fluorescensRuminococcus albusR. flavefaciensCellvibrio fulvusC. gilvusC. vulgaris表1.3 降解纤维素的部分放线菌Tab. 1.3 Some actinomycetes of cellulose degradationGroupMicroorganismActinomycetesThermomonospora fuscaThermomonospora curvataMicrobispora bisporaStreptomyces viridosporus1.6 生产纤维素酶菌种的研究现状自然界中微生物的数量可以说是十分可观的。随着自然选择与微生物的不断进化，亿万年来，很多微生物具有分解纤维素的能力。据研究发现，已经有近两百种微生物能够分泌纤维素酶30。真菌，放线菌和细菌是常见的产纤维素酶菌种。真菌中主要有木霉，青霉，曲霉，漆斑霉，根霉，镰刀霉等。其中丝状真菌是被研究较多且较常见的一类。其水解纤维素的途径主要是菌丝体由外部穿入木质纤维素原料的次生壁然后进入胞腔，自内部向外部水解纤维素，真菌所产生的纤维素酶大多为胞外酶，具有很强的水解纤维素能力。细菌中主要有纤维弧菌属，食纤维菌属和生孢食纤维菌属。与真菌相反，细菌对纤维素的降解是首先通过附着在纤维素上，自外向内生长，并且产生的纤维素酶一般为胞内酶，降解能力不如真菌。放线菌中主要有白色与灰色链霉菌等，降解纤维素的能力较细菌更差31。目前用于纤维素酶生产的菌种主要是木霉，青霉，曲霉，绿色木霉与里氏木霉被认为是最好的纤维素酶生产菌种。各国学者都在纤维素高产菌种选育方面进行了很多诱变工作，提高了纤维素酶产量，并取得了一定成就32。主要有紫外诱变，电磁辐射诱变，亚硝基胍诱变，等离子诱变等。近些年来由于航天技术的兴起，科学家将产纤维素酶的菌种带入到外太空中，利用宇宙环境中的强离子辐射，微重力等环境将黑曲霉菌种进行诱变，证实纤维素酶活力与野生株比得到了较大提高33。木霉菌虽然能够产生较强的内切与外切葡聚糖酶，但是纤维二糖酶的活力不高，从一定程度上降低了纤维素酶的水解效率，纤维二糖酶的活性成为了木霉菌纤维素酶活力的瓶颈。因此，为了提高木霉菌纤维素酶系的活力，必须提高纤维二糖酶的活力。目前，大量工作已经开展起来，利用基因工程将高表达的纤维二糖酶基因导入到木霉菌细胞中，与野生菌株相比，可以明显提高木霉菌纤维素酶系水解纤维素的能力34。1.7 纤维素酶的合成机理纤维素酶是一种诱导酶，其合成机制是诱导阻遏机制。纤维素酶的生物合成受到纤维素或其衍生物如羧甲基纤维素钠的诱导，但是也会受到容易代谢的碳源如葡萄糖，木糖，果糖及甘油等的抑制，屏蔽了纤维素酶基因的表达35。木霉，青霉等在以低浓度葡萄糖等为唯一碳源的培养基生长时，其合成的纤维素酶量仅仅约为以微晶纤维素为唯一碳源时的几十分之一，因此推断纤维素的降解产物中含有纤维素酶的诱导物，经研究发现为纤维二糖36。低浓度葡萄糖之所以能够诱导木霉菌产纤维素酶是因为试剂级别的葡萄糖中含有0.0058%的槐糖37，这是一种二糖，能够强烈诱导绿色木霉生产纤维素酶，诱导能力是纤维二糖的2500倍。Nisizawa等人用放射性同位素法证实了绿色木霉中槐糖诱导的纤维素酶蛋白是全新合成的38。此后相继发现了龙胆二糖，乳糖、山梨糖等也能够诱导纤维素酶的合成。在易代谢的碳源如葡萄糖、甘油等存在的条件下，即使存在槐糖这种强烈诱导纤维素酶的二糖，各种丝状真菌的纤维素酶合成基因也不表达。只有在葡萄糖将被耗尽时，酶的合成才重新开始39。曲音波等研究发现单纯以硫酸铵和葡萄糖培养斜卧青霉时，没有检测到纤维素酶的活性，但是改硫酸铵为硝酸钠为氮源时则有纤维素酶活力。这是因为以硫酸铵为氮源时，随着菌体的生长pH值会迅速降到3以下，从而使已合成的纤维素酶失活但并不是阻遏纤维素酶基因的表达36。1.8 纤维素酶的生产及分离纯化纤维素酶的生产方法主要包括固体发酵与液体深层发酵法。1.8.1 固体发酵产纤维素酶固体发酵（SSF）是利用含有充分湿度的不容底物发酵过程，但是不含有足够的水40。国内固体发酵产纤维素酶是以玉米秸秆，稻草等农作物为主要原料，具有生产工艺简单、投资较少、纤维素酶产品价格相对低廉等优点。目前国内大部分生产纤维素酶的厂家采用固体发酵法。然而，固体发酵有在本质上存在着很大的缺陷，不可能像液体深层发酵那样随着生产规模的扩大而大幅降低生产成本，而且所生产的酶制剂含有杂质量很大、产品外观粗糙、品质不稳定。王仪明等人41利用麦秆，麸皮等原料通过正交实验优化绿色木霉菌固体发酵产纤维素酶的条件，底物减量比发酵前有所增加。1.8.2 液体深层发酵液体深层发酵是二十世纪四十年代提出的概念，国内液体深层发酵产纤维素酶是将玉米秸秆等粉碎至20目以下，121，20min 灭菌处理后送入发酵罐内并且加入产纤维素酶菌种发酵。从发酵罐底的部均匀通入无菌空气形成气流搅拌。发酵完的物料经压滤、浓缩、干燥等一系列过程得到纤维素酶成品。其工艺流程如图1.3所示。 玉米秸秆发酵过滤产纤维素酶菌种浓缩干燥产品 图1.3 液体深层发酵产纤维素酶流程Fig. 1.3 The cellulase-producing process of deep liquid fermentation液体深层发酵产纤维素酶消耗的动能大、设备要求高。但是具有原料的利用率高、产量高、周期短、生产条件易于控制、产品质量稳定、产物容易提取分离的特点42。1.8.3 纤维素酶的分离纯化纤维素酶是由三种酶复合而成的，这三种酶分别是内切酶、外切酶与-葡聚糖苷酶，Gerrit 43等人研究绿色木霉菌的纤维素发现内切酶包括Endo(；)六种酶；外切酶包括Exo(；)三种酶；-葡聚糖苷酶只有一种。将绿色木霉菌产生的纤维素酶先经过Bio-Gel P10(100-200 mesh) 凝胶色谱柱过滤，再经过DEAE-Bio Gel A 阴离子交换柱，SE-sephadex 阳离子交换柱，过程及结果如图1.4所示。图 1.4 纤维素酶的分离纯化Fig. 1.4 The isolation and purification process of cellulase 1.9 纤维素酶的应用纤维素酶作为一种商业化酶已经使用了30多年，已经成为了工业上和学术上的研究目标44 1.9.1 在发酵工业上的应用 随着啤酒工业的日益兴旺，生产啤酒过程中所形成的啤酒糟对环境的污染也日趋严重。当前，啤酒糟大多作为饲料和低价肥料直接出售，但因其含水量较高，很容易霉变，因此不容易储存，造成环境的污染与资源浪费。用纤维素酶将啤酒糟水解，在适宜的条件可以得到还原糖，其中每干重100g啤酒糟可以得到10.8克的还原糖，还原糖的得率近11%45。还原糖可以进一步用于酵母发酵或生产菌体蛋白，节约了资源。1.9.2 在饲料工业中的应用反刍动物饲料中含有大量的纤维素，反刍动物内源纤维素酶的不足降低了纤维素的利用率与消化率。因此纤维素酶在饲料工业中具有广阔的应用前景，其作为一种高效安全的生物催化剂，在反刍动物饲料中产生的效果如下46。（1）提高青贮过程饲料的品质。（2）增加反刍动物对营养物质的吸收，提高饲料利用消化率。（3）改善反刍动物瘤胃的发酵功能。（4）提高反刍动物的产奶量与产奶品质1.9.3 在纺织工业的应用在纺织工业上，可将纤维素酶用于石磨水洗、生物抛光、织物减量等方面。纤维素酶目前广泛用于牛仔服装类织物的洗涤方面，利用纤维素酶对纤维素的水解效果，将牛仔服表面腐蚀剥离，从而产生于石磨水洗一样的效果，例如洗白褪色、染料脱色。经过纤维素酶处理过的牛仔服具有很强的立体效果，从而使牛仔服的风格独特，价格得到很大提升。生物抛光就是应用纤维素酶将织物表面的细微纤维水解掉从而得到表面光滑、手感良好、穿着舒适的纤维织物。与传统的织物处理工艺相比，生物抛光具有很多优点，如：穿着时更加舒适且不易起球、织物表面光洁不易褪色。经纤维素酶处理过的织物具有柔软、弹性及可伸缩性等优点。可使织物更加轻柔，减少织物重量，使穿着者更加舒适。研究证明，织物减量率控制在3%5%，可以使织物更加柔软并且织物的抗拉力也在允许的范围内。用酸性纤维素酶处理织物，可以有效去除其表面的毛羽等，提高了织物的穿着性47。1.9.4 在造纸工业的应用在过去的十年中，纤维素酶在造纸工业上的应用得到了很大发展48，木质原料在处理过程中需要提炼，打磨等过程，消耗了很大能量。使用纤维素酶处理木质原料后，可以增加纸品的光洁度、抗拉力、柔韧度等，并且节约了大约20%40%的能量49。1.9.5 在纤维素乙醇开发利用方面应用据调查，纤维素酶在生物燃料生产方面的应用可能是最广泛的50。 当今世界，能源问题已经成为人类社会必须面临的首要问题。化石燃料的储量有限再加上人类的无节制开发，化石燃料的枯竭只是时间问题。因此，必须开发出一种有效且廉价的能源代替化石燃料，生物质能源是唯一的一种可再生的能源，将生物质资源转化成液体燃料不仅可以有效替代化石燃料而且可以减少因为使用化石燃料而造成的环境污染问题。利用纤维素酶将木质纤维素原料如：甘蔗渣、玉米秸秆、稻草、等糖化然后利用酵母发酵得到纤维素乙醇51，利用纤维素生产乙醇对人类社会的发展具有划时代的意义52，全球各个国家正在努力研发纤维素乙醇。目前，生物乙醇的生产大部分是使用玉米淀粉作为原料的，成本较高并且造成了世界粮食储备的减少，因此研发高效且廉价的纤维素酶对于生产纤维素乙醇具有十分重要的意义。1.9.6 在其他方面的应用纤维素酶在中草药有效成分提取等方面也具有很大的潜力。研究证明，用纤维素酶法提取陈皮中的黄酮，产率达到4.35%而传统的化学提取方法仅有2.78%。经过优化的纤维素酶提取方法，其产率可以达到6.96%53。1.10 木质纤维素木质纤维素包括农业废弃物(秸秆、茎、壳)、林业作物、工业木材边角料及废弃纸品等。木质纤维素是一种可再生并且廉价的丰富资源，仅我国每年可利用的木质纤维素原料总量就可以达到20多亿吨，农作物秸秆等年产量可以达到7亿吨以上，其中稻草（19%）、小麦秸秆（21%）、玉米秸秆（35%）是我国的三大秸秆资源54。1.10.1 木质纤维素的组成木质纤维素包括三个部分：纤维素、半纤维素与木质素。纤维素分子是一种葡萄糖苷通过-1 ,4 糖苷键连接起来的链状聚合体，平均聚合度为8500-9500，结晶度高。半纤维素在细胞壁中位于许多纤维素之间，是由葡萄糖、木糖、甘露糖等聚合而成。半纤维素的分子链较短，分支较多，与纤维素相比很容易被水解。木质素是在植物界中含量仅次于纤维素重要的有机高聚物55，它是一类由苯丙烷单元通过碳-碳键与醚键连接的复杂并且无一定形态的高聚物，木质素与半纤维素一起将纤维素包裹起来。几种典型木质纤维素原料的组成如表1.456所示。表1.4 几种典型木质纤维素原料组成及含量Tab. 1.4 Composition and content of some typical lignocellulose原料纤维素(%)半纤维素(%)木质素(%)玉米秸秆362829小麦秸秆362822稻草371910稻壳362019软木455025352535硬木405524401825新闻纸6216211.10.2木质纤维素的预处理木质纤维素由于其结构复杂、组分构成特殊，使其很难直接迅速被纤维素酶降解。为了木质纤维素原料综合利用效果，必须对其进行适当的预处理。预处理的结果应该符合以下几个条件：（1）促进糖的生成；（2）减少碳水化合物的损失。（3）减少抑制水解和发酵的副产物生成；（4）节约成本57。预处理的方法包括化学法、生物法、物理法、等几大类58。目前研究最多的预处理手段是化学法，包括稀酸处理法、碱或氨处理、有机溶剂法、臭氧处理等。 酸处理法通常是用浓度为1%的硫酸在106110下处理一段时间，将半纤维素水解成单糖，降低了纤维素的聚合度59，提高了纤维素酶的可及性。稀酸预处理后，需将多余的酸中和掉。碱处理法通常是用浓度为8%的氢氧化钾、氢氧化钙等作用于木质纤维素原料。在170条件，时间约为30min。碱处理法使纤维原料，可使原料得到润胀从而内表面积增大，纤维素聚合度降低，脱除木质素，但是也损失部分半纤维素。氨处理是将木质纤维素原料浸泡在浓度为10%氨溶液中，时间为2448h。此方法可以脱除原料中大部分的木质素，并且可以除去抑制后期发酵的乙酰基，但是在氨浓度较高时，会有部分半纤维素的损失。臭氧可以降解木质素与半纤维素，用臭氧处理过的木质纤维素可以除掉大约60%的木质素，可以使纤维素底物的酶解速率提高近5倍左右