两水相萃取过程的选择性-生物分离工程.ppt

两水相萃取过程的选择性 (1) 细胞，细胞碎片影响分配（粘度） 总分配系数 (2) 亲和两水相分配 (3) 液体离子交换剂 两水相体系发展中的问题 相体系回收 (1) 环境 (2) 成本 成相聚合物的回收 (1) 压力敏感型两水相 (2) 热促相分离高聚物EO-PO (3) pH敏感型高聚物（聚两性离子高聚物, 多聚电解质) (4) 光敏感相分离高聚物 压力诱导相分离 加氨基酸对相图的影响 加氨基酸对相密度的影响 氨基酸的分离配系数 系线长度与分配系数 热诱导相分离 EO-PO-HP-EOPO 高聚物结构式 相体系回收示意图 相 图 盐的分配 蛋白纯化 EOPO-HPEOPO高聚物回收 pH 诱导相分离 Phase separationPhase separation Top phaseTop phase Bottom phaseBottom phase Recycle Light Light Recycling Polymers Forming Aqueous Two-phase SystemsRecycling Polymers Forming Aqueous Two-phase Systems 光敏感聚合物合成 Table 1 Probability of PTable 1 Probability of PNBC NBC with different components with varied composition to with different components with varied composition to form aqueous two-phase systemsform aqueous two-phase systems systems 1 (% w/w)2 (%w/w)3 (:%w/w)two-phases PNBC：PEG60003.3:6.72.5:103.0:8.0no PNBC：PEG200003.3:6.72.5:103.0:8.0no PNBC：PPG3.3:13.32.5:203.0:16turbid PNBC：Dex200003.3:3.32.5:6.73.0:4.0yes PNBC：SDS3.3:6.72.5:103.0:8.0turbid PNBC：Tween 3.3:33.32.5:503.0:40no PNBC：EO30PO703.3:6.72.5:103.0:8.0no PNBC：IPA3.3:33.32.5:503.0:40no PNBC：（NH4） 2SO4 3.3:6.72.5:103.0:8.0precipitation The number 1, 2, 3 denotes the initial volume ratio 1:1, 2:1, 3:2, respectively. The number 1, 2, 3 denotes the initial volume ratio 1:1, 2:1, 3:2, respectively. All systems were stood for one day at 20 All systems were stood for one day at 20. . Fig 1.Phase diagram for PFig 1.Phase diagram for PNBC NBC - - DextranDextran in water solution at 20 in water solution at 20. . Figure 2. Repeated recovery of polymer in Figure 2. Repeated recovery of polymer in aqueous solutionaqueous solution Figure 3 Recovery comparison of light-sensitive Figure 3 Recovery comparison of light-sensitive radiation and thermo-sensitive precipitation of radiation and thermo-sensitive precipitation of PNBC polymer in two-phase systems. PNBC polymer in two-phase systems. The concentration of salts in total phases was The concentration of salts in total phases was 50mM. 50mM. The initial volume ratio is 3:2(ml/ml). The initial volume ratio is 3:2(ml/ml). 两水相系统的应用 蛋白质纯化 抗生素，氨基酸，天然成分 w酶相转移催化 w细胞器分离 光敏感可再生两水相中青霉素光敏感可再生两水相中青霉素 酰化酶催化青霉素酰化酶催化青霉素G G为为6-APA6-APA 图图 6APA在系列盐盐系统统中的分配系数K 图图图图6.3 6.3 不同系不同系统统统统中中PGPG的的酶酶催化催化转转转转化率化率图图图图6.4 PA6.4 PA浓浓浓浓度度变变变变化化PGPG的的转转转转化率（未加化率（未加盐盐盐盐） 图图图图6.5 PA6.5 PA浓浓浓浓度度变变变变化化PGPG的的转转转转化率（化率（50mM 50mM KClKCl） 配制配制5%PNBC300000-5%PNBC300000- 40%Dextran2000040%Dextran20000两水相体系两水相体系45 45 ml(pH7.8,ml(pH7.8,含含0.1M 0.1M 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液) )，上，上 下体积比为下体积比为8:18:1，加入固定化酶，加入固定化酶0.10g0.10g （0.20.2，0.3g0.3g）, ,青霉素青霉素GG（NaNa）0.40g,0.40g, 于于2020振荡反应，每振荡反应，每60 min60 min测定测定6-6- APAAPA浓度浓度, ,计算青霉素计算青霉素GG转化率。转化率。 重复批转化反应与上述相体系基本相同，只是另加重复批转化反应与上述相体系基本相同，只是另加50mM 50mM KClKCl， 加入固定化酶加入固定化酶0.3g, PG0.18g,(0.4%), 0.3g, PG0.18g,(0.4%), 在反应在反应360min360min后后, ,测定上相测定上相 中中6-APA6-APA，之后移出上相，加入与原上相相同的组成的上相及，之后移出上相，加入与原上相相同的组成的上相及 PGPG，重复进行反应，测定，重复进行反应，测定6-APA6-APA浓度，计算转化率。浓度，计算转化率。 结结 论论 1 1 合成一种对光敏感，可回收再利用的两水相成合成一种对光敏感，可回收再利用的两水相成 相聚合物相聚合物 2 2 光照回收率均在光照回收率均在9898以上，热敏回收率在以上，热敏回收率在95%95%以以 上，可以很好地实现聚合物回收上，可以很好地实现聚合物回收 3 3 青霉素青霉素G G转化率达到转化率达到79.8%79.8%，较单水相提高，较单水相提高15%15% 4 4 尚需寻找另一种可回收高聚物，使得两水相中尚需寻找另一种可回收高聚物，使得两水相中 两种高聚物都能得到回收。两种高聚物都能得到回收。 全回用两水相体系 意义： 1.合成可再生的聚合物。 2.构建两水相体系，使两相均能回收 3.较好的分离效果。 内容： 1.以异丙基丙烯酰胺（NIPA）、乙烯基 吡咯烷酮 （NVP）、叶绿酸铜钠（CHL）三单体合成可再生 光 敏感聚合物PNNC 2.PNNC与另一pH敏感聚合物PADB成相 3.应用该可再生两水相体系 合成聚合物PNNC示意图 R1： 2.聚合物PNNC的合成与表征 (1)聚合物PNNC的单体比例选择 聚合物PNNC(NIPA:NVP:CHL) 摩尔比196:4:1196:6:1196:8:1196:10:1196:20:1 LCST（ ） 33.432.131.829.428.6 选取的单体摩尔比为196：8：1 成相物质质浓浓度 与10%聚合物溶液 成相情况 PEG2000010%不成相 30%不成相 PEG1000010%不成相 25%不成相 DEX20000 10%成相 20%成相 30%成相 PPG40%不成相 EOPO 406010%不成相 30%不成相 EOPO 307030%不成相 （NH4）2SO430%沉淀 SDS20%不成相 羧羧甲基纤维纤维素 钠钠 3%沉淀 PNBC10%不成相 PABC5%不成相 PADB5%成相 1.聚合物的成相 通过成相实验和相图，确 定使用的两水相体系为 PNNC(10 %) / PADB(5%) 绘制相图 采用 节点检测法 BACK 两水相成相、分相、聚合物回收示意图 溶液浓浓度 溶液体积积 1mL0.8mL0.5mL 6 16min15min10min 10% 22min20min15min 聚合物质质 量（g） 0.0300.0480.0600.0500.0800.100 时间时间 （min ） 101516152022 1g聚合物沉淀平均所需要的照射时间为266分钟 由公式：Q=W*T 1g聚合物沉淀大概所需要吸收的激光能量为4.8kJ 1度电能够使750g聚合物沉淀 2.聚合物PNNC光照回收 （1）聚合物PNNC的光照条件 采用激光输出功率为300mw，照射点的面积为1.77*10-6m2 （2）单水相PNNC溶液光照回收 （3）单水相PNNC溶液重复回收实验 组别组别空白NaClNa2SO4Na3PO4Na4P2O7NaClO4KSCN 光照沉淀 时间时间 （ min） 15141516121613 回收率（ ） 99.599.899.193.399.699.899.7 96.8 （4）两水相两聚合物回收实验 （5）两水相两聚合物重复回收实验 组别组别空白NaClNa2SO4Na3PO4Na4P2O7NaClO4KSCN 光照沉淀时时 间间（min） 15141516121613 PNNC 回收率(%) 95.598.197.093.396.696.898.7 PADB 回收率(%) 97.098.197.697.398.697.598.3 95.5% BACK 3.蛋白质在两水相体系中的分配 （1）盐种类对溶菌酶及牛血清白蛋白（BSA）分配的 影响 （均采用20mM无机盐） 4.氨基酸的分配实验 (1)盐种类对氨基酸分配的影响 采用色氨酸（Trp），酪氨酸（Tyr）为试样 1. 通过自由基无规聚合，合成了水溶性光敏感聚合物PNNC 粘均分子量约为 7.1103。 2. 选取的成相体系为10（w/w） PNNC与5（w/w） PADB， 成相体积比为 1：3。两水相中两聚合物多次光回收和pH回收都在95.5到98.7之间， 一定程度上解决了聚合物回收率低的问题。 3.以氨基酸、蛋白质等生物物质为研究对象，考察该两水相系统的性质。其中 Tyr、Trp的最佳分配系数分别为0.12、 6.25；溶菌酶、BSA的最佳分配系 数分别为0.11、4.2。 4.该两水相体系对乳酸小分子的分配系数均接近于1，最大分配系数只有2.30 。 5. 在乳酸的分配模型关联中，朱自强改进的D-H模型 相关性最好，说明在 PNNC浓度8.012.0范围内，该模型对乳酸在PNNC/PADB两水相体系中分 配系数关联最为准确。 结论 pH敏感型可回收丙烯酸类两性高聚 物的合成及其在两水相中应用 意义： 1 构建两种成相聚合物均可回收的新两水相体系 （PNBC/PADB） 2 较高的回收率（ 95） 3 操作条件相对温和采用丙烯酸（AA）， 甲基丙烯酸二甲氨基乙酯 （DMAEMA）， 甲基丙烯酸丁酯（BMA） PADB反应示意图： 通过1H NMR中单体上特征氢，计算得到三种单体摩尔比为AA ：DMAEMA：BMA27.7：9.2：1；投料比为19.7：7.24：1 4.聚合物成相实验 成相物质浓度与5聚合物溶液成相情况 PEG20000 5不能成相 8不能成相 10可成相 15可成相 20可成相 30产生沉淀 PEG1000020不能成相 30下相沉淀 DEX2000010不成相 30不成相 (NH4)2SO430不成相 Na3PO430不成相 PNBC10成相 15成相 PABC5不成相 PNNC10不成相 PNNBC5不成相 选择由pH敏感型 聚合物PADB和光 敏感聚合物PNBC 组成两种成相聚 合物均可回收的 两水相体系。 5.相图 PADB浓度 PNBC浓度 T B M C 选择由10%(w/w)PNBC/5%(w/w)PADB组成两水相体系， 2.无机盐种类及浓度对聚合物PADB单水相回收影 响 1.未加无机盐, 2. NaCl；3. KCl；4. Na2SO4 ； 5.（NH4）2SO4 ；6. Na3PO4；7. Na4P2O7 3.单水相聚合物PADB多次循环使用的得率 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 12345 回收次数 回收率（） 40mM Na3PO4 对照 96.7 98.6 4.无机盐种类对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响 1. NaCl ；2. KCl ； 3. Na2SO4 ；4.（NH4）2SO4；5. Na3PO4 ；6. NaClO4 98.7 96.8 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 123456 无机盐种类(10mM) 回收率(%) PNBC回收率 PADB回收率 5.无机盐浓度对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 020406080100120140 4 回收率（） PNBC的回收率 PADB回收率 Na3PO4浓度 (mM) 98.6 98.2 6.多次回收对两水相PNBC/PADB聚合物回收影响 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 0123456 回收次数 回收率（） PNBC回收率 PADB回收率 97.8 96.7 3. 无机盐种类及浓度对分配系数的影响 27.5 1.没加无机盐；2. NaCl；3. KCl ；4. KBr；5. NaHSO3 ；6. Na2SO4；7.Na3PO4；8. Na4P2O7 结 论 1.通过自由基无规聚合，合成了pH敏感型的可回收丙烯酸类两 性聚合物PADB ，其粘均分子量约为3.7104，聚合物中三种 单体摩尔比为AA：DMAEMA：BMA27.7：9.2：1； 2.由10（w/w）PNBC /5（w/w）PADB组成两种成相聚合物均 可回收的两水相体系，成相体积比为1：2。经过五次循环使 用后聚合物PNBC的回收率为97.8；PADB的回收率96.7； 3.该两水相体系对大分子有较好的分离效果，其中BSA最大分 配系数可达27.5；溶菌酶的最大分配系数可达0.49； Phase transfer bioconversion of penicillin G into 6-APA by immobilized penicillin acylase in recycling aqueous two- phase systems with light-pH sensitive copolymers enzyme enzyme enzyme enzyme enzyme EnzymeticEnzymetic reaction reaction substratesubstrate productproduct enzyme enzyme enzyme EnzymeticEnzymetic reaction with ATPS reaction with ATPS Relation between 6-APA partition coefficient and inorganic salts Top (g/L) bottom (g/L) K 6-APA 0.81 0.80 1.01 Phenylacetic acid 0.67 0.69 0.97 PG（Na） 0.39 0.39 1.00 Salts conc. 0.5%（w/w） 1.0%(w/w) 1.5%(w/w) MgCl2 0.99 0.99 0.94 NaCl 3.56 5.78 1.53 NaHSO3 0.8 0.73 0.38 Na3PO4 2.21 1.49 0.44 KI 0.54 0.37 0.32 MgSO4 1.64 2.00 0.47 Na2SO4 0.32 0.54 0.53 KH2PO4 0.7 0.8 0.73 Partition coefficients change of substrate and products during Conc. Change of phenylacetic acid and 6-APA during bioconversios Conc. Change of 6-APA in top and bottom phase Conc. Change of Phenylacetic acid in top bottom phase Total yield of 6-APA in top and bottom phase 小 结 1 Immobilized penicillin acylase was used for bioconversion of penicillin G into 6-APA in ATPS with PNBC and PADB. 2 K6-APA 5.78 (containing1% NaCl). Reaction time at 7h or so. The 6-APA mole yields 85.3% (pH 7.8, and 20 ) 3 K 6-APA and K phenylacetate acid was significantly changeable during reaction. 4 PNBCcou