GB1493494食炊具消毒卫生标准大肠菌群.ppt

大肠菌群 Coliform bacteria 1. 概念及卫生学意义 o1.1概念 o大肠菌群系指一群能在36 24小时内发酵乳糖产 酸产气，需氧、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆 菌。包括肠杆菌科中4种常见的细菌： o埃希氏菌属、 o柠檬酸杆菌属、 o克雷伯氏菌属 o肠杆菌属（实际上还包括产气肠杆菌） o所以，大肠菌群是作为卫生指标而选择的一类细 菌。 1.2 卫生学意义 o肠道传染病的传播，主要是通过粪便污染水 及食品或其他物品来实现，但从这些样品中 直接检查病源菌是非常困难的，也是难以做 到的，主要有以下原因： 1.2 卫生学意义 o病原菌在粪便中含量较多，但经过污染物品 （食品和水等）的稀释，一般难以检出。 o粪便中的非病原菌数量比病原菌数量大得多 ，即使采用强抑制性选择培养基，也无法与 数量占绝对优势的非病原菌相竞争，势必影 响病原菌的发育和增殖。 o肠道病原菌种类较多，生物学性状也不尽相 同，不可能全面检验，加之检验方法较为繁 琐，设备及技术要求较高，难以普遍推广。 1.2 卫生学意义 o理想的粪便污染的指标菌，应具备下列条件 ： o（1）是人类肠道细菌丛的组成部分，在数量 上占优势； o（2）排出体外后，在外界环境影响下，其存 活时间应与肠道致病菌大致相似或稍长； o（3）检验方法简便，易于检出与计数； o（4）如用作饮用水时，对氯消毒的抵抗力应 不低于肠道致病菌，而且进入水中不再繁殖 。 1.2 卫生学意义 o在卫生细菌学检验中，可以作为粪便污染指 标菌的有三类细菌：即大肠菌群、粪链球菌 和产气荚膜梭菌。 o大肠菌群： o 数量最多； o 存活时间与肠道主要病原菌大致相似 ； o 检验方法简单易行。 o故大肠菌群作为粪便污染指标菌较为适宜。 1.2 卫生学意义 o在大肠菌群中，大肠埃希氏菌是人、畜肠道 内的优势菌类，另外三种只占少数。但值得 注意的是在腹泻患者的粪便中，肺炎克雷伯 氏菌和阴沟肠杆菌等也是大量存在的，因此 ，它们也具有同样的卫生学意义。 1.2 卫生学意义 o大肠菌群中4种细菌生长的适宜温度不相同 。 o夏季（气温3033）：优势菌是大肠埃希 氏菌； o冬季（气温710）：阴沟肠杆菌； o秋季（气温2023）：大肠埃希氏菌、阴 沟肠杆菌两者数量相近。 1.2 卫生学意义 o通常可根据水中大肠菌群的数量来判断水源是否被粪便所污染 ，并可间接推测受肠道病原菌污染的可能性。 o大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的 检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表 明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪 便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带 菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些 肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有 粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能 性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具 有潜在的危险性。 2大肠菌群检验方法 oGB/T 4789.3-2003（多管发酵法） oGB/T 4789.3-2008（多管发酵法） o纸片法 多管发酵法 o应用范围 各类食品中大肠菌群的测定。 o原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰 氏阴性无芽胞杆菌，在36，24小时内能发 酵乳糖产酸产气，并在选择性培养基上产生 典型菌落 仪器 o高压蒸汽灭菌器 o恒温培养箱 o显微镜 o试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等。 检验程序 361 24 2h 培养 检样 稀释 乳糖胆盐发 酵管 检验程序 伊红美蓝琼脂（EMB）培养基 361，1824h 培养 产酸产气 报告 大肠菌群阴性 不产气不产气 检验程序 革兰氏阳性 革兰氏染色 大肠菌群阴性 查MPN表 乳糖发酵管 361，242h 产酸产气不产酸不产气 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 报告 报告 革兰氏阴性 无芽胞杆菌 挑取可疑菌落 报告 查MPN表 查MPN表 检验步骤 o发酵法采样 食（饮具抽检碗、盘、口杯，将2.0cm2.5cm（ 5cm2）灭菌滤纸片紧贴内面各10张（总面积50cm2） 、碟、匙、酒杯以每5件为1份，每件内面紧贴灭 菌滤 纸片各2张（总面积50cm2/份），经1min，按序取置 入50mL灭菌盐水试管中，充分振荡后，制成原液。 筷：取每双的下段12cm处约50cm2（12cm 2cm 2cm），置入50mL灭菌盐水试管中，充分振荡20次， 制成原液。 检验步骤 n用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入 含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内 ，振摇混匀，制成1：100的稀释液。 n另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次做10倍递 增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭 菌吸管。 n根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估 计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。 检验步骤 o乳糖发酵（初发酵）： o 分离培养： 紫黑色有金属光泽菌落，G-杆菌 粉红色和红色菌落 检验步骤 o证实试验：乳糖发酵管发酵 o结果报告 根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查 MPN检索表，报告每100mL（g）样品中总 大肠菌群的MPN值。 伊红美蓝琼脂(EMB) o制法： o将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中， 校正pH，分装于烧瓶内，121高压灭菌 15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼 脂，冷却至5055，加入伊红和美蓝溶 液，摇匀，倾注平板。 3.2伊红美蓝琼脂(EMB) o质控：此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质 控菌株接种后，35 培养1824小时，观 察结果应如下表： 伊红美蓝琼脂(EMB) 菌 株 菌 号 生长情 况 菌落颜色 产气肠杆菌 ATCC 13048 好 粉红， 无光泽 大肠埃希氏菌 ATCC 25922 好，极 好 有紫绿金属光 泽，黑心 肺炎克雷伯氏 菌 ATCC 13883 好 绿金属光泽， 有黑心 伊红美蓝琼脂(EMB) 菌 株 菌 号 生长情 况 菌落颜 色 奇异变形杆菌 ATCC 25933 好，极 好 无色 鼠伤寒沙门氏 菌 ATCC 14028 好，极 好 无色 金黄色葡萄球 菌 ATCC 25923 被抑制 伊红美蓝琼脂(EMB) o说明： o（1）本培养基为弱选择性，Difco手册第十版将 配方中10g乳糖改为5g乳糖和5g蔗糖，认为效果更 佳。 o（2）伊红-Y又称曙红或四溴萤光素(CO2H8O5Br), 为酸性染料。美蓝又称亚甲蓝 (CH3)2N2C12H6NS(OH)，为碱性染料。当大肠杆 菌分解乳糖产酸时，细菌带正电荷，染上红色， 再与美蓝结合而形成紫黑色菌落，并有绿色金属 光泽。二者除了作为指示剂外，还有抑制革兰氏 阳性菌的作用。 伊红美蓝琼脂(EMB) 说明： （3）在碱性环境中，不分解乳糖产酸的细菌不着 色。伊红、美蓝不能结合，故沙门氏菌和志贺氏 菌等为无色或琥珀色半透明菌落。 （4）此培养基原为Levine氏设计，用于鉴别大肠杆 菌和产气杆菌，并可快速鉴定白色念珠菌及凝固 酶阳性葡萄球菌。美国公共卫生协会和美国细菌 学会推荐，用于增殖或鉴别大肠杆菌的检查。但 某些沙门氏菌、志贺氏菌可被抑制。培养基保存 注意避光防止氧化。 3. 培养基 3.1乳糖胆盐培养基： o成分： 蛋白胨 20g 猪胆盐 5g 乳糖 10g 0.04%溴甲酚紫 25mL 蒸馏水 1000mL pH 7.4 分装每管10mL，并放入一个小倒管，11515min 高压灭菌。 3.2 伊红美蓝琼脂 o成分 ： 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 17g ， 2伊红Y溶液 20mL ， 0.65美蓝溶液 10mL ， 蒸馏水 1000mL， pH7.1 3.3乳糖发酵培养基： o成分： 蛋白胨 20g 乳糖 10g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL， 蒸馏水1000mL pH7.4 检验步骤 o纸片法采样 随机抽取消毒后准备使用的各类食具（碗、盘 、杯等），取样量可根据大、中、小不同饮食行 业，每次采样610件，每件贴纸 片两张，每张纸 面积25cm2，（5cm 5cm ),用无菌生理盐水湿润大 肠菌群检测纸 片后，立即贴于食具内侧表面， 30s后取下