毕业论文-果蔬酶促褐变的机理及控制技术研究进展.doc

anyang institute of technology 本 科 毕 业 论 文果蔬酶促褐变的机理及控制技术研究进展researchprogress onenzymaticbrowningmechanismoffresh-cut fruits andvegetablesandits control系（院）名称： 生物与食品工程学院 专业班级： 08级食品科学一班 学生姓名： 指导教师姓名： 指导教师职称： 副教授 2012年 5 月毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得安阳工学院及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日期： 使用授权说明本人完全了解安阳工学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名： 日 期： 目 录中文摘要、关键词英文摘要、关键词引言1第一章 绪论21.1 问题的提出21.2目前研究中存在的问题31.3 主要研究内容3第二章 果蔬酶促褐变机制研究42.1酶促褐变发生的生化条件42.1.1酚类物质42.1.2酶类物质52.1.2.1多酚氧化酶52.1.2.2多酚氧化酶的底物62.1.2.3过氧化物酶62.1.3氧气62.2 酶促褐变的机理72.2.1酚酶的区域分布假说 72.2.2自由基伤害假说72.2.3 保护酶系统假说8 第三章 果蔬酶促褐变的控制技术研究83.1 物理方法83.1.1 超滤83.1.2 加热和漂烫93.1.3 驱除氧气93.1.4 可食性涂膜93.1.5 冷藏93.1.6 电场处理.93.1.7 加压处理93.1.8 气调包装103.2 化学方法103.2.1 无机盐处理103.2.2 改变底物或产物103.2.3 抑制多酚氧化酶的活性113.2.4 其它方法133.3 生物方法133.3.1 微生物代谢产物133.3.2 基因工程133.3.3 植物提取物143.3.4 酶法14展 望14致 谢15参考文献16果蔬酶促褐变的机理及控制技术研究进展摘要：酶促褐变是引起水果、蔬菜贮存、 加工过程中营养价值、 外观品质等降低的主要原因之一。 果蔬酶促褐变的三个必要生化条件是酚类物质、多酚氧化酶（ppo）和氧气；加热处理、调节 值和添加抑制剂等均能有效防止果蔬的酶促褐变。本文介绍酶促褐变的机理及与褐变相关的酶, 并从物理、化学等方面介绍了一些新近发展的酶促褐变抑制方法。关键词：鲜切果蔬；酶促褐变；机理；多酚氧化酶；控制方法researchprogress onenzymaticbrowningmechanismoffresh-cut fruits andvegetablesandits controlabstract:enzymaticbrowning is one of important problems influen-cing shelf-life offresh-cut fruits and vegetables.the three biochemical conditions of enzymatic browning promoted by enzyme in fruit and vegetable such as hydroxybenzene ,ppo and oxgen are comprehensively analyzed. many possible methods to control browning such as heating regulating ph, adding inhibitons of ppo, are put forward respectively. those methods can effectively inhibit browning promoted by enzyme. in this paper, the mechanismof enzymaticbrowning and enzymes of browning-related werereviewed. somemethods, whichdeuelopedrecently,of control-lingenzymatic browning for chemical and biological methods, were introduced.key words: fresh-cut fruits and vegetables; enzymatic browning; mechanism;polyphenol oxidase; control methods.ii引 言水果蔬菜是人们日常生活中不可缺少的食品之一, 含有丰富的碳水化合物、有机酸、维生素及无机盐, 因而成为人类重要的营养源。鲜切果蔬是指将完整新鲜果蔬经分级、清洗、去皮、整修、切分、包装等程序处理，供人们立即食用或方便餐饮业使用的一种新式水果加工产品。随着生活节奏的加快，鲜切果蔬以其具有的省时、省力、卫生、方便、新鲜、可食率高达100%等优点在市场上越来越受消费者青睐。在食品贮藏加工中, 主要存在4种形式的褐变: 美拉德反应、抗坏血酸氧化、焦糖化反应和酶促褐变。果蔬褐变是果蔬成熟老化生理衰退的特征之一。由于发展快，造成果蔬品质变化，贮藏期缩短，成为贮藏保鲜的主要障碍，也成为果蔬采后研究的热点。smock等人在苹果的贮藏研究中发现有八类生理失调反应，包括冻害、冷害、组织衰老、缺钙、高二氧化碳、低氧、机械损伤等均能引起果实褐变。近年来，我国果蔬产量逐年递增，质量不断提高，但果蔬在采后包装、贮藏、运输到消费者手中的整个过程都不可避免地遭到如挤压、振动、碰撞等机械损伤。尤其近年兴起的鲜切加工业给果蔬造成人为的机械伤害，这种机械伤害破坏了果蔬天然的组织结构，使果蔬发生不同程度的组织褐变影响了果蔬的外观质量，加速了其营养成分的损失，导致果蔬商品价值的下降。同时，机械损伤将导致果蔬生理代谢紊乱，引发一系列不利于贮藏的生理生化反应，机械损伤也为微生物侵染提供了机会, 使果蔬衰老加快，腐烂增加，造成果蔬在贮运过程中的损失也相当严重。由此可见造成果褐变的原因是多方面的。 褐变是鲜切果蔬加工中常见的一种现象，从本质上可分为两大类，即非酶褐变和酶促褐变。非酶促褐变是因果蔬加工后加热或及贮藏引起的。酶促褐变是在有氧条件下，由于多酚氧化酶（ppo）的作用，果蔬组织中的酚类物质氧化为醌，醌很快聚合成为褐色素而引起组织褐变。ppo是发生酶促褐变的主要酶, 存在于大多数果蔬中。酶促褐变的结果不仅仅是颜色的变化，还会产生令人不快的味道，并造成营养的流失。而鲜切果蔬的褐变主要是酶促褐变引起的2。一直是采后生理研究的重点。国内外对鲜切果蔬的酶促褐变的成因和动力学都进行了大量的研究，对其控制技术的研究也有一定的成果。果蔬的褐变机制和控制技术的研究已经有60多年，国内外有关主张主要有：酚酶区域分布假说、自由基伤害假说、保护酶系统假说等。不过大部分国内外学者都认同多酚氧化酶与多酚底物发生氧化反应是酶促褐变的主要机制。酶促褐变只有在多酚氧化酶、多酚类底物、氧这三个条件同时具备才可能发生。研究表明：不同品种、生理期所含的多酚底物不同，多酚氧化酶同工酶的含量、种类也不同，导致酶促褐变机制不同。根据酶促褐变发生的条件，抑制酶促褐变应从以下方面考虑：减少酚类物质含量、控制多酚氧化酶（ppo）、过氧化物酶（pod）的活性，降低氧的浓度3,4。国内外的研究者采取了多种方法，总的来说有三类：物理方法、化学方法和生物方法。物理方法有漂烫、超高静压处理、低温处理、可食性涂膜、气调法（map）、辐照处理等5；化学方法有改变底物或产物，抑制多酚氧化酶的活性，例如利用抗坏血酸及其衍生物的抗氧化作用来抑制醌的生成，酸类物质可降低产品ph值或络合金属离子而抑制ppo的活性，含-sh-化合物和so2的抗褐变能力等；生物方法有利用植物提取液、蜂蜜、乳酸菌代谢产物、蛋白酶等可抑制酶促褐变的发生，也可以从产品原料考虑，采用基因工程方法培育出控制酶促褐变的新品种3,6。由于技术条件、加工成本等原因，在工业化生产中用多酚氧化酶抑制剂来处理水果是防止果品加工过程中酶促褐变的重要手段，但是由于同种水果不同品系间多酚氧化酶同工酶的含量、种类及理化性质上的差异，因而它们对同种抑制剂的处理效果不同。在食品加工过程中、抑制水果多酚氧化酶引起的酶促褐变应针对不同品种ppo同工酶的差异，来选用不同的抑制剂和抑制方法。果蔬的酶促褐变研究一直比较活跃 ，且取得较大成效。本文就酶促褐变产生的条件以及控制方法作一综述，旨在为果蔬贮存和加工过程防止酶促褐变提供依据。第一章 绪论1.1 问题的提出随着社会的不段进步和人们生活水平的不断提高，尤其是在这个到处充斥着快节奏和高压力的现代环境中，人们越来越注重养生，水果已成为人们日常生活中不可替代的一部分。这不仅仅是因为它那五彩缤纷的外观，更因为它那独特的风味以及其中各种维他命等营养元素。随之而来的是全国水果种植面积逐渐扩大，以及水果品种和水果产量的不断提高，水果的产销矛盾也越来越突出。果农卖果难、水果价低、约占总产量25%的残次果烂在田间地头，而消费者却吃不到安全、新鲜、快捷的水果等问题严重影响果农的收入、消费者生活水平和地方经济的发展。鲜切水果是指将完整新鲜水果经分级、清洗、去皮、整修、切分、包装等程序处理，供人们立即食用或方便餐饮业使用的一种新式水果加工产品。随着生活节奏的加快，鲜切水果以其具有的新鲜、方便、营养和无公害的优点以及香脆可口及营养特性而深受青睐。但是鲜切水果在生产过程中去皮、切分等加工将使其组织损伤，会导致呼吸作用和代谢变化的急剧活化，从而导致酶促褐变，产生各种感官及营养品质的劣变，影响产品的外观品质和商品价值。在美国和北欧，鲜切果蔬已席卷市场。在一些发达国家，鲜切果蔬已实行系统化、规模化生产，并建立了各自的保鲜系统。迄今为止所掌握的鲜切果蔬知识和经营经验表明，完全可以通过更加成熟的保鲜技术和科学管理，达到保持鲜切果蔬的新鲜品质和安全的目的。目前，我国的鲜切果蔬行业起步较晚，随着国外快餐业的飞速发展和国内消费者对现代食品的各种需求，鲜切果蔬业开始蓬勃发展。由于大多消费者的传统观念的逐渐转变及鲜切果蔬市场中仍有许多理论和技术问题需要完善、改进和解决，这就使得此行业大有发展空间和提升潜力。就鲜切水果的酶促褐变现象来说，研究如何抑制鲜切水果的酶促褐变、保持其食用品质及延长其货架期显得十分重要。1.2目前研究中存在的问题目前人们对酶促褐变机理有了更加深入的认识，ppo已得到纯化，其相关的生物学特性也有大量研究，并且找到了多种控制鲜切果蔬褐变的方法。但酶促褐变的机理尚末完全明确，褐变控制措施的效果也并不十分理想。而且过去的研究主要是从化学控制方面作了大量的工作，随着消费者生活水平的提高，化学试剂引起的食品安全问题越来越受到严重关注。1.3 主要研究内容本文根据鲜切果蔬自身的特点以及产生酶促褐变的机理，首先介绍了酶促褐变的定义，进而从多酚氧化酶的结构及其催化反应机制出发, 综述了抑制酶促褐变的物理、化学和生物学方法及其研究进展。第二章 鲜切果蔬酶促褐变机制研究2.1 酶促褐变发生的生化条件酶促褐变是指果蔬在受到机械损伤或处于异常环境（受冻、受热）下，在氧化酶作用下将酚类物质氧化形成醌，醌的多聚化以及它与其他物质的结合产生黑色或褐色的色素沉淀，从而导致果蔬的营养丢失。酶促褐变的产生必须具备三个条件 ：酚类物质 、多酚氧化酶（ppo）、和氧气，只有这三个因素同时具备褐变才会发生。决定酶促褐变率的最重要的因素即为组织中活性多酚氧化酶（ppo）和酚类化合物的浓度、可利用的氧的含量、 ph值和温度等。2.1.1 酚类物质ppo作用的底物是酚类物质。果蔬中的酚类物质是酶促褐变的一个重要因素,而且它的种类多、分布广、含量丰富。酚类物质按酚羟基数目可分为一元酚、二元酚、三元酚及多元酚。酚类物质的合成途径有两条：其一是由苯丙氨酸脱氨基而形成，其二由莽草酸或与之一个的环己烷生物直接芳香化而形成。其中，第一条途径是高等植物中最主要的途径。 酚类物质主要是由碳水化合物代谢衍生出来的产物，如：酪氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、愈创木酚、焦性没食子酸、儿茶酚、咖啡酸、绿原酸、花色素、黄酮类化合物、单宁等。除了黄酮类化合物以外，多数酚类物质的生物合成均来自共同的前体物质苯丙氨酸，其它部分由乙酰-coa经聚酮酸途径产生14。酚类物质作为酶促褐变的底物有很多报道，然而不同种类、品种的果蔬中参与酶促褐变反应的酚类底物却有很大差异。酚类物质的种类和含量在果蔬生长和成熟过程中会发生变化，在果蔬贮存过程中随贮存时间的延长含量下降，ppo 活性增加 ，褐变增加。 一般认为在贮存期间酚类物质含量的下降是被质含量的下降是被ppo 氧化的结果。酚酶对邻羟基结构的作用快于一元酚，对位二酚也可被利用，但间位二酚不能作为底物 ，甚至对酚酶还有抑制作用。程建军等人实验表明梨果 ppo对4 种底物的催化能力依次为：没食子酸儿茶酚绿原酸咖啡酸。有关ppo 的最适底物的研究结果不尽相同， 刘光东等对荔枝ppo 的底物研究后认为 ppo最适底物是3甲基儿茶酚， 国外对此也有相同报道。 也有人认为ppo 的最适底物不是儿茶酚 ，如杏果ppo的最适底物是绿原酸。王坤范等对不同品种桃ppo的最适底物研究后发现 ，品种间存在差异 ，如“大久保”ppo 的最适底物是咖啡酸， 而“绿化3号”是儿茶酚。王清章等人用tlc 和hplc 法分析了莲藕中提取的酚类物质，发现莲藕中ppo 的最适底物为没食子酸。总之，不同种类果蔬ppo 的最适底物可能不同，同一种类果蔬在不同的生育阶段，ppo的最适底物也可能不同。研究ppo 主要底物应以该底物含量在褐变前后发生变化的程度为主要依据。2.1.2酶类物质催化酶促褐变反应的酶类主要为多酚氧化酶（ppo）和过氧化物酶（pod）。在果蔬细胞组织中ppo存在的位置因原料的种类、品种及成熟度不同而有差异。ppo在大多数果蔬中存在，如马铃薯、黄瓜、莴苣、梨、番木瓜、葡萄、桃、芒果、苹果、荔枝等，在擦伤、割切、失水、细胞损伤时，易引起酶促褐变。ppo催化的酶促褐变反应分两步进行：单酚羟化为二酚，然后二酚氧化为二醌。ppo以铜离子为辅基，其活性的最适ph值范围为57，有一定耐热性，其活性可以被有机酸、硫化物、金属离子螯合剂、酚类底物类似物质所抑制 。pod在h2o2存在条件下能迅速氧化多酚物质，可与ppo协同作用引起苹果、梨、菠萝等果蔬产品发生褐变。2.1.2.1多酚氧化酶多酚氧化酶的系统命名是邻二酚：氧 氧化还原酶，广泛分布于自然界。多酚氧化酶在植物细胞中的分布和活性取决于品种和年龄，而对于水果和蔬菜来说，还取决于它们的成熟度；即使对于同一种果蔬的不同部位，也可能存在差异。姜绍通等实验证明甘薯的表皮组织中多酚氧化酶的活性比心部的强，大约为2.17 倍。多酚氧化酶是一种含铜的酶，必需以氧为受氢体，是一种末端氧化酶。人们普遍认为多酚氧化酶是两种酶的复合体；（1）酚羟化酶，又叫甲酚酶（cresolase）催化一元酚羟基化反应，生成相应的邻 二羟基化合物。（2 ）多元酚氧化酶，又叫儿茶酚酶（catecholase），催化邻二酚氧化，生成邻 醌。 以上两类反应都需要有分子氧的参加。 多酚氧化酶催化氧化反应的最初产物邻苯醌将继续变化：1. 相互作用生成高分子聚合物；2. 与氨基酸或蛋白质作用生成高分子络合物；3. 氧化那些氧化 还原电位较低的化合物。其中反应1 和2导致褐色素的生成，褐色素的分子量越高，颜色则越暗，3的产物是无色的，但醌类本身又被还原为二酚物质，又成为多酚氧化酶的底物，如此不断被多酚氧化酶所利用，直到酶反应失活或氧化程度低的物质被全部利用。因此，酶促褐变实际上是多酚氧化酶间接作用的结果。2.1.2.2多酚氧化酶的底物 在果蔬中，多酚氧化酶最重要的天然底物是儿茶素（catechins ）、3,4二羟基肉桂酸酯、3,4二羟基苯丙氨酸和酪氨酸等。一元酚和二元酚中取代基的位置是决定酚类化合物能否被多酚氧化酶作用的一个重要因素。多酚氧化酶只能催化在对位上有一个大于ch2 取代基的一元酚羟基化。它氧化对位取代的3,4二羟基酚的速度高于2.3 二羟基苯甲酸。多酚氧化酶的底物不仅取决于果蔬的种类，而且从同一种果蔬的不同品种分离得到的多酚氧化酶也具有不同的底物特异性，甚至存在于同一种果蔬的不同部位的酶液具有不同的底物特异性。不同来源的多酚氧化酶对于同一种底物的亲和力在很大的范围内变动。同空间因子相关的酶蛋白质结构上的差异至少是导致它们对底物亲和力差别的部分原因。2.1.2.3过氧化物酶（pod）pod是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶之一，它和超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）都是植物体内存在的能够清除自由基的细胞膜保护酶。逆境条件破坏了自由基代谢的平衡，引起膜脂过氧化，pod与sod、cat相互协调配合，清除过剩的自由基,使体内自由基维持在正常的动态水平。pod、sod、cat活性的上升或下降是植物抵抗逆境的一种生理反应。申琳等20的研究表明，机械损伤破坏了自由基代谢的平衡而使果实的pod、sod、cat等活性升高。也有人认为pod是另一种导致果蔬褐变的关键酶，在h2o2存在下，pod参与催化酚类、类黄酮的氧化和聚合导致组织褐变。许宙7等的研究表明，新高梨鲜切处理后的褐变度与pod活性呈线性正相关。2.1.3 氧气氧是果蔬酶促褐变的另一个主要因素。氧气是生物生命活动的主要参加物质，也是生命活动不可缺少的。正常的果实是完整的有机体，具有天然氧的屏障系统，植物组织通过表皮、气孔、皮孔、细胞间隙等气体交换系统完成植物生命过程的氧气需要，多余的氧气被排斥在组织以外，使组织与氧隔绝，组织不褐变。氧气浓度一定时，二氧化碳浓度与果肉褐变呈正相关，说明高二氧化碳可以加重果肉组织的伤害；但相同二氧化碳浓度下，果实褐变氧气浓度影响不大，这又说明植物组织具有很好的保护系统，避免高氧对组织的伤害，空气中的氧气不能直接与酚类物质在ppo的作用下发生褐变，这是因为酚类物质分布于液泡中，而ppo 则位于质体中，ppo与底物不能相互接触， 阻止了正常组织酶促褐变的发生。代谢中的活性氧才是酶促褐变的主要需氧条件。在水果蔬菜贮存、 加工过程中， 由于破碎、 压榨等使果蔬的膜系统破坏，打破了多酚与酶的区域化分布，才导致褐变发生。2.2酶促褐变的机理在果蔬加工过程中，完整细胞中酚类化合物和醌类化合物之间的动态平衡被破坏，由于空气中氧的侵入和原果蔬中多酚氧化酶的催化作用，多酚类物质被氧化成邻醌，然后，在酚羟基酶作用下进行二次羟基化作用，生成三羟基化合物，邻醌具有较强的氧化能力，可将三羟基化合物氧化成羟基醌，羟基醌进一步聚合由红色变为褐色，最后变成黑褐色的黑色素物质1。国内外研究者对果蔬酶促褐变的研究，曾先后提出过酚-酶区域分布假说、自由基伤害假说、保护酶系统假说等主张。其中，酚-酶区域化分布假说是目前大部分国内外学者都认同的酶促褐变反应机制。酚-酶区域分布假说认为，质膜是活细胞与环境之间的界面和屏障，能有效保证膜内外物质交换有效的进行。在正常发育的植物组织中，由于多酚类物质分布在细胞液泡内，而ppo分布在各种质体或细胞质内，因此即使它们与氧同时存在也不会发生褐变。一旦细胞壁和细胞膜的完整性被破坏，酶与ppo接触，在氧的参与下，使酚类物质氧化成醌并进行一系列的脱水聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变3,4。切割加工可使细胞中酚与多酚氧化酶的区域化分布状态遭到破坏，从而引起褐变。切割加工也能引起组织合成酚类化合物，增强鲜切组织的褐变敏感性，同时也增强多酚氧化酶活性及可溶性，加速褐变反应的发生。如鲜切莲藕气凋贮藏期间绿原酸含量也会增加12，番薯在切割后三周内多酚氧化酶活性及总酚含量迅速上升13。2.2.1酚、酶的区域分布假说质膜是活细胞与环境之间的界面和屏障，能有效保证膜内外物质交换有效的进行。在正常发育的植物组织中，由于多酚类物质分布在细胞液泡内，而ppo分布在各种质体或细胞质内，因此即使它们与氧同时存在也不会发生褐变。一旦细胞壁和细胞膜的完整性被破坏，酶与ppo接触，在氧的参与下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变2。2.2.2自由基伤害假说自由基袭击生物大分子和膜脂，会导致膜脂过氧化加剧，膜系统结构和功能的破坏，膜透性增大，进而导致代谢障碍和膜系统的破坏和解体。正常情况下，由于机体内存在防御系统，故自由基代谢保持平衡。但在干旱、高盐分、 so2、o3、低温或水分亏缺时，由于自由基产生过多，此时活性氧的产生和清除平衡体系被打破，会导致植物细胞受到伤害，从而引起褐变的发生。2.2.3保护酶系统假说通常情况下，植物组织中有较高的还原势，正常的氧化还原代谢平衡使氧化形成的醌类物质通过还原氧化或转化而未聚和。保护酶系统包括两类物质:一是氧化酶系统，主要有超氧化歧化酶（sod）、过氧化物酶（pod）、过氧化氢酶（cat）、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)等，它们可以清除自由基、活性氧，以防止其对细胞膜的攻击，防止膜脂过氧化；二是抗氧化酶系统，主要有谷胱甘肽还原酶（gsh）、抗坏血酸（asa）、维生素e（ve），类胡萝卜素(car)、细胞色素f（cytf）、氢醌和含硒化合物等，它们能清除自由基和活性氧，也可以作为抗氧化剂，对酚类物质的氧化起抑制作用。在逆境下，超氧化物歧化酶（sod）、过氧化物酶（pod）、过氧化氢酶（cat）三者作用失调，导致h2o2积累，从而引起褐变的发生3。第三章 果蔬酶促褐变的控制技术研究酶促褐变发生必须同时具有多酚类物质、多酚氧化酶和氧气存在，控制其中一项内容就可防止酶促褐变发生。影响酶促褐变的主要因素包括温度、ph值、氧以及抑制剂。酶促褐变抑制规则按如下所小：（1）抑制或降低多酚氧化酶活性；（2）去除或隔离底物；( 3)去除氧；(4)除掉反应中间产物。目前，关于酶促褐变抑制的研究很多，但实际应用的却很少。3.1物理方法3.1.1超滤goodwin等人在1991 年已经开始研究使用超滤的方法代替亚硫酸盐处理，以控制酶促褐变。通过超滤将大分子的多酚氧化酶除去，留下低分子量的多酚类物质，从而达到抑制褐变的效果。3.1.2加热和漂烫多酚氧化酶对热不稳定，采用瞬时高温处理食品原料，使多酚氧化酶及其它的酶类全部失活, 其关键是要在最短的时间内使酶钝化，达到控制酶促褐变的目的。一般来说，在7595之间热处理57s, 可使大部分酶失活。热处理使酶变性的同时 ，也会导致食品原料质地软化，风味降低，而且易被微生物污染， 如马铃薯微波处理便会发生上述现象 。加热和超声波处理相结合在某种程度上能降低加热强度，有利于产品品质的保持3.1.3驱除氧气氧气的存在是酶促褐变产生的一个很重要的因素，因此排除氧气是阻止酶促褐变的重要环节。采用沸水烫漂或抽真空的方法可去除果蔬自身的溶解氧，苹果、梨等果肉组织间隙中含气体较多的水果最适宜采用抽真空的方法。一般在700mmhg真空度下保持515min突然破除真空，即可将汤汁强行渗入组织内部而驱出细胞间隙中的气体。也可利用抗坏血酸形成无氧条件，即采用高浓度的抗坏血酸溶液浸泡，形成阻氧扩散层，以防止褐变的发生。donglin zhang等人的研究表明，荔枝在0.1的杀虫剂中浸泡后，用1.02.0的壳聚糖水溶液处理，可在水果表面形成壳聚糖包衣，从而作为一层保护膜减少水果与氧气的接触而抑制褐变。此外，蔗糖溶液也可将介质中的部分氧气排除，在一定程度上抑制酶3.1.4可食性涂膜该法也具有一定的气调作用，对果蔬的酶促褐变有很好的抑制作用。一方面，利用可食性膜对氧气的通透性使果蔬表面的氧气浓度维持在较低水平，不但抑制了褐变也降低了果蔬的呼吸作用与乙烯的产生，有利于贮藏；另一方面，在成膜剂中加入抗氧化剂、抗褐变剂可以降低果蔬的氧化变质与变色。可用于涂膜的可食性材料较多，通常多为蛋白质、油脂和多糖等生物材料。3.1.5冷藏酶催化反应速率在很大程度上受到温度的影响，降低温度可以降低该催化反应的反应速率，从而延缓褐变的产生。另一方面，在低温条件下，反应物动能降低，可以有效减缓组织细胞新陈代谢的速率，延迟组织代谢分解，延长果蔬的保鲜期。冷藏处理通常可以通过流动空气、冷冻水、冰或真空来实现。3.1.6电场处理这种处理方法也属于非加热处理，它可以抑制果蔬中多酚氧化酶活性。如苹果粗酶提取液经电场处理后，多酚氧化酶活性得到抑制。电场强度愈高，酶活性抑制的程度就愈高。3.1.7加压处理加热或漂烫容易造成营养成分损失，口感和风味改变，有些品种还会引起非酶促褐变的发生，加压处理可以有效解决加热或漂烫产生的弊病。加压是一种非热处理，如苹果和胡萝卜经处理后，加压至800900mpa以上能完全抑制过氧化物酶和多酚氧化酶 。结构分析结果证明，加压处理可以使酶分子发生聚合，导致酶的活性降低甚至丧失。3.1.8气调包装气调包装能有效抑制果蔬产品的呼吸，减少水分的流失，延缓产品变质，对其褐变也起到抑制作用。高氧的气调包装（map）对酶促褐变的抑制可能是由于引诱底物而对多酚氧化酶抑制或者是连续形成的高浓度无色醌类化合物对多酚氧化酶的反馈抑制的结果 。不同果实和蔬菜，其最适于包装的气体构成有一定差异，需要对每一种产品进行深入试验，找出最佳o2 和的配比。gunes3o2和 9co2等人采用气调包装马铃薯能够很好地控制酶促褐变。y.m.jiang等人的实验研究表明，将鲜切的荔枝储藏温度为1,湿度为90的条件下，调节空气含量为含o235含co235，可以很好地抑制酶促褐变，保持蔬菜水果的质量。3.2化学方法果蔬的酶促褐变主要是由于多酚氧化酶催化酚类物质氧化而造成的。因此，可以通过化学的方法抑制多酚氧化酶的活性改变底物或产物，从而达到抑制褐变的目的。3.2.1无机盐处理使用一些简单的无机盐处理果蔬也可达到较好的抑制酶促褐变的效果。例如高浓度的钠盐溶液可使酶蛋白质发生“盐析”，从而抑制了多酚氧化酶的活性。赵瑛的实验结果表明：钠盐具有控制果品组织褐变的作用，其有效浓度范围为1016g/kg 。也可以添加钙离子，使钙离子与细胞壁上的果胶酸作用，形成果胶酸钙增加组织的硬度，从而阻止液泡中的组织外渗到细胞质中与酶类接触降低褐变程度。如0.2cacl2 可以抑制苹果切片的褐变；1cacl2可以抑制猕猴桃切片、梨切片、苹果切片的褐变。近年来的研究表明，钙在延缓果蔬的衰老和控制生理病害方面有较好的效果。此外，周志才等人实验还证实，2的钾明矾+0.02硫酸钠对牛蒡多酚氧化酶的活性具有很好的抑制效果。3.2.2改变底物或产物3.2.2.1基质络合法这种方法是从改变基质的结构入手，如基质甲基化法。其抑制机制是使果蔬组织内的酚类甲基化，从而生成难于接受酚酶催化作用的新型结构物质。这种方法对食品的色泽、风味、组织状态几乎无影响，所以这种方法的综合效果最好。但是基质甲基化方法所使用的抗褐变剂s腺苷蛋氨酸比较昂贵。根据甲基化法得到的启示，选用铝化物或锌化物作为抗褐变剂，以基质络合法控制果蔬的酶褐变。实验表明，0.25(al)oh3在中性或偏酸性条件下和0.100.25zncl2在酸性条件下的多相体系都可以有效防止马铃薯酶褐变的发生。3.2.2.2添加醌类偶联剂添加适量的醌类偶联剂与酶反应产物相结合形成无色物质，从而抑制褐变的产生。例如曲酸就是通过干扰氧气的摄取及还原醌至二酚来防止色素的形成。有实验表明，用1mm的曲酸处理茄子，可抑制酶活性的35。但是这种化合物能否被作为一种可应用的褐变抑制剂尚不清楚，特别是它的致突变性质。麦芽醇与曲酸在分子结构上相似，也可与多酚氧化酶作用产生醌类反应，但不能抑制酶本身。含巯基氨基酸（如半胱氨酸）通过与醌类物质反应形成无色稳定化合物，也能阻止黑色素的形成。半胱氨酸浓度为50mg/kg时，几乎能完全抑制草莓中多酚氧化酶的活性。kahn对蘑菇和香蕉的研究发现，半胱氨酸还可作为还原剂抑制非酶促褐变的发生，表现为延迟褐变及降低褐变速度。此外，实验表明，含硫氨基酸中的谷胱甘肽和n乙酰半胱氨酸对苹果也有很好的抑制效果。3.2.3抑制多酚氧化酶的活性3.2.3.1酸（有机酸、无机酸）处理引起酶促褐变最适宜的ph 范围在47 之间,降低介质中的ph 值，可以控制酚酶的活性，抑制其催化作用。一般通过添加酸控制ph 在3 以下，酚酶的活性就几乎可以完全丧失。常用的酸有柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸及其它有机酸混合溶液。姜绍通等人实验表明，0.010.05的柠檬酸处理甘薯，其淀粉白度可达85 左右。若它能与其他抗褐变剂偶联使用效果会更好，如 0.1柠檬酸+0.25 抗坏血酸对切分土豆、苹果等有更佳的抑制褐变作用；yueming jiang等人研究表明，速冻荔枝用1 的盐酸处理，可以有效抑制多酚氧化酶的活性，并且在荔枝的果皮组织中保持高浓度的花青素。s.m.son等人的研究表明，羧酸中的草酸和草酰乙酸也可有效的抑制苹果的褐变。采用硼酸处理时，需使用高浓度的硼酸才能使酶反应体系的ph发生较大改变，达到4.2 甚至更低。如在马铃薯加工中，硼酸浓度需大于2000mg/l时，才对酶活性有明显抑制作用 。这是因为在低浓度下，用硼酸处理的同时也提高了离子强度，使体系的ph值 变化不大，比较稳定。而在接近多酚氧化酶的最适ph6.0时，反而对酶有一定的激活作用。3.2.3.2添加还原剂或抗氧化剂a.二氧化硫及亚硫酸盐处理二氧化硫或亚硫酸盐是预防果蔬酶促褐变最常用的物质。它们既可直接作用于酶本身，降低对单酚和二酚类的催化反应活性，又可与第一步反应生成的醌类物质发生不可逆的结合形成无色物质。同时，亚硫酸钠有漂白和抑制微生物生长的作用。一般只要有游离的二氧化硫存在就能起作用，用量为0.7mg/kg时( 以二氧化硫计) 还可同时保持抗坏血酸不被氧化。虽然二氧化硫和亚硫酸盐是高效酶促褐变的抑制剂 ，但是亚硫酸盐用于生食或鲜售的果蔬时不具有公认安全性，已经被限制使用，所以人们正致力于研究亚硫酸盐的替代品。b.抗坏血酸及其衍生物处理抗坏血酸是近年来研究的最多的亚硫酸盐替代品，它在反应中对多酚氧化酶反应体系的作用是相当复杂的。它既作为醌的还原剂，又作为酶分子中铜离子的鏊合剂，通过oh 与多酚氧化酶的辅基cu离子鏊合。它甚至可以被多酚氧化酶直接氧化，起到竞争性抑制剂的作用。在反应开始前的一段时间内，有时反应混合物的透光率会大于100，这表明抗坏血酸不仅能够抑制多酚氧化酶的酶促褐变，而且也起漂白作用。这可能是因为它与产物醌作用，生成稳定的无色化合物从而起到漂白作用。抗坏血酸的添加量十分关键，添加量过少，不仅不能抑制褐变，反而易与氨基酸反应促进羰氨反应造成非酶褐变；添加量过多，成品在贮存期间，特别是在较高温度下，由于氧化后所形成的酮化合物与氨化合物发生非酶促褐变反应，从而加剧成品的变色。抗坏血酸的衍生物 如异抗坏血酸、磷酸抗坏血酸、三磷酸抗坏血酸等也对褐变有很好的抑制作用。在实验性的配方中， 稳定的抗坏血酸衍生物已被用来替代抗坏血酸，如抗坏血酸2 磷酸盐能显著提高马铃薯的感官质量。3.2.3.3添加铜离子鳌合剂多酚氧化酶是以铜离子作为辅基的一种蛋白质，它能被金属鳌合物所抑制。如氰化物、氟化物、二乙基二硫氨基甲酸钠(dieca)、co、巯基苯噻唑二巯基丙醇、叠氮化物、甲基黄原酸钾等。乙二胺四乙酸(edta)及其钠盐、焦磷酸钠、多聚磷酸盐等也可以鳌合金属离子 。柠檬酸处理除了通过调节反应体系ph 值来抑制褐变外，其结构中的三个羧基还可以对多酚氧化酶中的铜离子起较强的螯合作用，达到抑制其活性的目的。从植物原料中提取的植酸具有很强的螯合能力，比edta的作用更明显，且在很宽的 ph值范围内都很稳定。黑曲霉中的铜金属硫因也可以作为抑制剂抑制多酚氧化酶的活性。这是因为金属硫因与重金属有很强的结合能力，它作为一种鏊合剂鏊合多酚氧化酶中的cu从而抑制它的活性。另一方面，它作为抑制剂作用的机制可能是因为在金属硫因蛋白质中含有巯基氨基酸，这些巯基氨基酸作为醌类偶联剂结合醌形成无色的硫酯化合物从而抑制褐变。此外，苯基硫脲、二硫氨基酸酯等也可作为铜辅基络合物抑制多酚氧化酶的活性，但由于为有毒物质 ，在生产上得不到应用。3.2.3.4添加酶的底物类似物据报道，所有的芳香类羧酸都是酶的竞争性抑制剂，肉桂酸系列比类似结构的苯甲酸系列对多酚氧化酶有较强的抑制作用。添加肉桂酸、对位香豆酸及阿魏酸等竞争性酚酸使酚酶不能再与其褐变底物结合或即使结合也不能起作用可使酶褐变得到控制。可溶性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)也是多酚氧化酶的竞争性抑制剂，但这种抑制剂可被离子净化剂所恢复。环庚三烯酚酮也是一种底物类似物，可抑制多酚氧化酶的活性。实验表明，用1mm的环庚三烯酚酮溶液处理茄子，可以抑制酶活性的91。3.2.4其他方法4己基间苯二酚（4hr）是近年来发现的并且已经被实验证实对酶促褐变 （如苹果、土豆、莴苣 ）有较好抑制作用的新型抑制剂，是一种商业防褐变剂everfresh的活性成分。它的主要特点是抑制性强，在550mg/kg极低浓度下即可达到预防褐变的目的；化学稳定性相当好，对褐变前存在的其它色素又没有漂白作用；安全性高，该物质已被证实为属于“一般公认为安全的（gras）”范畴。作为一种有效的抗氧化剂、色素稳定剂和护色剂，它已被推荐用于防治果蔬产品酶促褐变，具有良好的应用前景。3.3生物方法3.3.1微生物代谢产物 乳酸菌能产生一些低分子量的物质，如酸、醇、酮、co2、过氧化氢、双乙酰等代谢产物，具有较强的络合金属离子能力和较高的抗氧化性，能有效地抑制酶促褐变。乳酸菌产生的杀菌剂对切分果蔬的保鲜很有潜力。hurdle 技术采用天然保鲜剂 ，如乳酸菌产生的抑制剂果明显，目前这方面的研究不是很多。3.3.2基因工程基因工程有助于培育出低褐变性的马铃薯品种。通过对马铃薯多酚氧化酶基因表达进行干扰，使之不能正常翻译出多酚氧化酶。c.w.b bachen等人将一段约 2.0kb的dna 片段通过农杆菌介导转化，反向插入到马铃薯的染色体组内，通过合适的启动因子表达出反义的rna，结果使块茎中多酚氧化酶活性被抑制。块茎中的酚类物质氧化受阻，块茎表皮被擦破后，不发生通常易见的褐变。这一工作开辟了马铃薯抗褐变的新纪元，使人们通过对现有品种进行基因改良就能达到抗酶褐变的目的，并且这一措施无任何副作用。3.3.3植物提取物抑制褐变最有吸引力的方法要算是用天然的方法。如色拉酱就是利用其中的几种成分互相抑制，lozanodegonzalez等人的研究结果表明：菠萝汁对苹果切片的酶促褐变有很好的抑制作用；天然提取的食用大黄汁是鲜切果蔬的有效天然抗褐变剂，经分析其主要作用的物质是其中所含的草酸 。3.3.4酶法蛋白酶对苹果和土豆来说是有效的褐变抑制剂，这可能是由于蛋白酶使催化酶促褐变的酶系失活所致 。分解蛋白质的酶有很多，其中主要有三种植物蛋白酶：无花果蛋白酶（ficin ）、木瓜蛋白酶（papain ）和菠萝蛋白酶（bromelain ）被证实抑制酶促褐变很有效，这三种植物蛋白酶都是具有广泛特异的巯基酶。taoukis 等人的研究结果表明：4 时无花果蛋白酶对去皮土豆褐变的抑制与亚硫酸盐效果相当；4和24 时，木瓜蛋白酶对切分苹果酶促褐变的抑制与亚硫酸盐同样有较好的效果。展望目前人们对酶促褐变机理有了更深入的认识，ppo已得到纯化，其相关的生物学特性也有大量研究，并且找到了多种控制鲜切果蔬褐变的措施。但酶促褐变的机理尚末完全明确，褐变控制措施的效果并不十分理想。由于鲜切果蔬是活的有机体，其褐变的发生与材料的生理状态有不可分割的联系。因此，揭示褐变深层次的调控机制，将会极大地丰富褐变理论，同时对探索褐变的有效控制技术具有良好的指导意义。控制果蔬的酶促褐变， 提高果蔬的营养价值和外观品质是人们长期关注的问题。化学抑制和物理控制手段虽然在一定程度上控制ppo 活性， 但都存在一定的局限性 ，利用反义rna技术和转基因技术修饰和控制转基因植株中多酚氧化酶基因的表达成为多酚氧化酶控制活性的新手段。 此外 ，对ppo的深入研究可望从分子水平上搞清酶促褐变的机理 ，为控制酶促褐变提供新方法。致 谢本论文是在王彩霞老师的悉心指导下完成的。从课题的选择到研究方向的明确，从试验方案的确定到论文的撰写，再到论文稿子的修改，都得到了王彩霞教授的专业指导。在此，瑾向导师致以衷心的感谢和诚挚的敬意！同时，在我的毕业论文的完成过程中，吕有军老师、杨利玲老师、付兴周老师、试验室的路志芳老师，都给过我热心的帮助和有关问题的解答与建议，也向诸位老师表示衷心的感谢！还要感谢图书馆的工作人员，在我毕业论文成文期间以及大学四年的学习生活中维持了良好的馆内环境和充足畅通的资源搜索途径。自从迈进安阳工学院的大门，这里的老师们，特别是生物院和教导过我的所有老师们，给了我各方面的知识，并在生活上给予诸多的关心和鼓励，使我在这片纯净的沃土上逐渐成长，在此对各位老师表示最衷心的感谢，也对培养我四年的母校致以最诚挚的敬意！忘不了朝夕相处、相互帮助的室友，忘不了实验室中共同“作战”的朋友们，忘不了匆忙之中相视而笑的昔日同窗们。他们不仅仅在毕业论文的完成期间给过我实质上的援助和精神上的支持，而且在大学四年里给了我真挚的情谊和无尽的回忆！在此我要特别提出感谢我的父母，是他们的物质支持和精神鼓励换来了我这大学四年健康、无虑的成长。毕业这件事不仅关乎我自己，更加关乎生我养我的父母，他们虽然没有来这里待过一天，但是我得到的所有的成绩和荣誉里都有他们的汗水和泪水！谢谢你们，我亲爱的父亲、母亲！参考文献1刘进杰.国内外鲜切果蔬保鲜技术研究现状j.安徽农业科学,2007,35(16):4931-4934. 2陈言楷,陆东和.切割果蔬保鲜研究现状及发展趋势j.福