细胞生物学-细胞调亡.ppt

一、凋亡概念的形成： 1965年澳大利亚科学家Kerr发现，结扎鼠门静脉后， 电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞,这些细胞 体积收缩、染色质凝集从其周围的组织中脱落并被吞噬,机 体无炎症反应。1972年Kerr提出了细胞凋亡的概念，宣告 了对细胞凋亡的真正探索的开始,在此之前，关于胚胎发育 生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概 念的提出奠定了基础。 细胞凋亡 定义:是指为维持内环境稳定, 由基因控制的细胞自主的 有序的结束生命的过程。 细胞凋亡(Apoptosis) 蝌蚪向蛙发育的变态反应 发育过程中手和足的成形过程 发育中神经细胞数量的调节 诱导细胞调亡的因子 物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），较 温和的温度刺激（如热激，冷激）等 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白 质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（ TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等 。 细胞凋亡形态变化特征 （1）凋亡的起始；微绒毛的 消失，细胞间接触的消失，与 周围的细胞脱离，染色质固缩 . 沿着核膜分布。 （2）凋亡小体的形成。核膜 核仁破碎，核染色质断裂为大 小不等的片段，与某些细胞器 如线粒体一起聚集，为反折的 细胞膜所包围。 （3）凋亡小体逐渐被周围专 职或非专职吞噬细胞吞噬。 A、Normal cell B、Apoptosis: Apoptotic bodies 胸腺细胞 正常凋亡 是细细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质质 ）、物理因素（如热热、辐辐射）和生物因素（如病原体 ）等环环境因素的伤伤害，引起细细胞死亡的现现象。 细胞坏死 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。 细胞凋亡与 坏死(necrosis) ApoptosisNecrosis Death by apoptosis is a neat, orderly process 细胞凋亡与坏死的区别 胞浆内Ca2+浓度升高。 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180200bp 特征性的DNA ladders 。 细胞凋亡的生化特征 Apoptosis induced by Cyto C Lane 10 h 21 h 32 h 43 h 54 h 6Control 7Marker 凋亡细胞 tTG（组织转谷氨酰胺酶 ）积累并达到较高水平 形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 细胞凋亡的检测 Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm 400） 电镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩，核内染色质高 度盘绕，出现许多空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解 为碎块，产生凋亡小体。 磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期 ，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露 在细胞外环境中。Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂 结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS。将 Annexin-V进行荧光素（FITC）或biotin标记，以 标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用荧光显微 镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生 。 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine PS）外翻分析 （Annexin V法） Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV DNA片段化分析 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷 酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。 TUNEL测定法是terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling的缩写，意 指末端脱氧核苷酸移换酶介导的dUTP缺口末端标记 测定法。 这一方法能对DNA分子中3-OH断裂缺口进行 原位标记。凋亡细胞的核DNA中产生的3-OH末端， 可藉助一种可观测的标记物，如荧光素进行原位标记 ，并用荧光显微镜进行观察。 TUNEL测定法: 即DNA断裂的原位末端标记法 细胞凋亡的基因调控机制最先是从线虫（ c.elegans）研究开始的(MIT: Robert Horrid , 1986)。 线虫是一种细胞定数细胞，在个体发育中，成体的1090 个体细胞中，有131个注定是要自然凋亡。 三、细胞凋亡的分子机制 C elegans: a mm, transparent body only a few cell types, from zygote to mature adult only in 3.5days. 1、与PCD有关的基因，负责PCD控制：ced-3、ced-4和ced-9。 CED-3是一个蛋白酶，激活的CED-3 可以水解靶蛋白从而使细胞死亡，是 细胞杀手； Ced-4对ced-3引起的体细胞凋亡起促进作用。ced-9可抵消ced -3的作用，防止细胞被杀死，在ced-3和ced-4的杀死细胞作用中起负调控。 2、与PCD过程吞噬作用有关：ced-1、ced-2、ced-5-8 和 ced-10 3、核酸酶基因（nuc-1）, 控制DNA降解，但非PCD所必须。 4、影响特异细胞类型PCD的基因：ces-1、ces-2和her-1. 线虫体细胞凋亡研究：PCD相关基因15个，分为四组 保守性高，在哺乳动物中有相应同源物： Ced-3=ICE, Ced-4=Apaf-1, Ced-9=Bcl-2. 所有的动物细胞都有一种相类似的细胞凋亡的机制，即通过 一个蛋白酶家族的介导。 动物细胞中的凋亡效应分子CaspaseCaspase家族家族 Caspase:天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶 Why called caspase? Active site: Cysteine Cleavage site: Asparatic acid Cysteine Asparatic acid specific protease Asp-Xxx 起始者 Caspase 执行者 Caspase 有两类caspase，一类是起始者，如caspase-8、9 ,10 ;另一类是执行者，如caspase-8可依次激活caspase-3 、6、7。 Caspase家族的分类 所有的caspase都以非活性的形式存在 Procaspases Caspases酶原包含三个结构域： NH2末端结构域、约20KD的大亚基和约10KD的小亚基。 Caspase家族的级联反应 在诱导细胞凋亡信号的作用下通过自我切割而激活。激活后又可激活 家族中的其他成员，引起蛋白质酶解的级联反应。最后，被激活的蛋白酶 切割了细胞与细胞凋亡相关的关键蛋白，如核纤层蛋白，从而引起凋亡。 （1）蛋白激酶：如粘着斑激酶(FAK)、PKC以及Raf1。 （2）核纤层蛋白：导致核纤层解体、核被膜浓缩。 （3）细胞结构蛋白：如中间纤维、肌动蛋白，导致细胞 形态的改变。 （4）与DNA修复相关的酶类:使合成的DNA难以保证正 确，导致细胞调亡。 （5）caspase激活的DNase抑制蛋白：将内切核酸酶 DNase的抑制蛋白水解，导致这种酶被激活，将DNA切 割成片段。 能够被caspase切割的靶蛋白包括以下几类： （一）细胞凋亡相关基因和蛋白 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原 癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有Fas、 ICE、Apaf-1、 Bcl-2等。 1、fas 属TNF受体家族。Fas 基因编码产物为分子量45KD的 跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T 和B 淋巴细胞，巨噬细 胞以及卵巢细胞等。Fas 蛋白与Fas 配体结合后，会激活 caspase，导致靶细胞走向凋亡。 2、ICE：白介素-1 转换酶（Interleukin-1 -converting enzyme）基因，该酶能将白介素前体切割为活性分子， 是一 类Caspase，能选择性降解蛋白质。ICE蛋白酶参与Fas诱导 的细胞凋亡，与线虫细胞凋亡基因ced-3同源。 3、Apaf-1 ：(apoptotic protease activating factor-1)，是 ced-4在哺乳动物中的同源体为Apaf-1 ，能激活Caspase3 ， 这一过程需要细胞色素c的参与。 基因产物功 能 BCL-2 凋亡抑制剂，可和 Bax及Bak结合 BCL-x 其L型抑制凋亡，S型促进凋亡，与 Bax及Bak结合 BCL-w 凋亡抑制剂 Bax 凋亡促进剂，可与 BCL-2，BCL-XL，EIB19K结合 Bak 凋亡促进剂，亦可作抑制剂，可与BCL-2，BCL-X和 E1B19K结合 MCL-1 凋亡抑制剂 Bad 凋亡促进剂，与 BCL-2和BCL-XL结合 Ced-9 线虫中的凋亡抑制剂，BCL-2同源物 E1B19K 腺病毒凋亡抑制剂，与 Bax和Bak结合 名称来源于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma，bcl -2)主要存在于线粒体外膜上，是ced-9在哺乳类中的同源物。 是一个不断扩增的多基因家族，其在哺乳类中的家族成员有： 4、bcl-2： 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面 信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体 部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径 参与死亡受体信号转导的接头蛋白（死亡结构域蛋白 death domain protein）： TRADD：TNF 受体相关死亡结构域蛋白 FADD （Fas-associated death domain） ：Fas 相关 死亡结构域蛋白 。 TNF激发细胞的程序性死亡的过程 细胞内信号对程序性细胞死亡的激发 细胞内源信号：DNA损伤、细胞质中Ca2+浓度过高、极 度氧胁迫等也会激发细胞的程序性死亡，这些信号激活Bcl- 2家族中的促凋亡前体蛋白Bad或Bax,使它们从胞质溶胶转 移到线粒体外膜，导致外膜的通透性改变，使细胞色素c全 部从线粒体释放到胞质溶胶，与Apf-1(凋亡蛋白酶激活因子 )、前体caspase-9等形成“凋亡体”（Apoptosome），将 Caspase 9的激