间接红细胞凝集试验诊断血吸虫病.ppt

间接红细胞凝集试验诊断血吸虫病 间接红细胞凝集试验 （Indirect haemagglutination test, IHA） n以红细胞为载体 n吸附预先制备的特异性抗原或抗体作为试剂 n检测标本中的相应抗体或抗原 n血清学方法 n特点：抗原与其抗体之间的特异性反应 红细胞凝集现象 n国外最早于1955年应用于检测马抗血清 n国内陶义训等（1958）首先应用于诊断 日本血吸虫病 n杨赞元等（1976）应用冰冻干燥方法 制备试剂 一、基本概念 （一）凝集反应 是指细菌、细胞等颗粒性抗原加入相应抗体 ，并在适量电解质存在的条件下，两者特异 性结合且进一步凝聚成肉眼可见的小块。 凝集反应分为直接凝集和间接凝集反应。 （二）间接红细胞凝集试验 原 理 n日本血吸虫可溶性虫卵抗原 载体颗粒 n绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞 n致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染， 只能使用23天 n致敏前将红细胞醛化，可长期保存而不溶血 n常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛 （三）间接血凝的类型 nIHA：用抗原致敏红细胞检测标本中抗体 n反向间接血凝试验：用特异性抗体致敏红 细胞检测标本中的相应抗原 n间接血凝抑制试验 n反向间接血凝抑制试验 （正向）间接凝集反应 反向间接凝集反应 间接凝集抑制反应 （一）血吸虫虫卵抗原制备 分离虫卵 脱水、脱酯干燥 研磨成细粉 冻融 超声粉碎 普通离心 高速离心。 经离心后的上清液，即为虫卵抗原原液，保存于 -20中备用。 二、冻干致敏红细胞的制备 理想抗原 敏感性高，特异性强，能区别不同感染度， 能区别现在感染还是过去感染，价廉。 但目前还没有，今后可能依靠杂交瘤技术、 DNA技术而获得理想的抗原。 取人“O”型血红细胞3份（不同个体） 混合 ，用生理盐水洗涤 。置冰浴内，将戊 二醛溶液慢慢滴入红细胞悬液中，边加边 摇，醛化1h。用1/10000的柳硫汞蒸馏水配 成10%的红细胞悬液，置于4备用。 （二）红细胞醛化 醛化红细胞优点 n克服了个体差异，保证实验重复性 n延长红细胞的保存时间，在4可保存1年 n避免操作过程中因振荡、低渗、冻融使红细 胞破裂、溶血 取1/10000鞣酸溶液与等量2.5%红细胞悬液混 匀，置于37 中15min，并不断摇动。洗涤 ，去除多余的鞣酸。 （三）红细胞鞣化 鞣化红细胞的优点 鞣化后红细胞易吸附蛋白抗原。 取虫卵抗原原液1:100稀释，与2.5%的鞣化红 细胞等量混合，置于37水浴中30min，并不断摇 动，然后离心，洗涤，去除多余抗原。 用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56灭活） 的pH7.2PBS保护液，配成10%浓度的致敏红细胞 悬液。 致敏效果与抗原的活性及纯度有关。 （四）红细胞致敏 将上述致敏红细胞悬液摇匀，分装于2ml安瓿 内。每支0.4ml，立即放入-40冰箱冰冻，待全部 分装完毕后，移入冰冻干燥机内，冰冻干燥约24h ，干燥后封口，保存于4中备用。 冰冻干燥具有高科技含量不是单纯干燥，在冰 冻状态下使水分子升华，不使红细胞破裂，不影响 抗原活性。 （五）致敏红细胞的冰冻干燥 三、操作步骤 （一）取生理盐水2ml，加入装有冰冻干 燥红细胞的安瓿中，配成2.0%的红细胞 悬液，摇匀。 （二）在“V”型微量血凝反应板的第1孔 中加生理盐水100l, 第2、3孔中各加25l 。 （三）第1孔中加待检血清25l，混匀后吸出 25l加于第2孔中，在第2孔中混匀后，吸出 25l加于第3孔中，混匀后弃去25l。此时第 1、2、3孔中的血清稀释度依次为1:5 、1:10 、1:20。 （四）在第2、第3孔中各加致敏红细胞悬液 25l，将反应板放在振荡器上振荡1min，室 温下静置45min，观察反应结果。 四、反应标准 （一）阴性反应：红细胞全部下沉在 凹底部，形成紧密的圆点，周围整齐 清晰。 （二）阳性反应：待检者血清以1:10 稀释度出现凝集反应为阳性起点 （三）反应强度 “-”：红细胞全部下沉在凹底部，形成紧密的 圆点，周围整齐清晰 “+”：多数红细胞下沉在凹底部形成圆点，周 围可见少量凝集红细胞 “+”：凹底部可见明显的红点，凝集红细胞 在底部形成小薄层 “+”：凹底部可见很弱的红点，红细胞呈 疏松的颗粒凝集 “+”：红细胞呈明显的颗粒凝集，均匀 散布于凹底部周围形成薄层，有时呈皱褶状 效价(滴度)：发生凝集现象最高的血清稀释度。 五、影响因素及注意事 （一）试剂：保存、对照、效价、摇匀。 （二）反应板：“V”型，底角应为90。反 复冲洗。 （三）毛细吸管：校正、垂直。 （四）血清样本：新鲜为宜，保存在冰盒 内。溶血样本将影响测定结果的准确性。 （五）生理盐水：用于稀释IHA试剂、阳 参、阴参、血清样本的生理盐水必须保持 无菌。 （六）判断反应结果：在判断反应结果时 应在反应板下面衬一张白纸，使反应结果 更加清晰。先观察空白对照、阴参、阳参 ，再观察样本。 六、评价 IHA的优点： 敏感性高，阳性符合率在90%以上，对粪检阳 性者可高达95%，假阳性率一般不超过4%。 操作方便，用血量少，便于现场使用。 试剂生产方便，成本低，符合国情。 IHA的缺点： 特异性欠强、与其它吸虫有较高的交叉反应。 交叉反应主要在肺吸虫感染，可达