大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑组织PAR1表达与炎症反应的关系.doc

DOC格式论文，方便您的复制修改删减大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑组织PAR1表达与炎症反应的关系（作者:_单位: _邮编: _） 作者：周青珍， 王华梅， 吴家幂【摘要】 目的:研究脑缺血再灌注（CIR）后脑组织中蛋白酶激活受体1(PAR1）的表达及其与炎症反应的关系。 方法:40只雄性SD大鼠线栓法建立大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，再灌注后于3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d取脑，免疫组化法和脑组织匀浆法检测PAR1、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。 结果:缺血再灌注后脑组织PAR1表达增加（P0.01），MDA含量增多（P0.01），SOD活性降低（P0.01）；PAR1表达与MDA含量正相关（r1=0.844,P0.05），与SOD含量负相关（r2=-0.901,P0.01）。 结论:CIR后PAR1表达增多可加重脑组织炎性反应。 【关键词】 大脑中动脉;栓塞；蛋白酶激活受体1 Abstract: Objective To investigate the correlation between proteaseactivated receptor1(PAR1) expression and inflammatory reaction of brain tissue after cerebral ischemia reperfusion(CIR).Methods Fourty SD rats were randomly divided into eight groups:sham group,CIR3 h,CIR6 h,CIR12 h,CIR1 d,CIR2 d, CIR3 d,and CIR7 d group(n=5).To establish middle cerebral artery occlusion(MCAO) model with Longa methods.At the indicated timepoint,the rat was sacrificed and its brain was removed.PAR1 was detected with immunohistochemistry,SOD and MDA contents in brain homogenate were measured.Results Compared with sham group,PAR1 expression was increased obviously（P0.01）.Contents of MDA were increased with the time of CIR prolonged（P0.01）,and there was positive correlation between PAR1 expression and MDA content（r1=0.844,P0.05）,but SOD activity was decreased（P0.01）,and negatively correlated with PAR1 expression（r2=-0.901,P0.01）. Conclusion Increased PAR1 expression may aggravate inflammatory reaction of brain tissue in rats after CIR with MCAO. Key words: Middle cerebral artery;Occlusion;Proteaseactivated receptor1 近年来研究发现中性粒细胞的聚集、黏附和浸润，以及炎性因子的大量产生是缺血再灌注损伤的重要因素2。脑缺血再灌注（cerebral ischemia reperfusion,CIR）后中性粒细胞在凝血酶作用下趋化于缺血组织周围，通过激活蛋白酶激活受体-1（proteaseactivated receptor1,PAR1）导致细胞内Ca2+升高，刺激小胶质细胞的活化和增生3，促进炎症因子表达，活化的白细胞释放自由基，引起脑缺血后脑组织损害。本实验通过建立大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,了解CIR后脑组织中PAR1表达与代表自由基水平的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）之间的相关性， 以探讨PAR1在CIR后脑组织炎症反应中的作用。 1 材料和方法 1.1 实验动物与分组 健康雄性SD大鼠40只，体重270320 g(南京青龙山实验动物养殖中心提供），随机分为8组：假手术组，缺血再灌注3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d组（n=5）。 1.2 脑缺血再灌注模型的制备 选用日本产钓鱼尼龙线，直径0.2 mm，每段长4 cm，头端烧成杵状备用。参照Zea Longa报道的线栓法1建立大鼠大脑中动脉栓塞MCAO模型。术后2 h，外拉尼龙线，使其球端回至颈外动脉残端，恢复大脑中动脉供血，实现再灌注，于上述不同时间点断头取脑；假手术组除插入尼龙线15 mm外，余步骤同手术组，术后24 h断头取脑。 1.3 免疫组化染色 在相应时间点，大鼠深度麻醉后，打开腹腔，由左心耳灌注生理盐水100 mL,再用4%甲醛内固定后断头取脑。标本置中性福尔马林中固定、包埋。按下述步骤行PAR1免疫组化染色：切片、微波修复抗原、3%过氧化氢抑制、兔血清封闭、加一抗（山羊抗小鼠多克隆抗体，美国Santa Cruz公司）、4 过夜、加生物素二抗（兔抗山羊IgG）、加SABC、DAB显色，苏木素复染。 1.4 脑组织匀浆制备及SOD、MDA含量测定 将左侧脑组织称重后置于玻璃匀浆管内,0.9%的生理盐水作为匀浆介质（是脑组织的9倍）,充分磨碎使脑组织匀浆化,离心15 min,取上清液,即为10%脑组织匀浆。SOD、MDA含量测定严格按试剂盒说明书进行。 1.5 结果分析 高倍镜下随机选取左侧海马皮质相邻而不重叠的4个视野区，用图像分析软件计算PAR1阳性表达细胞数。用SPSS 11.0软件进行方差分析，所得PAR1、SOD、MDA值用均数标准差(xs) 表示，P0.05有统计学意义。 2 结果 2.1 PAR1表达和SOD、MDA含量 与假手术组相比，CIR 3 h后 PAR1表达明显增多，3 d时达高峰（P0.01）；SOD活性显著降低（P0.01），且随时间变化延长而逐步降低，3 d时最为明显；MDA含量开始升高（P0.01），3 d达高峰(见表1)。 2.2 相关性分析 PAR1阳性表达细胞数与脑组织匀浆SOD含量呈负相关关系（r2=-0.901,P0.01），但与MDA含量呈正相关关系（r1=0.844,P0.05）（见表1）。表1 PAR1表达与SOD、MDA含量变化注：*P0.01； 3 讨论 脑缺血再灌注后，缺血以及缺血激活的内皮细胞可导致中性粒细胞聚集、黏附和浸润， 黏附的白细胞可释放大量氧自由基和蛋白水解酶4。自由基对脑组织的损害集中表现为OH-对细胞器生物膜中不饱和脂肪酸的丙烯双键进行攻击，使之结构破坏，流动性降低，通透性增加，甚至完全裂解，最终导致细胞内脂质过氧化,引起细胞凋亡。膜脂质降解产生的主要代谢产物MDA常用来反应细胞膜脂质过氧化程度，通过测量MDA的量可间接反映氧自由基水平；SOD活性代表内源性氧自由基清除活力，脑缺血继发损伤后，一系列自由基反应可直接损伤DNA、酶蛋白，从而使SOD的活性减弱或消失，SOD合成和再生减少。本实验发现，CIR后MDA含量随再灌注时间的延长进行性升高，而SOD活性随再灌注时间的延长逐渐降低，提示脑组织中有大量自由基产生，内源性氧自由基清除活力下降。 研究表明，凝血酶的细胞外效应在脑组织缺血损伤中起重要作用，其细胞外效应由凝血酶受体(thrombin recptor,TR)介导5。PAR1是TR之一，在脑组织中分布广泛，对凝血酶的介导作用最强6。脑缺血再灌注后，脑组织产生大量凝血酶，通过栓系配体模式6激活PAR1,引起PAR1表达增多，对脑细胞产生直接的毒性效应，并通过受体途径激活神经元和神经胶质细胞，使之产生并释放大量的细胞因子及毒性物质而损伤血脑屏障7。有报道8 认为：凝血酶是重要的前炎症因子，可上调肿瘤坏死因子（TNF）、细胞间粘附分子（ICAM1）、白介素1（IL1）等炎性因子表达，促进白细胞浸润及活化。CIR后，中性粒细胞在凝血酶作用下趋化于缺血组织周围，凝血酶通过激活PAR1导致细胞内Ca2+升高，刺激小胶质细胞的活化和增生3，促进炎症因子表达，活化的白细胞释放自由基，导致SOD活力降低、MDA水平升高。本研究发现，CIR后PAR1表达随再灌注时间延长也逐渐增多，3 d时达高峰；对PAR1阳性表达细胞数和MDA含量进行相关性分析，发现二者呈正相关关系；而SOD含量与PAR1阳性表达细胞数呈负相关关系，且三者达高峰时间均在CIR后3d，这与临床上脑梗死后病情危重时间点一致,说明PAR1表达增高可加重CIR后脑组织炎症反应。 Rhauhman9等研究表明，凝血酶通过激活核转录因子NFB促进许多细胞因子的表达。NFB是一种共用的核转录因子，在IL1、TNF、ICAM1等的启动子上都存在它的结合位点。CIR后PAR1表达增加，凝血酶通过PAR1激活NFB后进入细胞核结合于TNF、ICAM1、IL1等炎症因子的靶基因位点，诱导其表达，介导了炎症反应的发生。提示脑梗死后及时进行抗凝血酶治疗，有可能抑制PAR1的高表达，减少氧自由基的生成，从而减轻脑组织炎性反应和脑组织损伤。【参考文献】 1Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ.Stroke,1989,20(1):84-91.2Stoll G,Jander S,Schroeter M.Inflammation and glial responses in ischemic brain lesionsJ.Prog Neurobiol,1998,56(2):149-171.3Moller T,Hanisch UK,Ransom BR.Thrombininduced activation of cultured rodent microgliaJ.J Neurochem,2000,75(4):1 539-1 547.4吴家幂,杨 倩,袁存国.亚低温对大鼠脑缺血再灌注后炎症反应的影响J.中国神经免疫学和神经病学杂志,2003,10(2):116-118.5Coughlin SR.Thrombin signalling and proteaseactivated receptorsJ.Nature,2000,407(6 801):258-264.6Kaufmann R,Patt S,Zieger M,et al.The tworeceptor system PAR1/PAR4 mediates alphathrombininduced Ca2+(i) mobilization in human astrocytoma cellsJ.J Cancer Res Clin Oncol,2000,126（2）:91-94.7郑国庆,王小同.凝血酶受体的生物学功能及在脑损伤中的双重作用J.中国脑血管病杂志,2004,(9):426-429.8Masada T,Hua Y,Xi G,et al.Attenuation of intracerebral hemorrhage and thrombininduced brain edema by overexpression of interleu