mrna差异显示技术在肿瘤研究中的应用(1)

mRNAmRNA 差异显示技术在肿瘤研究中的应用差异显示技术在肿瘤研究中的应用 (1)(1) mRNA 差异显示技术（mRNAdifferentialdisplay）是一 种快速而有效的克隆差异性表达基因的方法。1992 年 Liang 和 Pardee1首次应用差异显示技术对比人类乳腺 癌细胞与正常乳腺上皮细胞所表达的 mRNA，以此来克隆癌 细胞所特有的基因。差异显示技术为寻找新基因开辟了捷 径，是该领域的重大突破,已应用于各个领域，如农业、植 物、动物、医学；就医学而言，涉及了胚胎发育器官形成、 遗传性疾病、药物作用原理、基因治疗和免疫反应等研究 领域，特别是在人类与肿瘤的战斗中有着极为广泛的用途。 差异显示的理论基础是基因的选择性表达。哺乳动物 基因组约含 100000 个不同的基因，对于某一细胞而言，仅 一小部分（约 15%）表达。在正常细胞的生长分化过程中， 基因的选择性表达决定着生命的进程；在病理过程中，作 为疾病的原因或结果，也存在着表达的基因异常。因此克 隆这些差异表达的基因是当前生物医学领域的研究热点， 该领域的不断深入将为从分子水平了解疾病的发生和发展 规律奠定基础，并为临床合理的治疗提供依据。 差异显示的关键在于选择具有高度可比性，表型特性 差异显著的对比对象。可比性即严格控制遗传背景，摒除 无关差异，仅使所关注的表型（如肿瘤细胞的转移潜能） 具有显著差异。差异显示从表型差异入手，通过展示 mRNA 的差异深入到基因差异，克隆与表型差异高度相关的新基 因。 就技术而言，差异显示巧妙地结合了两个基本的分子 生物技术：逆转录-聚合酶链反应及电泳。经过不断的改良， 差异显示已成为标准化的 cDNA 克隆方法，有多个公司的试 剂盒及设备使研究者可在短时间内启动差异显示，几天内 获得结果。较其他克隆新基因的方法而言，差异显示具有 简便易行的优势，因此在基础和临床研究中有着推广和普 及的可能性。 一、技术路线 差异显示技术实质是 RT-PCR,其独特之处在于 2 种 PCR 引物的设计:锚定引物 T12MN,含 12 个 T 可以结合于 mRNA3端 poly，M 为 AGC3 种碱基之一，N 为 AGCT 之一， 如 T12CA 可结合于在 poly 上游为 GT 的 mRNA；随机引物可 以在与 poly 末端不同距离的多个位置上结合，因此差异显 示的产物是不同长度的 cDNA 片段混合物。通过随机引物和 锚定引物的多种组合,差异显示有展示约 10000 至 15000 种 mRNA 的潜力，在 DNA 测序胶上对比细胞或组织中所表达的 mRNA，从而寻找在不同细胞，不同发育和分化阶段，不同 部位差异表达的基因。目前引物的设计更为新颖有效，如 GenHunter 公司在引物末端加入 HindIII 酶切位点，便于克 隆；Genomyx 公司则在锚定引物 5末端加入 T7RNA 多聚酶 启动子,在随机引物 3末端加入 M13 引物序列,便于直接合 成反义 RNA 探针及直接的双相测序。随引物的延长,退火温 度可由 40提高到 46,提高了差异显示的重复性。另外 可针对某一基因家族设计引物,使所获得的差异基因相对集 中。 其技术路线为：首先提取高质量的总 RNA,DNA 酶处理 后利用锚定引物 T12MN 逆转录,其后应用相同的 T12MN 及随 机引物进行 PCR 扩增；同时掺入同位素来标记产物。产物 用测序胶电泳分离，放射自显影。将差异条带切下，用相 同的引物进行 2 次 PCR 扩增。产物经标记制成探针，通过 Northern 杂交来验证其在不同样本中的表达差异，去除假 阳性。被证实的 cDNA 片段可克隆到 T/A 载体中进行测序， 其序列与 Genbank 数据库进行同源性检验，便可确定是已 知基因或者是与已知基因无显著同源性的未知基因。目前 已有多种非放射性标记方法,如溴化乙锭染色的琼脂糖电泳 4 、银染5 、荧光6及化学发光7 。 二、差异显示的优越性 1.差异显示仅需少量的总 RNA（g,约相当于从 200 个细胞中所提取的总 RNA） 。这使得材料来源困难的研究成 为可能，如细针穿刺细胞学标本，内窥镜活检标本等。用 总 RNA 和 polyRNA 做模板可获得相同结果，这也说明在大 量的 tRNA，rRNA 存在的情况下，锚定引物 T12MN 能特异的 结合于 mRNApoly 的尾部。 2.差异显示应用 PCR 技术，起到了放大作用，敏感度 高。为了筛选低转录水平的 mRNA 已进行了许多改良，如 Hakvoort 等8将消减杂交与差异显示结合，先通过杂交 使差异片段富集，再进行并列比较，则低转录水平的 mRNA 得到展示的可能性大大提高。又如 Ralph 等9通过 2 轮 PCR 扩增（巢式） ，第 2 轮引物较第 1 轮在 3端多 2 个碱 基，使与之匹配的模板减少，模板间的竞争减少,因此低转 录水平的 mRNA 易于被扩增。 3.差异显示在测序胶上同时并列比较 2 个或多个研究 对象，比如转移潜能高、中、低的癌细胞系，使后期在选 择差异片段时有所参考。同时回收那些出现或消失的差异 条带，则可获得“打开”或“关闭”的基因，比如同时克 隆激活的癌基因和失活的抑癌基因。 4.差异显示可以在 23 周时间内获得结果。最大程度 的排除假阳性依赖于三个层次：第一、不同浓度模板的平 行反应，及重复实验用于排除由于模板质量数量而导致的 假阳性。第二、严格地对照实验，如用缺省逆转录酶或用 RNase 降解 RNA 做为阴性对照来排除 DNA 污染。第三、差异 片段的初筛，如将研究对象 RNA 逆转录,掺入同位素制成探 针，分别与点有所有差异片段的尼龙膜杂交10 ，只有那 些“此有彼无”的片段进入下一阶段研究，该法有效的集 中了目标，削减了繁重的后续工作。 三、差异显示在肿瘤研究中的应用 肿瘤发生是多步骤的过程，涉及到原癌基因的激活及 抑癌基因的失活而导致的细胞失控性生长。在此综述差异 显示在肿瘤研究中最多见的 4 种模式以备参考，可见巧妙 地匹配研究对象使差异显示成为克隆肿瘤相关基因、转移 相关基因的有力工具。 1.差异显示技术用于对比恶性肿瘤组织及其邻近的正 常组织：近年有很多将差异显示技术应用于临床手术标本 的报道，对比对象涉及脑肿瘤、甲状腺癌、肝癌、前列腺 癌、乳腺癌、食管癌组织及与其对应的正常组织，试图克 隆与癌发生相关的基因。Meyer-Siegler 和 Hudson11 将差异显示用于前列腺癌淋巴结转移灶与正常前列腺组织 的对比研究，获得 166bp 的 cDNA 片段在转移灶高表达，与 人类巨噬细胞移动抑制因子（MIF）93%同源，并在临床已 转移的前列腺癌手术标本中得到证实。高表达的 MIF 将有 可能成为转移性前列腺癌的诊断标志物。对于临床工作者 来说，差异显示技术无疑有着标本来源丰富的优势，使临 床研究深入到基