pcr检测儿童微小残留白血病的研究进展(1)

PCRPCR 检测儿童微小残留白血病的研究进检测儿童微小残留白血病的研究进 展展(1)(1) 【摘要】 微小残留白血病是指白血病经化疗缓解 后在骨髓中仍存在形态上不能检测到的白血病细胞，是白 血病复发的主要原因。儿童 MRD 的检测对判断儿童白血病 的预后、制定白血病的治疗方案有重要意义。PCR 方法在 MRD 检测中具有快速、特异、简便、经济和样本量少等特点。 本文综述近年以多重 PCR 初筛白血病靶基因，以荧光定量 PCR（FQPCR）追踪 MRD 方面所取得的进展。 【关键词】微小残留白血病 PCR 多重 PCRFQPCR 儿童 白血病 DetectionofMinimalResidualDiseaseinchildrenLeukemia PatientsbyUsingPCRReview AbstractMRDdetectioninchildrenleukemiahasapotential importancetopredictclinicaloutcomeandtomodifytreatm entprotocolsofthediseases.Althoughsomepatientswithl eukemiahaveachievedcompleteremissionaccordingtothec linicalandmorphologicalcriteria,therearestillverylo wnumbersofmalignantcellsthatcannotbediscriminatedby morphologyandremainedinbonemarrow,whichiscalledmini malresidualdiseaseandisthemainreasonleadingtorelaps e.MRDdetectionhasanimportantsignificancefordesignin gtreatmentprotocols.SeveralmethodsofMRDdetectionhav ebeendeveloped.Theseincludeconventionalcytogenetics,f luorescenceinsituhybridization,flowcytometricimmu nophenotyping,Southernblotandpolymerasechainreactio ntechniques,etc.Eachofthesetechniqueshasitsadvantag esanddisadvantages,sonotallofthemaresuitableforclin icalMRDdetectionbecauseofseveralinherentdisadvantag es,suchaslimitedsensitivity,timeconsuming,highcos t, or requiringhighqualityDNA or RNA.Forexample,t hesensitivitiesofconventionalcytogenetics,FISH,FCMa ndSouthernblotapproachesforMRDmonitoringare10-1-10- 2,10-2,10-3-10-4and10- 1,respectively.Relatively,PCRcanreachagoodsensitivi tyof10-4-10- 6,andshowmoreadvantages,suchasfast,specific,simplea ndlowcost,aswellasminimalamountsofDNA or RNAforde tection,etc.,soPCRhasitsspecificfeaturesforMRDdetec tion.Inthisreview,theprogressonthedetectiontechniqu eforscreeningleukemiaspecificmarkerbymuitiplexPCRan dFQPCRinrecentyearsaresummarized. Keywordsminimalresidualdisease;PCR;multiplexPCR;FQ PCR;childrenleukemia JExpHematolXX;15:652-656 微小残留白血病（minimalresidualdisease，MRD）是 指白血病经化疗取得完全缓解后，骨髓中仍存在形态上不 能检测到的白血病细胞，是引起白血病复发的主要原因。 准确测定 MRD 对临床制定治疗方案具有重要意义。目前用 于检测 MRD 的方法有核型分析、荧光原位杂交 （fluorescentinsituhybridization,FISH） 、流式细胞术 （flowcytometricimmunophenotyping,FCM） 、 Southernblot 和 PCR 等，不同方法各有利弊。核型分析、 FISH、FCM 和 Southernblot 等的敏感性分别为 10-1-10- 2、10-2、10-3-10-4 和 10-1，难以满足对 MRD 诊断的需要， 且都存在或操作费时，或费用较高，或对样本要求较高等 不足之处。相对而言，PCR 检测 MRD 的敏感性可达 10-4- 10-6，且具有快速、特异、简便、经济、样本量少等优点， 因此用于 MRD 检测独具优势。本文综述 PCR 在儿童急性白 血病 MRD 检测中的应用研究进展。 初诊白血病靶分子的初筛多重 PCR 在白血病初诊时筛选肿瘤标志，可作为 MRD 追踪的靶 目标。而肿瘤标志的筛选需考虑样本用量、费用、效率等 问题。多重 PCR（multiplexPCR）是在同一试管中加入多对 引物，扩增同一模板的几个区域，可一次性筛选出目的 DNA，具有检测的覆盖面较广、效率较高、费用相对较低等 优点，目前国际上通常采用此法作为白血病肿瘤标志的初 筛。 多重 PCR 初筛融合基因的临床意义目前已经发现的、 与白血病相关的融合基因有 50 多种，由于其在白血病的发 展过程中比较稳定，因此可作为白血病初筛及 MRD 追踪的 标志。融合基因在各种白血病中的发生率：在急性前 B 淋 巴细胞白血病 （preBcellacutelymphoblasticleukemia,preBALL ）中为 40%-50%，在 T 淋巴细胞白血病 （Tcellacutelymphoblasticleukemia,TALL）中为 10%-25%，在急性髓系细胞白血病 （acutemyeloidleukemia,AML）中约为 30%1 。 Pallisgaard 等建立一种逆转录多重巢式 PCR 方法。 他们设立了 8 个 PCR 管，进行逆转录多重巢式 PCR，用于 筛选急性白血病中 29 种染色体易位（超过 80 种融合基因） 。 样本包括 102 例 AML、62 例儿童 ALL 患者的冻存或新鲜骨 髓和外周血。结果显示：44%AML，45%ALL 患者融合基因阳 性，而在融合基因阳性的标本中 33%AML 及 47%ALL 用常规 的细胞遗传学方法不能检测出来。 Olesen 等2用逆转录多重巢式 PCR 和传统细胞遗 传学方法同时检测了 AML、ALL 等共 328 例病人的骨髓和外 周血标本。结果显示：融合基因检测阳性率为 25%，细胞遗 传学检测阳性率为 15%；在 88 例儿童标本中，两种方法检 测均阳性的占 28%，但其中 16%核型分析并没有发现染色体 易位，而是检测出另一些染色体畸变。 由欧洲 8 国 14 个实验室共同参与研究制定的“急性白 血病 MRD 分析：国际标准和临床评价行动“（BIOMED1 行 动） ，针对与预后相关性较大的 9 种染色体畸变，建立了一 套标准化的多重 PCR 方法检测 MRD4 ，使 MRD 的检测具有 统一的标准和质量控制。 多重 PCR 初筛融合基因应注意的问题综合目前的文献， 在设计多重 PCR 检测融合基因时需考虑下列问题：在 RNA 水平上检测融合基因：由于大部分断裂点融合区长度超过 10kB，常规 PCR 较难扩增如此长的序列，而且大部分断裂 点跨过一个或几个内含子，使得在 DNA 水平上确定这些融 合基因变得繁琐和耗时。但如果以融合 mRNA 为模板逆转录 出 cDNA，就可以解决上述问题。逆转录引物的设计：目 前通常以随机引物或多聚 dT 引物逆转录 cDNA，如设计融合 基因特异的 cDNA 引物进行逆转录，可使特异性增强 25-12