脊髓缺血再灌住损伤_博士学位论文.doc

博士学位论文脊髓缺血再灌住损伤 摘 要 文研究了脊髓缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion i/r )时微血 管内皮细胞粘附分子icam-1及其调节因子il-1的表达对血脊髓屏障损害的分子机理，主要结果为：脊髓缺血再灌注损伤模型建立：通过阻断大鼠腹主动脉造成脊髓腰尾段缺血。按缺血和再灌流各时间段分别阻断开放腹主动脉。应用激光多谱勒血流仪，分别连续测定腰髓血流变化。取缺血前、缺血30分钟、缺血60分钟，缺血30分钟再灌2h、4h、6h、9h、12h 局部脊髓组织进行组织病理和透射电镜检查。结果：在缺血30分钟时腰髓局部血灌流量迅速下降至基线值的-81.57%(p值=2.01e-17) 。再灌流时，局部血流迅速增高并超过基线水平。再灌流10分钟，局部血灌流量与基线的百分比变化值为57.98%(p值=3.3e)，随后逐渐降低，再灌流30分钟后，局部血灌流基本恢复基线水平(31.97% p值=0.557899)，以后血流量低于基线水平，出现缺血后延迟低灌流。直至再灌流4小时(-23.5%,p值=1.84e)低灌流保持相对稳定，血流未见恢复。证实了缺血再灌流进行性延迟性低灌流 ( delayed hypoper fusion)存在。说明缺血缺氧本身对脊髓有损伤，而再灌后，在恢复血供条件下，其病理改变加重，揭示了脊髓存在再灌注损伤。脊髓微血管内皮细胞与星型胶质细胞紧密连接构成血脊髓屏障，脊髓i/r损伤过程中血管内皮细胞是最先波及的部位，因此本实验总结为缺血低灌流是严重脊髓损伤后主要血流变化。而延迟性低灌流现象主要与血脊髓屏障损害相关。本实验结论：再灌注期脊髓损伤较缺血期明显，表明再灌流后脊髓发生了二次损伤。脊髓微循环障碍在脊髓i/r损伤中起重要作用。血脊髓屏障损害是脊髓i/r 过程中重要病理基础。为深入探讨脊髓i/r损伤时血脊髓屏障的基本结构微血管内皮细胞表面粘附分子(intercellular adhesion molecule-1简称icam-1)的变化作用，以及内源性细胞因子对其表达的调节。本实验以暂时性脊髓缺血为活体模型，对微血管内皮细胞表面icam-1、白介素1-(interleukin-1b il-1)的基因及蛋白 /多肽水平的表达，以及它们与多核型白细胞(pmn)在脊髓缺血区中浸润间的关系进行了研究。重点观察了微血管内皮细胞损伤后粘附蛋白icam-1表达的变化。提取各实验组缺血再灌注损伤脊髓组织总rna,经反转录合成cdna,在特异性il-1、icam-1和3- 磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)引物存在下，以gapdh为内对照进行多聚酶链反应(pcr),应用地高辛标记cdna探针技术检测脊髓i/r损伤后脊髓血管内皮icame-1mrna和il/1mrna表达。免疫组化及免疫荧光激光其聚焦显微镜(confocal)定性、定量测定脊髓微血管内皮细胞表面icam-1的表达,mtt生物检测法定量测定脊髓组织中il-1活性。脊髓组织过氧化酶 (mpo)活性测定用于定量反映浸润到脊髓组织中的pmn数量。动物实验表明，正常脊髓微血管内皮细胞表面仅有微量的icam-1表达，脊髓组织中有基础量的il-1分泌，组织中未见pmn浸润，单纯缺血不引起细胞因子和粘附分子表达量的升高，再灌注后，缺血区细胞因子，粘附分子的表达及pmn的浸润先后发生了改变。再灌注2h,il-1mrna的表达首先升高，约为对照组的2倍。其多肽活性(od值/g) 随不同灌流时间出现时相变化,再灌注3h明显升高, 6h达到高峰, 并持续到12h。再灌注4h，icam-1 mrna表达量明显升高，再灌注12h 其在单位微血管面积上的荧光强度约比单纯缺血组增加了二分之一，再灌注9-12h，脊髓组织中mpo活性约为单纯缺血组的两倍。 以上结果提示：脊髓i/r 损伤诱导了内源性细胞因子il-1及微血管内皮细胞表面粘附分子icam-1mrna的表达,并伴有相应活性多肽及蛋白的合成分泌。 早期炎性因子il-1在基因和多肽水平的表达与icam-1相平行，说明损伤区细胞因子和粘附分子共同参与了对损伤组织的炎症应答，并在功能上有联系。而il-1早于icam-1的表达则提示,i/r损伤后内源性细胞因子il-1的分泌可能是调节内皮细胞表达粘附分子的因素之一。 再灌注损伤有pmn的大量聚集,而icam-1的调节表达与促进循环中的pmn与血管壁的粘附、游出血管浸润到周围脊髓组织密切相关。 i/r损伤后脊髓微血管内皮icam-1及其调节因子il -1的表达增加是导致血脊髓屏障损害的重要分子基础。il-1对i/r损伤后血管内皮icam-1表达具有调控作用。脊髓i/r损伤微血管内皮细胞icam-1 的表达为时间性依赖性增加。再灌注后脊髓损伤icam-1表达量的增加是白细胞在缺血区粘附到血管壁、游出血管损伤周围脊髓细胞的前提条件和物质基础。 细胞外超氧化物歧化酶（ec-sodc）是一种分泌的sod 同功酶，与细胞内cuznsod比较，它与血管内皮亲和并有较长的血液半衰期。本文目的，研究重组人细胞外超氧化物歧化酶c型(rh-ec-sod)在脊髓缺血再灌区损伤中的保护作用及其对icam-1表达的影响。 方法：设立正常组、单纯缺血组、缺血再灌组、缺血再灌治疗组和缺血再灌安慰剂组。复制大鼠缺血再灌注损伤模型。在再灌注前静脉加入终浓度rh-ec-sod200mg/l-1并同时测定脊髓组织乳酸脱氢酶（ldh）、脊髓组织mda含量、cshpx活性和no量，并用rtpcr技术检测icam表达。其结果为缺血再灌注后可引起细胞乳酸脱氢酶(ldh)释放量和mda含量增高,细胞合成释放no量减少而粘附分子icam-1表达量增加,缺血再灌治疗组rh-sodc明显减低ldc释放和mda含量,明显抑制细胞粘附分子的表达,结果表明缺血再灌注icam-1的表达增加和产生的大量自由基是造成脊髓损伤的主要病理因素.rh-sodc具有改善脊髓的抗氧化能力,通过清除自由基减轻i/r对脊髓损伤,并且有抗icam-1过量表达保护脊髓的作用。关键词: 脊髓缺血再灌注损伤 细胞粘着分子 白细胞介素-1 血脊髓屏障 重组人细胞外超氧化物歧化酶 氧自由基。 第 部 分文 献 综 述 1.1 前言脊髓神经元是对缺血缺氧极其敏感的神经细胞，损伤后即刻重新得到血液的再灌注是防止损伤使其存活的必要措施。但近些年来却发现在某种损伤因子作用下经过一定时间缺血的脊髓神经在尽管得到血液再灌注却也出现了明 显的功能障碍,甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡。这种现象称为脊髓缺血再灌损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury i/r)。引起这些病理改变的原因目前仍不十分清楚。炎症反应与缺血再灌注损伤的密切关系已成为共识，而且粘附分子参与再灌注损伤病理过程的研究已成为热点之一1-5。但是，关于脊髓i/r微血管内皮细胞粘附分子表达及与白细胞在再灌注损伤中起何种作用尚未见报道。因此，研究粘附分子在脊髓再灌注损伤后对血脊髓屏障损害的分子机制，并通过阻断粘附分子来干预再灌注损伤，使之成为防治脊髓i/r 损伤的一种有效临床治疗途径，这是本文研究的目的所在。现就其这方面 国内外研究工作综述如下：1.2实验性脊髓缺血再灌注损伤机制研究进展 实验性脊髓i/r 损伤在脊柱外科领域研究中取得了令人瞩目的成就，已成为神经生物学发展的广阔前沿，为缓解和修复脊髓损伤提供了理论依据。在其研究领域内选择了部分关键的有关分子和细胞试验,这些重点目标包括 a. 明确及减轻由于创伤、继发炎性反应和纤维化给脊髓造成的损害以及阻止不利于再生的继发因素的形成。b.明确各种再生的综合因素及其包括可溶性基质或膜结合性因子,它们相互作用和同时具有营养和抑制作用。c.阻止抑制因子的作用;如粘附分子表达。 1.2.1关于脊髓缺血再灌损伤模型制备1.2.2为了系统化研究脊髓缺血的病理过程及治疗，应用活体动物模型进行生理控制及复制是非常必要的。因其发病因素、临床表现及解剖学上差异很大，所以动物试验可以提供对这些差异进行精确的控制和分析6， 由于动物模型制备的可行性、稳定性以及与人类脊髓缺血再灌注损伤类似程度直接关系到实验的研究意义和价值。因此，建立理想的动物模型仍是目前致力探讨的课题。早在200年前，stenonis即曾结扎犬的降主动脉，造成后肢瘫痪。此后，各学者用了不同方法例如压迫主动脉，钳夹主动脉，或在 腹主动脉内置一可充气之气囊以阻塞主动脉之血流。killen等7(1965)用犬实验，游离主动脉，按不同平面结扎肋间动脉，结果使脊髓发生缺血性损伤。詹名抒等8(1987)选用健康家犬，显露t10l2节段脊髓，用双极电凝器灼闭根动脉和脊髓后动脉，术后动物的后肢皆呈现完全性截瘫，其中6只观察3-37天，截瘫无恢复。zivin 9等选用腹主动脉夹闭法, 进行局灶性脊髓缺血再灌注模型制作,仍是目前采用主要的实验方法之一。 其手术分离腹主动脉至肾动脉水平，在左肾动脉起始部远端用动脉夹夹闭腹主动脉，根据所需时限进行阻断血流。这种方法器材简单，操作方便，重复性强，缺血时限确切。可以通过控制缺血时间来研究持续不同时间缺血脊髓组织的各种改变和神经功能损伤程度，由此反映缺血神经组织细胞的耐受性及影响因素。缺点需要二次手术，增加创伤。此外还有其sablagens法10:分离腹主动脉,在肾动脉起始部下方安置可调性体外松解器, 通过体外松解恢复血流或阻断血流。动物被处死这段时间内准确判断脊髓损伤程度, 同时避免二次操作及麻醉因素的保护作用。与夹闭法相比，这种方法更为精确。还有气囊栓塞法11和脂肪栓塞法12。其阻断血流时限与神经功能缺损及脊髓病理变化关系十分密切。在血流阻断 1min后，几乎全部动物均表现截瘫。阻断因素去除后，动物可表现多样。统计资料表明, 阻断 血流20.6min可以造成50%的动物部分神经功能缺损或进展神经功能损害。阻断33.2min可造成90%动物持久性不可逆神经功能损害,其中50%动物为迅速持久完全性截瘫; 阻断52min可造成99%动物迅速不可逆性完全性截瘫。阻断时间 少于20.6min通常会引起暂时可逆性神经功能缺损， 阻断血流25-30min，动物神经功能缺损常为进展性。其中实验动物种类的选择同样重要。大鼠是值得选择的一种，因为其适用于单克隆抗体、原位杂交反应物、转基因、基因“失效”和其它基因工程，以及电生理研究。因此可能成为主要的确定种类。新的模型可以在分子和细胞水平接受检验。这种模型要求能检查：a.损伤脊髓的水肿情况；b.炎症和免疫细胞介导的组织自损；c.白细胞粘附和浸润 ;d.cytokine-ntf系列和它们间相互作用;e.神经学和神经生理学作用。1.2.3脊髓缺血再灌注研究观察方法 50年代tarlov13在进行脊髓损伤的实验研究中 ,首先提出了分级评定脊髓功能的神经学标准。 以后很多研究者在对脊髓损伤平面以下的躯体自主运动功能进行评定时，大都运用了tarlov 的分级方法或其改良方法。 如 tator14在对猴运动功能进行评定时,采用的改良tarlor法为:0级,肢体完全瘫痪;1级,肢体或划动;2级, 所有关节能良好运动,但不能走动和负重;3级;可能行走和负重; 但不稳;4级:正常。但taror认为tarlov的这种应用双盲试验的原始记录进行损伤脊髓功能的分级评定, 对灵长类是准确的,但对种属低一些的动物 ,如啮齿动物却缺乏准确性, 有些指标难以观察。而且低种属的动物如猫、狗脊髓损伤后产生的“脊髓步行”或其它反射性的肢体运动容易混淆肢体功能的临床判定15。脊髓功能的判定(电生理检查)在脊髓i/r损伤的研究中,除感觉、肌力、反射、大小便控制等神经学方面的判定外，电生理检查是有价值、比较可靠且客观的检查方法。尤其是在实验研究中，动物的感觉、肌力及反射不易测定的情况下。诱发电位(evoled potential, ep) 系指人工的或自然的刺激所引起的中枢神经系统的电位变化。 脊髓是头部以下运动和感觉的总通道，如发生损伤即可造成皮质和脊髓诱发电位的变化。a.体感诱发电位(somatosensory evoked potential, sep):sep是连续刺激感觉神经纤维在中枢社会系统任何部位诱发的综合电位活动。其中皮层诱发电位(cep) 是指连续刺激周围神经引起的冲动在大脑皮质体感区记录到时间和空间上的综合电位变化。脊髓诱发电位(scbf) 也称脊髓电图(seg),即刺激下肢周围神经,在脊髓损伤部及其头侧部位,接收脊髓突触后电位。包括节段性脊髓电图( esseg)和节段上或传导性脊髓电图。 其它诱发电位还有前庭诱发电位、网状结构诱发电位、脊髓脊髓诱发电位等。b.运动诱发电位(motor evoked potential, mep) mep是指应用电或磁,刺激皮层运动区或脊髓,产生兴奋,通过下行传导径路 ,使脊髓前角细胞或周围神经运动纤维去极化,在相应肌肉表面记录到的电位。有人用高压低流电刺激猫皮层运动区诱发mep。认为mep信号沿脊髓前外侧索传递,对实验性脊髓损伤较sep 敏感且与动物运动功能一致。mep的恢复先于动物运动功能恢复。脑电图和脑组织光镜和电镜检查表明高压低刺激对脑组织无损害，mep的出现与否可推断运动传导通路的存在与否,从而达到判断脊髓损伤 预后的目的。由于sep潜时延长或消失以及波幅改变等可在脊髓、脑干或大脑不同水平损伤发生， 需结合其它检查作为定位诊断。mep可准确地反映运动功能,与sep两者共同使用可客观全面地反映脊髓功能。 目前尽管一些缓慢生长轴突的再生形态学证据已成为鼓舞人们的第一步， 但实际上不能很好地符合脊髓损伤患者的需求。解剖学上的改变不能代表功能上的结果。 如小鼠脊髓i/r损伤实验研究中，在组织学上已显示皮质脊髓侧索完全性损伤后，仍可表现出完全的功能恢复。 动物 中由于解剖学的改变使功能受到影响的相互关系， 也不完全适合于人类。解剖学上可以证实的再生，实际上可能并不 胜任其功能恢复。在效应细胞水平不合适的神经再支配类型可由中枢联络通过再调整而得到代偿。因此，实验性脊髓i/r 损伤今后在围绕有功能的神经重建方面研究中将致力于：a.运用目前的技术，尤其是神经生理学，明确脊髓损伤后功能丧失的性质及固有神经系统对损伤的反应，追踪再生的脊髓系统。b.运用新的方法评价动物模型及人类中的功能异常和功能重建。这两种情况都需要高分辨和非侵入性方法。评价脊髓i/r损伤修复方法的基本要求，是有效的、功能性的动物模型的存在，目前还没有脊髓 i/r损伤研究中能普遍接受的模型。如上所讨论急慢性脊髓损伤动物模型有不言可喻的优点，用神经生理学方法能合适地测量损伤程度及详细的足够的功能性再生。标准化的神经生理学方法对确定不同实验室中模型的损伤程度和修复程度甚为重要。 组织学观察( 免疫组织化学技术与其它技术结合在脊髓损伤研究中的应用)早期的脊髓损伤实验的研究者主要是应用传统的神经解剖学研究方法,如结合应用光电镜、 镀银或其它染色法观察溃变的神经细胞体和末梢，以及70年代后的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidise, hrp)技术和放射hrp研究感觉神经入脊髓至脑的走行图象,即将hrp注射于轴突中, 观察从皮肤肌肉来的传入纤维走行及功能。用标记示踪法研究脊髓损伤后神经的功能，其方法是将标记物，如 hrp注入到损伤脊髓部位远侧的周围神经或组织中, 轴浆的逆行输送可将标记物带到损伤处。如轴突完整，标记物将超过损伤处继续向近侧移动；如轴突断裂，则标记物无法越过而逸入到周围组织中。免疫组织化学技术的主要原理是用标记的抗体( 或抗原)对细胞或组织内的相应抗原(或抗体)进行定性,定位或定量检测,经过组织化学的呈色反应之后,用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。董永泉等16应用免疫组化方法对实验犬损伤后脊髓进行病理学观察.其采用单克隆抗体即神经元中丝(nf) 抗体和胶质纤维酸性蛋白(gfap)抗体染色。所有染色均进行图象分析计数nf其与gfap面积比,结果为:a.nf与gfap分别为损伤神经纤维及胶质结构的特殊指示物质, 可清楚显示出退变和再生轴突及增生的胶质细胞及其网状结构; b.观察到脊髓损伤后神经细胞与功能恢复相关的三种功能状态, 即活跃功能相,稳定功能相和静止相;c.星形细胞在脊髓损 伤后的作用可能具有双重性, 即星形细胞幼稚期的诱导作用与成熟期的阻抑作用;d.nf与gfap 面积比与神经纤维生长密切相关。 ducker等17 在进行胚胎组织脊髓内移植的研究中,大量地应用了免疫组化及示踪技术。tuszyhski等18在把经过遗传修饰能分泌释放ngf 的成纤维细胞移植入脊髓后,应用免疫组化方法标记了降钙素相关肽,从而 证实了穿过ngf移植物的是感觉纤维。 malhotra等19在脊髓撕裂伤的动物模型上,应用单克隆抗体j1-31( mabj),优先推出大鼠撕裂伤附近的反应性胶质细胞。认为mabj1-31在大鼠撕裂伤时,是比gfap更为强烈的反应性胶质细胞指示物质。因此 mabj1-31 能够识别最靠近损伤区的反应性胶质细胞，而免疫荧光染色却不能测定远离损伤区的反应性胶质细胞，也就是说在正常脊髓中, mabj1-31胶质细胞染色很轻或不着色。上述结果与脊髓 撕裂伤的近侧或远侧的反应性胶质细胞各自显示的生化异 型性(多相性)有关,并且随着轴突切断的退行性变而发展。轴突切断中的gfap 阳性的细胞可不被 mabj1- 31 染色。 beattie等20应用定量电子显微镜,研究了猫脊髓横断后、骶脊反射路突触输入端的变化。近年来的脊髓损伤研究几乎都用了免疫组化方法。但单纯的免疫组化染色在连续切片上追踪常不能获得满意结果，因为神经组织中的多肽含量较低，在免疫组化染色的连续切片追踪过程中常有丢失可能。故现在普遍采用的是免疫组化技术与其它技术相结合的“杂交技术”。如与 hrp、荧光物和放射自显影技术等相结合的逆行或顺行标 记法、与乙酰碱能(ache)和单胺荧光组织化学技术相结合的多种染色等。1.2.3.脊髓缺血再灌注损伤后微循环反应脊髓i/r损伤后微血管通透性改变:在脊髓损伤情况下，由于循环状态、血管内外渗透压及血管形态结构的改变，将导致微血管通透性增强。通过注射荧光染料进行猫脊髓挫伤后微血管通透性研究的结果表明，伤后5 分钟损伤区血管通透性开始增加，伤后6小时达高峰， 并可持续 到伤后24小时20。与脊髓挫伤不同，脊髓缺血再灌流后的灰白质微血管通透性均于灌流后30分钟出现亢进,但4小时又恢复正常,18小时后再次出现通透性增强,估计这种再灌流后血管通透性增强-恢复-再增强的变化与pgi2生成增多有关。伤后脊髓微血管通透性改变的程度及高峰时间与损伤程度明显相关，中、重度损伤的高峰期为伤后1-6 小时,组织含水量增加可达正常的1.2-1.8倍,6小时后无减轻趋势;而轻度损伤于伤后1小时有所增高, 组织含水量可增加1倍以上,这种轻度损伤后血管通透性再次增高的现象估计与脊髓伤后继发性损伤有关。但不少学者认为脊髓伤后血管通透性增加以及由此引起的组织水肿形成与伤后继发性缺血无相关性。理由是猴脊髓撞击伤后血管通透性增强高峰期常在伤后3-6天,表现为组织含水量及na、k 值的明显增高,伤后9天逐渐恢复正常,伤后20 天基本上无血管通透性改变, 但脊髓伤后继发性缺血损害的发生时间多为伤后24小时内。其损伤后微血管通透性增强的发生原因及高峰时间上争议较多，但伤后微血管通秀性增强却是公认的事实，其后果将导致组织水肿形成及组织缺血坏死。其通透性增高的细胞机制微血管通透性的增高一般来说只有 二个途径，一是内皮细胞膜通透性的升高，二是内皮细胞的形态发生变化导致内皮细胞间弥散通道的开放，二者都可被细胞内ca2浓度的升高激活。 从目前多数研究结果得知，内皮细胞间缝隙的增宽见于多种器官, 包括脊髓的微血管,在血管通透性方面具有更重要的作用21-23。 内皮细胞间连接由一些跨膜蛋白相互位点，即内皮细胞能够迅速改变其细胞间连接的结构，允许血浆成分和血液中循环细胞通过。在多数情况下，这种变化快而且是可逆的，即内皮细胞可以在几分钟内解除和重新组建细胞间的连接。有关内皮细胞连接的开放和关闭调节机制还不清楚。目前认为致炎因子是通过与特异的受体结合产生细胞内信号，引起细胞骨架的重排列，因而使细胞间缝隙增大，导致通透性增高。内皮细胞的连接也控制着细胞的游出，当白细胞粘附到内皮后，相应的细胞间缝隙开放，其机制估计与血浆成分的通透相关24-27。微血管舒缩功能变化：脊髓伤后5分钟内就可出现硬膜下微血管痉挛性收缩, 伤后15分钟开始出现麻性弛张,致使微动脉血流明显减慢, 毛细血管血流停滞,这种血管反应状态可持续到伤后1小时。 ducker等17 观测猴脊髓撞击伤脊膜血管变化时证实了类似的改变,而且发现血管弛张状态可持续到伤后4 小时 23。大白鼠腹侧脊髓压迫伤实验中发现24, 脊髓细动 脉管腔缩小时,细静脉及毛细血管管径却扩大;而细动脉管径扩大时,细静脉及毛细血管管径扩大则更为明显,这种状态可持续到伤后 6小时。与伤前相比, 伤后早期微动脉管径可缩小25.2%;血管扩张时,微动脉管径扩大可达33. 6%, 细静脉则扩大44.1%25。脊髓伤后微血管舒缩反应特点, 有两种不同的看法26: 一种认为伤后早期微血管呈收缩状态以维持实质内血液灌注压及组织血流量, 后期因微血管麻性扩张,虽血流量有所增加,但因灌注压不足致使血管内血流停滞,组织缺血;另一种则认为伤后微血管舒缩状态交替出现，甚至微血管调节机能紊乱后才发生微血管麻痹性扩张。微血管基底膜的变化脊髓血管内皮细胞与星形胶质细胞紧密连接构成血脊髓屏障的基本结构27。血脊髓屏障依赖于微血管的完整性,基底膜在维持脊髓微血管的完整性上起主要作用。 与其他组织器官的基底膜一样，它的主要结构成分是层粘蛋白、纤维连接蛋白和n型胶原,但有人发现脊髓实质微血管内皮的基底膜可能与其阴离子的分布不同有关 28 。hamann等29 用荧光抗体方法研究了中枢神经系统缺血和再灌注后基底膜成分的变化，发现层粘蛋白、纤维接蛋白和型胶原均明显减少，反映了微血管完整的破坏，在缺血再灌注损伤的细胞游出和出血中有重要的意义。基底膜的变化主要是除正常的型胶原和层粘蛋白外，还出现了纤维性的、和型胶原，说明缺血性损伤引起了基底膜结构成分的变化30。因而，在今后任何实验性脊髓i/r 损伤修复的成功方法都会涉及到蛋白或在血脊髓屏障中的特殊位置上的作用。可能影响初始治疗和继发支持作用(如schwan细胞桥梁)。这其中有大量重要潜在联系如下：a.创伤时血脊髓屏障正常但临时的中止可以人为延长, 以允许用营养因子延长治疗。b.血脊髓屏障不紧密的局部区域如脊髓背根进入点必须加以开发研究。c.因为可能由于免疫细胞和微生物感染使得中枢神经系统水肿、渗出易感性风险增加，人们细心观察了非特异性使内上皮细胞紧密连接疏松而打开血脊髓屏障的因子。这些成分局部应用或是临时给药，都能获得可以接受的治疗效果。d.刺激血管生成可能是允许成功的神经系统生存和神经元再生的关键因素。 微循环调节机能紊乱脊髓微循环调节方式主要有四种:化学调节、 神经调节、自动调节及神经元代谢调节。化学调节指paco2、pao 2、血ph值及血管活性物质对循环状态的影响,神经调节为脊髓血管支配神经对血管的调节控制；自动调节指全身血压(尤指map)及心输出量对微循环的影响;神经元代谢调节则指脊髓神经细胞电活动及细胞正常代谢及微循环的影响。有报道31猫脊髓伤后，损伤节段组织中多巴胺及组织胺将增加87.2%,从而导致血管通性增强及组织水肿形成。而脊髓伤后组织中儿茶酚胺类物质，尤其是去甲肾上腺素的明显增加，则导致微血管明显收缩，但脊髓伤后儿茶酚胺的大量增加并不一定会产生预想的微血管收缩管收缩，反而会出现微血管麻痹性扩张。这种现象可能与脊髓血管上单胺类递质受体分布差异有关。脊髓损伤后，paco 2对微循环的调节作用亦发生紊乱,正常山羊的脊髓bf于pao 2下降或paco2增高却不引起scbf的增加32。说明脊髓伤后微循环对paco2改变的敏感下降。 有关脊髓微循环的神经调节作用仍存在较多的争议。 1.2.4.脊髓缺血再灌注损伤炎症反应 单核吞噬细胞可释放多种毒性物质，具有很强的杀细胞能力。研究表明中枢神经缺血后的自由基、蛋白酶、白三烯、 兴奋性毒素等释放与单核吞噬细胞活化有关。 giulian33发现兔脊髓缺血后18-40小时,单核吞噬细胞数目显著增多,吞噬活性增强,并与迟发性功能障碍时相一 致。采用秋水仙素和氯喹因治疗，可显著增加运动神经元存活数，改善脊髓诱发电位和运动功能。脊髓损伤常引起脊髓组织膜磷脂代谢紊乱，膜磷脂在磷脂酶a2(pla2)的作用下分解代谢加速, 产生溶血血小板活化因子(paf)及花生四烯酸。花生四烯酸分别经环加氧酶途径及脂氧化酶途径最终释放大量的脂质炎性介质血栓素a2(txa2)、前列环素(pgi2),白三烯(lts),而溶血paf经乙酰基脱氧酶作用下生成paf。 这些代谢产物均具有较广泛的生物活性，参与体内多种病理生理反应。txa2/pg2失衡引起脊髓损伤后继发性损害作用的机理-脊髓损伤后最初的病理变化主要是微循环的变化,表现为微循环血流量减少或消失。如果微循环血流量能很快恢复，神经功能损害可以减轻甚至避免瘫痪的发生。脊髓微血管张力状态受到txa2和pgi2的共同调节，伤后伤区脊髓组织txa2、ptl2的合成量均增高,但txa2合成量明显高于pgi 2 的合成量。可能在于伤后脊髓脂质过氧化反应能抑制pgi2的合成,这样txa2/pgi2比值升高,失去动态平衡,txa2作用占优势,造成脊髓微血管收缩痉挛,微循环血流量减少。同时txa2促使血小板粘着、聚集和释放反应，释放的adp 、5-hete进一步促使血管收缩, 导致脊髓血管内微血栓形成或栓塞,血管内皮细胞损害,血管通透性增高, 血一脊髓屏障破坏,脊髓组织继发性缺血、缺氧、水肿、坏死。此外，txa2/pgi2失衡与脂质过氧化,ca内流、血管活性物质相互协同作用, 促使伤后脊髓组织继发性损害加重。mitsuhashi34发现ca+进入细胞内使各种酶激活,磷脂酶活化后, 膜磷脂降解,花生四烯酸释放,使txa2、pgi2、lt 3的合成 增加,导致白细胞趋化,血管通透性增高, 脊髓组织水肿的恶性循环。 1.2.5.脊髓缺血再灌注损伤自由基(free radical fr)反应： demopoulos等35提出：外伤后的脊髓坏死和自由基反应有关。自由基是一种外层轨道上单个电子的化学分子，它需要和其它分子相互作用才能与自身的电子配对。自由基参与正常的氧化代谢和脂质代谢过程，并产生前列腺素。它的氧化作用及其产生的反应极强，虽然活性期短，但如果有害反应一旦产生，可以连续的自我蔓延下去，除非被体内的自由基清除剂抑制36。正常情况下，自由基的反应在体内的严密制约下保持相对稳定。中枢神经系统创伤后，自由基反应首先引起膜损害，因为细胞膜含有磷脂和不饱和脂肪酸，最容易受自由基的脂质过氧化反应的影响。另一方面，由于在缺血情况下可引起自由基的电子传递移位，加之缺乏足够的氧去给结合电子传送链上的电子和氧原子，在黄嘌呤核苷酸、辅酶和一些金属离子的作用下，更促使自由基的产生。同时, 脊髓损伤后体内的重要抗氧抗剂抗坏血酸的水平也下降。ohkawa通过研究发现37，当黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶和铁离子加入神经组织后,可诱发细胞毒性水肿;脂质过氧化的产物乳酸及丙二醛增加, 进一步的自由基反应使突触体和线粒体内的磷脂氧化分解,释放游离脂肪酸,从而造成细胞膜和细胞器的损害。此外，自由基引起脊髓继发性损害栓素a2的合成及血小板凝聚作用增加,间接地造成脊髓缺血。脊髓缺血时组织氧分压(po2)下降,再灌流数分钟po2升高20%-40%，20-40分钟内逐渐恢复。再灌流后给纯氧可使脂质过氧化反应加重; 逐级给氧则使脊髓对缺血的耐受时间延长1倍,并明显改善能量代谢、组织病理和神经功能38。po2一过性升高可能是再灌流早期脊髓血流量暂时升高而能量代谢恢复缓慢所致。po2升高将导致自由基(fr) 及其脂质过氧化反应。fr含有不配对电子,性质极不稳定;生物膜上多价不饱和脂肪酸的丙烯双链易受fr攻击, 形成链锁式的铁依赖性脂质过氧化反应,进而导致膜破坏、细胞死亡。hall39证明脊髓缺血10分钟, 脂质过氧化产物mda尚在正常范围；缺血20分钟mda开始升高40 。实验室41观察到兔脊髓缺血40分钟时,腰4脊髓mda和sod无显著变化;再灌流 30分钟于24小时,mda显著升高(p0.001)，sod与mda呈负相关变化(r=0.99)。1.3内皮细胞-白细胞粘附分子与缺血-再灌注损伤 不同的组织器官由于结构和功能上的差别，缺血再灌注损伤时的表现及损伤特点也有所不同。中枢神经系统的活动主要依靠葡萄糖的有氧化提供能量，它是一个对缺氧最敏感的器官，一旦缺血达到一定程度，再灌注不仅不能使缺血区代谢和机能得以恢复，反可加重其水肿及梗塞 面积。再灌的结果实际是缺血的延续84-89。研究证实中枢神经缺血再灌注后有大量中性粒细胞在缺血区聚集 90-98，中性粒细胞堵塞微血管直接损伤内皮细胞，浸润到组织的中性粒细胞通过释放各种炎性介质如蛋白酶、活性氧成份(active oxygenspceies,aos)和脂质衍生物进一步损伤神经元细胞、胶质细胞和内皮细胞，成为再灌注损伤的主要因素99107。清除外周血白细胞或用药物抑制白细胞活性对缺血再灌注组织有明显的保护作用108-110, 可见白细胞在缺血再灌注过程中起着加重组织损伤的作用。近年来随着分子免疫学分子生物学的深入发展, 细胞粘附在缺血性损伤中的作用日益受到重视，并提出缺血区白细胞内皮细胞的活化及表面粘附分子的表达是白细胞聚集、游出血管发挥细胞毒作用的前提111-115。 粘附分子多为糖蛋白，跨膜存在;互为配体;形成网络。按结构特点可分为以下类：整合素家族; 免疫球蛋白超家族(igsf);选择素家族;钙离子依赖的细胞粘附素家族。此外，还有一些其他未归类的粘附分子。最近的研究表明, 与再灌注损伤有关的粘附分子有：细胞间粘附 分子-1(icam-1)、l-选择性(l-selectin)、p-选择素和e-选择素等。 1.3.1内皮细胞白细胞粘附分子的结构内皮细胞和白细胞表面的许多分子均有粘附特性。与脊髓缺血再灌注损伤关系较密切的粘附分子有: 内皮细胞表面的选择素族粘附分子与其配基碳水化合物，内皮细胞表面的免疫球蛋白超家族粘附分子及其白细胞表面的受体整合素族粘附分子。 选择素家族粘附分子又称白细胞粘附分子家族, 是一类涉及白细胞与内皮细胞的粘附分子家族。此家族分子均为高度粘基化的单链跨膜糖蛋白, 其结构特点是氨基端有凝集素样区(约含120个氨基酸), 接着为表皮生长因子(egf)样区(约含40个氨基酸)、跨膜区和细胞质区 , 没有 rgd序列。凝集素区在淋巴细胞粘附于毛细血管后微静脉内皮上起重要作用。目前发现此家族有三类：l- 选择素, p-选择素,e-选择素。 内皮细胞白细胞粘附分子-1(elam-1)属 e-选择素, 主要分布于毛细血管后静脉,il-1、tnf活化后表达。wang 等利用逆转录pcr发现大鼠局灶性脑缺血皮质elam- 1mrna 表达增加,缺血12h达高峰,持续2d。geng 等发现血栓形成时p-选择素介导组织损伤区域粒细胞与所激活的内皮细胞相互作用,促进纤维蛋白沉积。okada47等通过对狒狒脑 缺血再灌注模型研究, 进一步证实局部脑缺血再灌注刺激了缺血区域血管内皮细胞p-选择素的表达, 从而增强了白细胞-内皮细胞粘附。 icam-1属免疫球蛋白超家族,为单链跨膜糖蛋白,其所含寡糖分子数有所差别,故分子量在80kd-114kd。核心多肽为55kd。跨膜区和较短的胞质区组成。icam- 1的第1 与第2细胞外区间含有精-缬-谷氨酸序列,在第2 细胞外区内含精-甘-谷-赖-谷氨酸序列。icam-1的基因位于人第19 号染色体上。icam-1在血管内皮细胞表达最高, 其次为外 周白细胞。icam-1 的主要受体为淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)。icam-1的表达是可以诱导的,特别是炎症刺激后icam-1的表达明显增加。okada 的研究同时显示局部脑缺血/再灌注也刺激血区域脑血管内皮细胞icam-1的表达, 使白细胞-内皮细胞粘附增强。sobel报道icam-1同样表达于人脑梗塞的微血管内皮细胞表面。但在脊柱外科方面还未见有报道。 粘附分子在细胞表面的表达大多数需要细胞因子的剌激，并呈时间依赖性升高74-78。细胞因子白细胞介素 - 1 (interleukin- 1, il- 1) 、肿瘤坏死因子 ( tumor necrosis factor, tnf)、-干扰素( interferon-, inf-)、细胞内毒素等可剌激内皮细胞表达e-选择选择素，2-4h达到高峰，持续24小时。血栓素、组胺及补体成份、il-1、tnf等可使内皮细胞中的p- 选择素迅速与质膜融合出现在细胞表面。正常情况下，血管内皮细胞可少量表达icam-1；受内毒素、il-1或tnf剌激后6h，icam-1 的 表达达到高峰，并可持续几天。补体成份c5a(complement) 、细胞因子白细胞介素-4和-8(interleukin-4和-8，il-4和il-8)，血小板活化因子(platelet activating factor, paf)及细胞间的接触可剌激整合素的活化，而整合素表 面残基的活化是icam-1、icam-2与之结合所必须的。脊髓 缺血再灌注损伤时白细胞内皮细胞粘附分子表达增加的具体机理目前还不十分清楚，可能与以下几个因素有关：内源性的一氧化氮(no)为血管内皮舒张因子，具有抑制白细胞粘附、趋化和/或活化及血小板聚集的功能80-83 。正常时在血管内皮有基础量的分泌84，以防止中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附。实验说明85-88， 心肌细胞再灌注损伤后no基础分泌量减少，并有中性粒细胞与内皮的大量粘附。脑再灌早期,在中性粒细胞上的cd11/cd18 粘附分子及内皮细胞表面的icam-1表达量增加的同时，no显著下降，而应用外源性l-精氨酸提高no后可减少中性粒细胞的粘附89、90、103。 提示粘附分子的表达调控可能与no有关；细胞因子il-1为早期炎性因子，对维持正常中枢神经系统的发育有重要作用91-103。il-1通过内皮细胞表面的i类受体发挥多种生物学效应。在体外，它可剌激培养的人脐静脉内皮细胞增加表达粘附分子 103-106。脑缺血或脑血管痉挛时il-1分泌较正常升高104-109。缺血再灌注大鼠离室注射il-1拮剂、受体阻断剂可减少脑水肿及脑梗塞面积110-115。 综合近年来有 关细胞因子和粘附分子在缺血再灌注损伤时的变化夫律，以及我们的研究结果发现，il-1在基因与蛋白水平的表达与内皮细胞粘附分子的表达相平行，却较后者提前发生改变105、106、116。提示il-1 分泌可诱导粘附分子的表达；缺血及再灌流时内皮细胞、白细胞产生的趋氧阴离子自由基可进一步激活内皮细胞及白细胞，提高内皮细胞生居炎症介质白三烯 b4(leukotriene b4,ltb4) 和 paf 106、诱导内皮细胞白细胞表达细胞粘附分子， 并抑制内皮细胞产生一氧化氮，应用自由基清除剂可减少脊髓组织的损伤程度107、116。说明自由基也是粘附分子表 达的诱因之一。内皮细胞白细胞粘附分子介导白细胞粘附、跨内皮适移一般分为3个阶段117、118， 内皮细胞在受剌激后不久，选择素族粘附分子e-选择素、l-选择素、p-选择素首先表达或转移到活化的血管内皮细胞表面，通过识别白细胞表面的碳水化合物配基使白细胞粘附在血管壁上。 由于选择素与其配基的亲和力不高，粘附力较弱，故只能使白细胞疏松地贴在血管内皮上滚动。这种滚动对白细胞进一步的活化是必要的，可使白细胞通过损伤区的速度减慢，在内皮细胞表面有时间活化或得到趋化的信号。抗l- 选择素抗体及抗e-选择素、抗p-选择素抗体对此阶段的阻断作用说明了选择素在介导白细胞与内皮细胞起始粘附时的特异性作用；起始阶段的粘附完成后，l-选择素迅速从细胞表面脱落，白细胞活化，其表面整合素粘附分子迅速上调。内皮细胞表面的粘附分子icam-1的表达也呈时间依赖性增加；icam-1与整合素的结合使白细胞紧密地粘附在内皮细胞表面，并介导白细胞的渗出。 此过程可被 cd11/cd18抗体及抗icam-1抗体对白细胞与内皮细胞的粘附及对白细胞外渗的阻断作用证实。muller119等报道，pecam-1 在白细胞穿过内皮层的过程中起着重要的和用。85以上的内皮表面pecam-1分布于细胞连接部位，用其单抗或重组可溶性pecam-1分子处理，可阻断白细胞穿过内皮层，但不影响白细胞与内皮细胞的紧密粘附，而且可见单抗处理后的白细胞大量粘附在内皮细胞连接部位。综上所述，内皮细胞白细胞表面粘附分子表达量的增加介导了组织缺血再灌注损伤时白细胞贴壁、趋化游出的病理过程。1.33 抗白细胞-内皮细胞粘附治疗进展由于白细胞-内皮细胞粘附性增强。 在缺血再灌注损伤中有着重要意义。因此用抗粘附治疗减轻甚至防止再灌注损伤是人们极为关注的问题，其方法可归为以下类： 已经知道一些致炎因子(如c5a、tnf)可刺激粘附分子在数量与功能上显著上调, 故干扰致炎因子可使粘附分子的表达受抑制,进而减少白细胞与内皮细胞的粘附。 目前已证实：bruce等用tnf受体缺陷小鼠证实了tnf 在脑缺血中的作用。用单克隆抗体，直接阻断粘附分子的作用。 已经有实验证明，icam-1单克隆抗体和cd11a/cd 18 (lfa-1) 单克隆抗体等均有显著缩小缺血大鼠的脑梗死面积，增加微血管再灌注，改善神经功能的作用。但也有人认为，抗cd18或icam单抗不能明显改善动物神经病变的预后。对此还需进一步探索，采用灵敏的观测指标，可进行多种抗体联合应用。调控粘附分子的基因表达近期研究发现，致炎因子(如tnf等) 是通过 ( nf -nuclear factor b)来调控粘附分子的基因表达的。是一种多向性转录因子，调节细胞粘附分子的转录。n- 乙酰 -l-半胱氨酸，阿司匹林等药物具有抗nf-的作用，能从转录水平上对粘附分子的表达起抑制作用。目前这方面的结论主要来自肿瘤转移方面的研究，有关在缺血性脊髓损伤中的机制尚未见报道。上述治疗均围绕在缺血性脑病中进行，但在脊髓方面还未进行这方面探讨。如何减少恢复后的血流对缺血区带来的副作用是目前及今后研究治疗脊髓损伤的重点。 1.4 细胞外超氧化物岐化酶(extracllular-superoride dismutase ec- sod)的临床研究进展 ec-sod是在八十年代初才在人血清中发现，因为它首先是在细胞外液中发现的，因此命名为(extracellucar sod)。尽管ec-sod发现的较晚，但在瑞士marklund s.l. 小组的不懈努力下，其理论方面的研究取得了非常显著的进展。为ec-sod的临床研究和应用提供了非常有价值的基础资料。1.4.1 ec-sod的结构、功能及其在组织中的分布ec-sod分子量大约135,000120，由四个相同的亚基构成，每个亚基的活性部位含有一个铜原子和一个锌原子。在 asn-89有一氮原子连接的糖基121,按酶的活性分析,以该糖基区分为ec-sod与细胞内sod122,且该糖基大大增加了ec-sod的溶解性123。人ec-sod主要以由两个二硫键联结的四聚体形式存在。 亚基间的二硫键把两个亚基的肝素结构联系在一起，在介导ec-sod对肝素的亲和力中起重要作用。 ec-sod能与肝素结合是其主要的生物特性。 它的肝素结合位于亚基的羧基端，是一组带正电荷的氨基酸残基(arg210lyslysargarg215)124。亚基间二硫键(-c219-s-s-c219-)将两个亚基的肝素结构区的尾部连接到一起，使12 个带正电荷的氨基酸非常接近。 这一高密度的正电荷氨基酸残基的细胞外基质与负电荷物质和硫酸肝素产生静电作用。这解释了为什么ec-sod比其它肝素结构蛋白对肝素具有更高的亲和力125。正是ec-sod这一独特特征使ec-sod 能以高浓度存在于细胞外基质或细胞表面特定的区域，在这一区域内有效地清除超氧，控制超氧的稳态浓度。ec-sod的所有亚基在最初分泌时都含有肝素结构区，然而以后在细胞外液中，ec-sod对肝素的亲和力并不均一。 它们可分为三种类型：对肝素无亲和力(a类)、对肝素中度亲和力(b类)和对肝素高亲和力(c类)128。ec-sod肝素亲和力不均一性的原因主要是其亚基的肝素结构区蛋白水解程度的不同16，肝素结构区未经蛋白水解的亚基为型亚基，经蛋白水解的亚基为a型亚基，ec-sod四个亚基由最初分泌的c 型，经肝素结构反区的逐步水解成为a型。导致该酶对肝素亲和力的逐步丧失而由c类(高肝素亲和力)变为a类(无肝素亲和力),其中间状态是由a型和c型亚基混合构成的b类( 中度肝素亲和力)ec-sod。这种蛋白水解并不降低酶的活性。组织的细胞外基质中几乎100的ec-sod为c类129、130 。血循环中大多数ec-sod为类。很可能是肝素结构区的蛋白水解导致ec-sod丧失对细胞外基质及细胞表面肝素的亲和力而从组织向血浆迁移。ec-sod的肝素结构区除了特异性蛋白水解外，还容易发生非酶糖基化。这种糖基化也导致ec-sod丧失肝素亲和力，但不丧失酶的活性131、132。这可能是ec-sod肝素亲和力不均一性的另一机制。健康人群的