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文档简介

前言前列腺增生症即良性前列腺增生( benign prostatic hyperplasia,bph ),亦称前列腺肥大,是一种因前列腺明显增大而影响男性健康的常见疾病,系成年男性泌尿生殖系统疾病中多发病之一。前列腺增生症以进行性尿频、排尿困难为临床特点。bph的病因和发病机理研究颇多,但至今未能十分明确,目前较为肯定是本病发生必须具备2个条件:高龄和具备正常功能睾丸的存在。目前bph发病机理主要学说有:双氢睾酮(dth)学说、雌雄激素协同学说、间质上皮细胞相互作用学说、胚胎再唤醒学说、干细胞学说等1,2。在中医理论中,一般把bph归属为 “癃闭”范畴,病机特点为本虚标实,本虚是指肾虚气弱,涉及肾、肺、脾三脏;标实主要指淤血蓄结和膀胱潴留的水湿,涉及膀胱之腑。而肾虚血淤是bph的基本病因。bph的治疗方法颇为庞杂,文献报道丰富,但不外药物和手术两种。手术目的是解除梗阻,目前手术方法也较多,疗效较为可靠。但这种方法损伤性大,恢复期长,而近来的采用经尿道前列腺摘除术,技术难度大,摘除不彻底,且由于老年人多伴有不同程度的心脑血管疾病及心肺功能不全,手术治疗合并症较多,危险性也大。另外,目前国内外对前列腺免疫功能的研究表明3,4,前列腺能够产生多种免疫球蛋白,可以合成具有抗菌作用的含锌多肽,且有保护生殖系统免遭细菌和其它病原微生物侵袭的局部免疫功能,故有人主张应尽量保留。其他外科治疗方法bph中,注射疗法效果不稳定,复发率高,注射部位疼痛,且易引起注射部位感染,故不易推广;冷冻治疗的深度与广度不易控制,易产生并发症;激光治疗对前列腺增生消除不彻底,复发率高;微创和射频的生物热效应疗效不满意。因此,药物治疗bph变得十分重要。药物治疗旨在减轻或缓解bph患者的病情。目前用于治疗bph的西药主要由以下两类:(1)受体阻滞剂,主要作用机理是降低前列腺和尿道平滑肌的张力及前列腺尿道的压力,从而解除了因bph引起的膀胱出口梗阻(boo)的动力学因素,改善梗阻症状,可用于早期的前列腺增生症,但有头痛,心悸,眩晕,体位低血压及药物依赖性等副作用。(2)5还原酶抑制剂,可以降低前列腺组织中的dht水平,不仅使前列腺不再继续增生,还可以使其体积缩小但对性功能影响较大,常有阳痿、性欲下降、射精量减少等。且以上两种药物起效慢,需长期服用,并且价格昂贵,一般患者难以承受。因此,寻求费用低、安全有效的治疗方法非常必要。中医药在治疗bph方面积累了丰富的经验。近年来,中药治疗bph的研究日益受到重视。主要有:单味中药治疗,中草药复方制剂,中药特殊疗法,以及植物类药物及花粉提取物的治疗。尤其是具有补肾活血作用的中草药和中药复方较多地被用于临床。本课题的研究对象是益肾克癃方,其来源于名老中医的临床验方。由马鞭草、玄参、丹参、生首乌等药组成。马鞭草味苦性凉,入肝、脾、肾经,具有活血消淤、清热解毒及利水消肿的功能5。玄参为君药,其活性成分具有补肾虚、泻火、改善微循环和毛细血管通透性、保肝及免疫促进等功能6。臣药丹参主要活性成分具有抗心血管疾病、治疗肝肾疾病、抗呼吸系统疾病、抗肿瘤、影响免疫、抗氧化等作用7。臣药何首乌具有抗衰老、降血脂、降低血小板与红细胞聚集、抗炎、镇痛等作用8。临床应用表明,本方治疗前列腺增生有显著的疗效,并能改善由前列腺增生引起的并发症。本课题组将通过药理学实验,对益肾克癃方的药效学进行验证,并在此基础上初步探讨其抗前列腺增生作用的作用机理,以期为益肾克癃方的进一步研究和前列腺增生症的治疗提高可靠的依据。第一部分 益肾克癃方抗实验性小鼠前列腺增生作用的研究一 材料与方法(一)实验动物健康清洁级雄性icr小鼠 ( 18 22 g )由浙江中医药大学实验动物中心提供,动物合格证号:scxk(浙)2003-0001(二)药材与化学试剂1 药材马鞭草:药材购自浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定为马鞭草科植物马鞭草verbena officinalis l.的地上部分,符合中国药典2005版一部有关项下的要求。玄参:药材购自浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定为玄参科植物玄参scrophularia ningpoensis hernsl.的干燥根,符合中国药典2005版一部有关项下的要求。 何首乌:药材购自浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定为蓼科植物何首乌polygonum multiflorum thunbl.的干燥块根,符合中国药典2005版一部有关项下的要求。处方中其他药材均购自浙江浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定均符合中国药典2005版一部有关项下的要求。2 药品与化学试剂爱普列特(epristeride tablets),江苏联环药业股份有限公司,批号:20100901丙酸睾酮注射液(tp),上海通用药业股份有限公司,批号:10040195%乙醇(分析纯),杭州长征化工厂,批号:20051014氯化钠(分析纯),上海试四赫维化学试剂有限公司,批号:081014酸性磷酸酶(acp)试剂盒,上海复星长征医学科学有限公司,批号:p100550橄榄油(分析纯),国药集团化学试剂有限公司,批号:f20070625(三)实验仪器电子天平:ab104-n型,瑞士mettler toledo公司离心机:80-2b型,上海安亭科学仪器厂自动双重纯水蒸馏器,d1810c,上海申胜生物科技有限公司电子调温电热套:98-1-b型,天津市泰斯特仪器有限公司半自动生化仪:738plus型,上海安泰分析仪器有限公司旋转蒸发仪:bchi rotavapor r-200型,瑞士bchi公司旋转蒸发仪:bchi rotavapor r-220型,瑞士bchi公司senco-w201恒温水浴锅:上海申生科技有限公司ahz-d循环水式真空泵:巩义市英峪予华仪器厂dlsb-10130低温冷却循环泵:巩义市京华仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱:dhg-9140型,上海一桓科技有限公司超声波清洗器:kq5200,昆山市超声仪器有限公司小鼠灌胃器、1ml注射器、烧杯、量筒等(四)实验方法1 药物的制备(1)取三个处方量药材,加12倍量的水,提取三次,每次1小时,过滤,滤液减压浓缩至一定浓度,加入95%乙醇至乙醇浓度为60%,放置12小时后,滤过,滤液减压浓缩至无醇味后,加水稀释至一定浓度。(2)爱普列特50mg,加水至200ml,配成0.25mg/ml的溶液。(3)丙酸睾丸酮注射液(25mg/ml)10ml,加橄榄油至100ml,配成2.5mg/ml的溶液。2 动物分组、造模9和给药60只icr小鼠常规饲养熟悉一周后,按体重随机分为5组,每组12只;模型组、阳性组和2个剂量组小鼠每日皮下注射丙酸睾酮的橄榄油溶液5 mg/kg进行造模,连续21天;同时灌胃给药:阳性对照组灌胃给予爱普列特105 mg/kg,高剂量组灌胃给予水提醇沉样液39g/kg,低剂量组灌胃给予水提醇沉样液19.5g/kg,同时空白组和模型组灌胃给予生理盐水,1次/d,连续21d。 3 观察指标及测定方法 (1)小鼠一般情况的观察每天观察小鼠的一般情况,包括饮食变化,行为(自主活动,精神状态),毛发变化及排尿情况。(2)对小鼠前列腺湿重及指数的测定于末次次给药24h后,摘眼球取血,并立即摘取前列腺,称得湿重,测定各组的前列腺湿重和前列腺指数(前列腺重量/小鼠体重1000)。(3)血清中总酸性磷酸酶(acp)水平的测定11 取血后静置30min,血液凝固后,于4000转/分离心10分钟,取上层血清,按试剂盒操作,应用半自动生化仪测定acp水平。酸性磷酸酶a:测定原理磷酸萘酚 + 水 萘酚 + 磷酸萘酚 + 固红tr 重氮色素上述反应中,重氮色素的生成速率与样本中酸性磷酸酶活力成正比。通过在405nm处监测吸光度的上升速率,即可测得样本中酸性磷酸酶的活力。b:计算方法:酸性磷酸酶(u/l)=(a/mintv1000)/(12.9svp)式中 a/min=每分种半自动生化仪读出吸光度值的差值 tv=总反应体积(ml) sv=样本体积(ml) 12.9=重氮色素在405nm处的毫摩尔吸光系数 p=比色杯光径(cm)4 统计学处理数据以 s表示,用t-test检验差异的显著性。二 结果(一)小鼠的一般情况空白组小鼠较温顺,毛色光泽;模型组与各给药组部分小鼠毛发蓬松,且有部分出现皮肤肿胀(连续皮下给予丙酸睾酮所致);从垫料的干湿程度观察,模型组和给药组较空白组湿得快,且模型组较给药组湿得快;进食量及饮水量各组间无明显区别。(二)对小鼠前列腺湿重及前列腺指数的影响结果表明,与空白组比较,前列腺湿重和前列腺指数有显著性差异(p0.05),说明造模成功;与模型组比较,益肾克癃方水提醇沉样液高剂量组和低剂量组前列腺湿重和前列腺指数均有下降,其中高剂量组差异具有显著性差异(p0.05)。详见表1-1。表明益肾克癃方有抗前列腺增生的作用。表1-1 对小鼠前列腺湿重及前列腺指数的影响( s,n=12)组别剂量(g/kg)最初体重(g)最后体重(g)前列腺湿重(mg)前列腺指数(mg/g)空白组24.101.7332.671.8582.378.512.520.24模型组25.471.0132.871.70104.9812.59*3.200.40*爱普列特组0.00523.900.7332.321.34100.2117.82*3.120.56*高剂量组3925.251.6834.241.8590.9320.11#2.660.59#低剂量组19.524.540.9632.901.4895.9820.85*2.930.74*注:与空白组比较,*p0.05,* p0.01;与模型组比较,#p0.05,# p0.01(三)对小鼠血清中总酸性磷酸酶(acp)水平的影响实验动物血液中acp的组织来源为前列腺、脾、肝、胃、肾、红细胞、白细胞、血小板,但前列腺acp含量高于其他组织数百倍。结果表明,与模型组比较,益肾克癃方水提醇沉样液高剂量组和低剂量组血清中acp水平均有明显下降(p0.05)。详见表1-2。表1-2 对小鼠血清中acp的影响( s,n=12)组别剂量(g/kg)acp(u/l)空白组3.381.24模型组4.150.97爱普列特组0.0052.950.80#益肾克癃方高剂量组392.771.00#益肾克癃方低剂量组19.53.330.92#注:与模型组比较,#p0.05,# p0.01 三 分析与讨论良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia,bph),是中老年男性的一种常见疾病,发病率随年龄增大而升高。据报道50岁以上男性bph发病率超过50%,病理性bph发病率几乎达标100%12。关于bph的治疗分为药物治疗、手术治疗和非手术介入治疗。药物治疗主要是针对尿路梗阻的两大因素即动力因素和静力因素,从而减轻或缓解bph患者的病情,药物治疗可分为-受体阻断剂,雄激素抑制剂及其他药物等。一般来说-受体阻断剂主要用于前列腺腺体、前列腺包膜及膀胱颈部的平滑肌肌张力增加引起的不同程度的梗阻症状即动力因素。而雄激素抑制剂例如5-还原酶抑制剂主要用于因前列腺体积增大引起的bph即静力因素。爱普列特为选择性的和非竞争性的类固醇型5-还原酶抑制剂,用于治疗良性前列腺增生症,其作用机理是通过抑制睾酮转化为双氢睾酮而降低前列腺腺体内双氢睾酮的含量,导致增生的前列腺萎缩。但其不良反应较多,可见恶心、食欲减退、腹胀、腹泻、口干、头晕、失眠、全身乏力、皮疹、性欲下降、勃起功能障碍、射精质量下降、耳鸣、耳塞、髋部痛等。中药在治疗前列腺增生方面积累了丰富的经验,在辨证审因的基础上选择合适的药物,并按照一定的配伍组成原则组成的复方具有化学成分多样、药理作用多层次多靶点的特点,使其不仅对前列腺增生症有显著的疗效,还能改善由前列腺增生引起的并发症。前列腺增生症是由前列腺组织病理性增大而导致的疾病,正常人体前列腺横径约4厘米,纵径约3厘米,前后径2厘米,前列腺重量约20克。当发生前列腺增生时,前列腺的体积变大,横径、纵径及前后径均有不同程度的增大,重量增加至40克以上,有的可达200克。随着前列腺体积的增大,压迫膀胱及尿道,产生排尿困难,尿频,尿潴留等症状13。选择测量前列腺组织的湿重、指数,可以直观地显示出前列腺组织增大的情况。益肾克癃方高、低剂量组与模型组比较,能明显抑制实验小鼠前列腺的增生,前列腺湿重和前列腺指数显著降低,同时能显著降低模型小鼠血清中酸性磷酸酶的水平。四 小结本实验采用丙酸睾丸酮诱导形成实验性小鼠前列腺增生模型,以前列腺湿重、前列腺指数和血清中acp为评价指标,对益肾克癃方的疗效进行初步评价。结果表明益肾克癃方具有较好的抗实验性小鼠前列腺增生作用,能显著降低模型小鼠前列腺湿重、前列腺指数和血清中acp水平。第二部分 益肾克癃方抗去势大鼠前列腺增生作用及其作用机制初步研究实验一 益肾克癃方抗去势大鼠前列腺增生作用研究一 材料与方法(一)实验动物健康清洁级雄性sd大鼠 ( 180 220 g ),由浙江中医药大学实验动物中心提供,动物合格证号:scxk(浙)2003-0001(二)药材与化学试剂1 药材马鞭草:药材购自浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定为马鞭草科植物马鞭草verbena officinalis l.的地上部分,符合中国药典2005版一部有关项下的要求。玄参:药材购自浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定为玄参科植物玄参scrophularia ningpoensis hernsl.的干燥根,符合中国药典2005版一部有关项下的要求。 何首乌:药材购自浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定为蓼科植物何首乌polygonum multiflorum thunbl.的干燥块根,符合中国药典2005版一部有关项下的要求。处方中其他药材均购自浙江浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定均符合中国药典2005版一部有关项下的要求。2 药品与化学试剂爱普列特(epristeride tablets),江苏联环药业股份有限公司,批号:20100901丙酸睾酮注射液(tp),上海通用药业股份有限公司,批号:100401普乐安胶囊(前列康),浙江康恩贝制药股份有限公司,批号:10061595%乙醇(分析纯),杭州长征化工厂,批号:20051014氯化钠(分析纯),上海试四赫维化学试剂有限公司,批号:081014酸性磷酸酶(acp)试剂盒,上海复星长征医学科学有限公司,批号:p100550橄榄油(分析纯),国药集团化学试剂有限公司,批号:f20070625水合氯醛(分析纯),上海试四赫维化学试剂有限公司,批号:071014注射用青霉素钠,江西东风药业股份有限公司,批号:100302-2氯化钠注射液,杭州民生药业集团有限公司,批号:40908274甲醛溶液(分析纯),衢州巨化试剂有限公司,批号:20080403 (三)实验仪器电子天平:ab104-n型,瑞士mettler toledo公司离心机:80-2b型,上海安亭科学仪器厂自动双重纯水蒸馏器,d1810c,上海申胜生物科技有限公司电子调温电热套:98-1-b型,天津市泰斯特仪器有限公司半自动生化仪:738plus型,上海安泰分析仪器有限公司旋转蒸发仪:bchi rotavapor r-200型,瑞士bchi公司旋转蒸发仪:bchi rotavapor r-220型,瑞士bchi公司冰箱:hr-231cry型,杭州华日电冰箱有限公司senco-w201恒温水浴锅:上海申生科技有限公司ahz-d循环水式真空泵:巩义市英峪予华仪器厂dlsb-10130低温冷却循环泵:巩义市京华仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱:dhg-9140型,上海一桓科技有限公司超声波清洗器:kq5200,昆山市超声仪器有限公司大鼠灌胃器、5ml注射器、烧杯、量筒等(四)实验方法1 药物的制备(1)取23个处方量药材,加12倍量的水,提取三次,每次1小时,过滤,滤液减压浓缩至一定浓度,加入95%乙醇至乙醇浓度为60%,放置12小时后,滤过,滤液减压浓缩至无醇味后,加水稀释至一定浓度。(2)爱普列特500mg,加水至1000ml,配成0. 5mg/ml的溶液。(3)前列康70g,加水至1000ml,配成0.07g/ml的溶液。(4)丙酸睾丸酮注射液(25mg/ml)120ml,加橄榄油至1200ml,配成2.5mg/ml的溶液。2 动物分组、造模14和给药70只sd大鼠常规饲养熟悉一周后,选取10只作为空白组,其余60只造模,每只腹腔注射10%的水合氯醛溶液0.7ml,常规消毒皮肤,于无菌条件下,空白组做假手术处理,造模组经阴囊摘除双侧睾丸,残端处结扎,以确保止血,缝合皮肤,肌肉注射青霉素20万u/kg。选取造模后的大鼠50只,随机分为5组,分别为模型组、爱普列特组、前列康组、益肾克癃方高剂量组、益肾克癃方低剂量组。从去势第8天起,造模组大鼠每日皮下注射丙酸睾酮的橄榄油溶液5 mg/kg/d,连续30天;从去势第8天起,爱普列特组灌胃给予爱普列特5 mg/kg,前列康组灌胃给予0.7g/kg,高剂量组灌胃给予水提醇沉样液29.3g/kg,低剂量组灌胃给予水提醇沉样液14.6g/kg,同时空白组和模型组灌胃给予生理盐水,1次/d,连续30d。 3 实验评价指标及测定方法 (1)大鼠一般情况的观察每天观察大鼠的一般情况,包括饮食变化,行为(自主活动,精神状态),毛发变化及排尿情况。(2)大鼠前列腺湿重及指数的测定于末次次给药24h后,内眦眼眶取血,并立即摘取前列腺,称得湿重,测定各组的前列腺湿重和前列腺指数(前列腺重量/大鼠体重1000)。(3)血清中总酸性磷酸酶(acp)和前列腺特异性酸性磷酸酶(pacp)含量的测定取血后静置30min,血液凝固后,4000 rpm / min 离心 20 min,取上层血清,按试剂盒操作,应用半自动生化仪测定acp水平。测定原理及计算方法同测定小鼠血清中酸性磷酸酶相同。再用l-酒石酸法比色测定非前列腺特异性酸性磷酸酶(npap),前列腺特异性酸性磷酸酶(pap)=acp-npap11,15。(4)前列腺组织he染色观察及增生程度评分将取下的前列腺组织,用福尔马林(10%的甲醛溶液)固定,4冰箱保存,石蜡包埋,切片,厚4m,经苏木精-伊红染色(he染色)后光镜观察前列腺组织细胞结构变化。并进行增生等级评分(未见增生为0分,可见增生则按照明显程度分为0.5、1、1.5、2、2.5、3分,增生越明显则分值越大)。(5)腺体上皮细胞高度及腺腔皱褶指数的测定 将腺体组织切片在放大100倍的显微镜下各随机取三个视野进行拍照,结合motic软件对照片测量分析,计算大鼠前列腺腺体的上皮细胞高度(腺管面积-腺腔面积)/腺管周长和腺腔皱褶指数(腺腔周长/腺腔面积1000)。4 统计学处理数据以 s表示,用t-test检验差异的显著性。二 结果(一)大鼠的一般情况刚刚做完手术后大鼠状态较差,但恢复一周后状态良好,其中空白组大鼠较温顺,毛色光泽;模型组与各给药组部分大鼠毛发蓬松,且有部分出现皮肤肿胀(连续皮下给予丙酸睾酮所致);从垫料的干湿程度观察,模型组和给药组较空白组湿的快,且模型组较给药组湿得快;进食量及饮水量各组间无明显区别。(二)对去势大鼠前列腺湿重及前列腺指数的影响结果表明,与空白组比较,爱普列特组、前列康组、2个剂量组前列腺湿重和前列腺指数均有显著性差异(p0.05),说明造模成功;与模型组比较,益肾克癃方水提醇沉样液高剂量组和低剂量组前列腺湿重和前列腺指数均有明显下降,且差异均具有显著性差异(p0.05)。详见表2-1。表明益肾克癃方有抗前列腺增生的作用。表2-1 对去势大鼠前列腺湿重及前列腺指数的影响( s,n=11)组别剂量(g/kg)最初体重(g)最后体重(g)前列腺湿重(g)前列腺指数(mg/g)空白组274.08.1359.524.30.56850.06741.590.30模型组217.710.7351.714.91.12690.0369*3.210.34*爱普列特组0.005261.111.9345.219.00.92570.0462*,#2.680.34*,#前列康组0.7265.99.4343.719.30.88580.0967*,#2.580.50*,#高剂量组29.3265.28.5315.219.10.84340.0097*,#2.680.26*,#低剂量组14.6264.59.1338.518.20.93800.1080*,#2.780.41*,#注:与空白组比较,*p0.05,* p0.01;与模型组比较,#p0.05,# p0.01(三)对去势大鼠血清中总酸性磷酸酶(acp)水平和前列腺特异性酸性磷酸酶(pacp)水平的影响实验动物血液中acp的组织来源为前列腺、脾、肝、胃、肾、红细胞、白细胞、血小板,但前列腺acp含量高于其他组织数百倍。结果表明,与模型组比较,益肾克癃方水提醇沉样液高剂量组血清中acp水平均有明显下降(p0.05);益肾克癃方水提醇沉样液高剂量组血清中pacp水平明显下降(p0.05)。详见表2-2。表2-2 对去势大鼠血清中acp和pacp水平的影响( s,n=11)组别剂量(g/kg)acp(u/l)pacp(u/l)空白组12.431.926.551.87模型组14.932.7011.803.61*爱普列特组0.00514.292.099.291.85*前列康组0.714.662.338.531.92高剂量组29.39.531.58*,#6.853.72#低剂量组14.612.671.90*8.331.72注:与空白组比较,*p0.05,* p0.01;与模型组比较,#p0.05,# p0.01(四)对去势大鼠前列腺组织切片光镜下形态学的影响空白组前列腺腺腔正常大小,腔内表面光滑,腺上皮细胞呈立方型或短柱型(见附图1a)。模型组前列腺腺体排列紧密,腺腔大小不一,大部分腺体基本完整,锯齿样扩张明显,大部分呈乳头状突向腺腔内,腔内可见粉染物质,上皮细胞以透亮细胞为主,呈柱状复层或假复层,至少两层以上 (见附图1b)。益肾克癃方高剂量组(见附图1c)、益肾克癃方低剂量组(见附图1d)爱普列特组(见附图1e)、前列康组(见附图1f)、部分或小部分腺腔变大,腺体小部分呈锯齿状扩张及乳头状增生,腺上皮细胞多为单层柱状,兼有高柱状及短柱状。增生程度等级评分的结果见表2-3。表2-3 对去势大鼠前列腺组织增生程度的影响( s,n=11)组别剂量(g/kg)动物数(只)增生程度评分(分)0分0.5分1分1.5分2分2.5分3分空白组14220000.780.51模型组00331211.750.72*爱普列特组0.00502540001.090.38#前列康组0.701441001.250.42*高剂量组29.311431001.100.57#低剂量组14.602351001.230.47注:与空白组比较,*p0.05,* p0.01;与模型组比较,#p0.05,# p0.01(五)对去势大鼠腺体上皮细胞高度及腺腔褶皱指数的影响实验结果表明,与模型组比较,爱普列特组、益肾克癃方高剂量组上皮细胞高度和腺腔褶皱指数均有明显下降(p0.05)。详见表2-4表2-4 对去势大鼠上皮细胞高度及腺腔皱褶指数的影响( s,n=11)组别剂量(g/kg)上皮细胞高度(m)腺腔褶皱指数(10-3/m)空白组74.1410.3711.693.64模型组89.3410.46*12.175.34*爱普列特组0.00567.649.90#9.212.44#前列康组0.785.4617.6611.283.85高剂量组29.367.9410.83#10.653.25#低剂量组14.683.3024.4911.194.78注:与空白组比较,*p0.05,* p0.01;与模型组比较,#p0.05,# p0.01三 分析与讨论(一)前列腺增生模型的选择前列腺形态和机能的维持依赖于雄激素,故大鼠去势后由于睾酮的分泌障碍可导致前列腺组织的萎缩,而在人为注射睾酮后继续生长,而且与剂量大小和时间长短有密切关系16,17。因此本实验采用大鼠睾丸切除术后,注射睾酮的方法诱导建立大鼠前列腺增生模型。(二)对酸性磷酸酶(acp)和前列腺特异性酸性磷酸酶(pacp)的影响 酸性磷酸酶增高常见于前列腺癌、前列腺增生、前列腺炎等疾病。人体中有4种形式的acp,来源于红细胞、溶酶体、破骨细胞及前列腺。淋巴细胞、血小板所含的acp与溶酶体型相似;粒细胞、胰腺所含的acp与前列腺acp相似;高雪氏细胞、多毛白血病细胞、巨细胞骨癌细胞所含的acp与破骨细胞acp型相似。血液中的acp的组织来源为前列腺、脾、肝、胃、肾、红细胞、白细胞、血小板,但前列腺acp含量高于其他组织数百倍。所以一般血清总acp增高与pacp增高是一致的,但为排除其他原因引起的增高,在总acp增高时测pacp是必要的。益肾克癃方主要由玄参、丹参、何首乌、淫羊藿等组成,临床研究表明,治疗前列腺增生症有很好的疗效。本实验进一步研究表明该中药复方能够抑制实验性前列腺增生大鼠模型血清acp和pacp活性的升高。由于血清中pacp主要来自前列腺组织,故血清中pacp活性的变化可以反应前列腺状态15。前列腺组织增生加强,血清中acp和pacp升高。实验显示高剂量和低剂量益肾克癃方可明显抑制血清acp和pacp升高,因而说明益肾克癃方对前列腺组织生长的抑制作用,而且实验结果益肾克癃方的作用优于阳性药爱普列特和前列康。(三)对前列腺组织的影响 前列腺的主要组织成分为腺体和间质,腺体为复合管泡状腺,间质由平滑肌、纤维基质、血管、神经等组织构成18。前列腺增生是由间质和上皮依不同比例混合增生的疾病,又分为基质增生、纤维肌肉增生、肌肉增生、纤维腺瘤增生、腺瘤样增生,其中以纤维肌肉腺瘤增生最为常见19。本研究采用sd大鼠去势后皮下注射丙酸睾丸酮法复制前列腺增生模型,显微镜下及形态定量学均表明:丙酸睾丸酮所致去势大鼠前列腺组织的腺体与间质组织均增生,而以腺体增生为主,主要表现为腺腔扩张、体积增大、腺上皮数目增多,这与人增生前列腺组织的病理变化相似。本研究发现:益肾克癃方治疗一个月,增生的腺上皮乳头减少或消失,前列腺上皮细胞萎缩,高度降低,变得较为扁平及腺体萎缩,间质减少。应用形态计量学对bph大鼠及正常大鼠前列腺组织的h.e.染色切片,进行半定量分析结果表明:模型组大鼠前列腺组织上皮细胞高度和腺腔褶皱指数比正常对照组均明显增高,提示大鼠前列腺增生主要是因前列腺腺体的扩张、体积的增大所致。益肾克癃方治疗组则使增生腺体萎缩,上皮细胞高度和腺腔褶皱指数变小,这些提示:益肾克癃方可抑制前列腺组织结构性变化,有明显的抗bph的作用,益肾克癃方高剂量组与爱普列特组比较,两者效应相似。四 小结本实验采用丙酸睾丸酮诱导去势大鼠形成前列腺增生模型,以大鼠前列腺湿重、前列腺指数、血清acp和pacp以及前列腺组织形态学的改变为指标,对益肾克癃方抗大鼠前列腺增生作用进行了评价。结果表明:1、益肾克癃方具有明显的抗前列腺增生作用,不仅能显著降低模型大鼠前列腺指数和前列腺湿重,而且能显著降低模型大鼠血清中acp和 pacp的含量。其中益肾克癃方高剂量组(29.3g/ kg)无论是在降低前列腺湿重还是在降低血清中acp和pacp的水平中效果均优于阳性药爱普列特(0.005 g/ kg)及前列康(0.7 g/ kg)。2、益肾克癃方对模型大鼠前列腺组织形态学的改变具有明显的改善作用,其中益肾克癃方高剂量组的效果与阳性药爱普列特相似。实验二 益肾克癃方对去势大鼠前列腺增生作用机制及并发症相关指标的初步研究一 材料与方法(一)实验动物健康清洁级雄性sd大鼠 ( 180 220 g ),由浙江中医药大学实验动物中心提供,动物合格证号:scxk(浙)2003-0001(二)药材与化学试剂1 药材马鞭草、玄参、何首乌等处方中药材均购自浙江浙江中医药大学中药饮片厂,经浙江中医药大学张如松教授鉴定均符合中国药典2005版一部有关项下的要求。2 药品与化学试剂大鼠睾酮(t)elisa测定试剂盒:上海卓康(hyperheal)生物科技有限公司大鼠雌二醇(e2)elisa测定试剂盒,上海卓康(hyperheal)生物科技有限公司丙二醛(mda)试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号:20101220一氧化氮(no)试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号:20101215考马斯亮兰蛋白测得试剂盒:南京建成生物工程研究所其余药品和试剂同第二部分实验一(三)实验仪器超低温冰箱:forma -86c 型,therom 公司培养箱:series water jacketed co2 incubator,therom 公司酶标仪:m680型,bio-rad公司紫外可见分光光度计:ultrospec 3300pro型,amersham公司可调微量加样枪:thermo公司其他仪器设备同第二部分实验一(四)实验方法1 药物的制备同第二部分实验一2 动物分组、造模和给药同第二部分实验一3 实验评价指标及测定方法 (1)大鼠血清中睾酮(t)、雌二醇(e2)、t/e2水平的测定于末次次给药24h后,内眦眼眶取血,取血后静置30min,血液凝固后,于4000转/分离心20分钟,取上层血清测定t及e2含量。再计算出t/e2的水平。睾酮(t)测定原理:采用竞争法酶联免疫吸附试剂盒测定。试剂盒中将抗ne抗体包被在微孔板上,酶联亲和物中含有标记了过氧化物酶的ne。实验过程中,标准品、待测样本中的ne与标记有酶联亲和物的ne共同竞争反应板上包被的抗ne抗体的定量结合位点。反应后冲洗掉为结合的部分,再加入底物反应,底物在酶的作用下变为蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。通过比较待测样本与ne标准品的吸光度,可准确测得样本中的t含量。实验过程:参考试剂盒说明书,按下列步骤进行:试验前将试剂盒及待测标本放置室温18-28平衡30min以上;取出预包被抗体的微孔板,设立空白孔,依序加入100l的标准品;样品编号,依序加入100l的样品上清液;在标准品孔及待测样本孔中分别加入50l酶联亲和物,充分混匀;37温浴60min后,充分弃尽各孔内液体,用稀释好的洗涤液(1:10倍蒸馏水稀释)反复冲洗5次并扣干孔内剩余水分;每孔依照次序,分别加入显色液a、显色液b各50l,充分混匀,在室温下避光反应15min; 反应过后(正常情况下应为蓝色并带有明显的梯度)每孔加入50l的终止液,轻轻振荡后充分混匀(正常情况下应转变为黄色),终止反应;显色反应后在30min内于酶标仪450nm处测定od值;根据标准曲线,计算t的含量。雌二醇(e2)的测定原理和实验过程同睾酮(t)。(2)大鼠前列腺组织中丙二醛(mda)和一氧化氮(no)含量的测定1) 硝酸还原酶法测定大鼠前列腺组织中no的含量硝酸还原酶法测定组织中no的含量测定主要分两步进行。第一步,测定组织中no的吸光度;第二步,测定组织的蛋白含量。然后根据下式计算no的含量:no含量=(mol/gprot)测定管吸光度-空白管吸光度标准管吸光度-空白管吸光度标准品浓度(20mol/l*)样本的蛋白含量(gprot/l)(20mol/l) 注:*测定时标准管中加入0.4ml蒸馏水及0.1ml的100mol/l kno3标准液,相当5倍稀释,所以此处标准浓度为20mol/l。 组织中no吸光度的测定样本准备:取大鼠前列腺组织,置于玻璃匀浆管中,加入适量的冰的生理盐水进行匀浆,充分研磨,使脑组织匀浆化,制成10%的组织匀浆液,匀浆液2000rpm,离心10min,取上清,用以测定组织中no的吸光度。另取10l脑组织匀浆上清液用生理盐水按1:9稀释成1%的组织匀浆液,用以测定组织蛋白含量。测定原理:no的化学性质活泼,在体内代谢很快转化为硝酸盐(no3-)和亚硝酸盐(no2-),而no2-很快转化为no3-,本法利用硝酸还原酶特异性将no3-还原为no2-,通过显色深浅测定其浓度高低。实验过程:试剂及其配制按试剂盒说明书进行,按下列表格进行操作:空白管标准管测定管双蒸水(ml)0.50.4100mol/l标准应用液(ml)0.1样本(ml)0.5混合试剂(ml)0.40.40.4混匀,37准确水浴60min试剂三(ml)0.20.20.2试剂四(ml)0.10.10.1充分旋涡混匀30s,室温静置40min,3500-4000r/min,离心10min,取上清显色上清(ml)0.80.80.8显色剂(ml)0.60.60.6混匀,室温静置10min,蒸馏水调零,550nm,0.5cm光径,测各管吸光度值 考马斯亮兰法测定组织的蛋白含量测定原理:蛋白质分子具有-nh3+基团,当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时,考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白nh3+结合,使溶液变为蓝色,通过测定吸光度可计算出蛋白含量。实验过程:试剂及其配制按试剂盒说明书进行,按下列表格进行操作:空白管标准管测定管蒸馏水(ml)0.050.563g/l标准液(ml)0.05样品(ml)0.05考马斯亮兰显色剂(ml)3.03.03.0混匀,静置10min,于595nm处,1cm光径,蒸馏水调零,测定各管吸光度值,并按下式计算蛋白含量(g/l)蛋白含量(g/l)=测定管吸光度-空白管吸光度标准管吸光度-空白管吸光度标准管浓度(g/l)2)大鼠前列腺组织中mda的含量组织中mda的含量测定主要分两步进行。第一步,测定组织中mda的吸光度;第二步,测定组织的蛋白含量。然后根据下式计算mda的含量:mda含量=(nmol/mgprot)测定管吸光度-空白管吸光度标准管吸光度-空白管吸光度标准品浓度(20nmol/l*)样本的蛋白含量(mgprot/ml)(20mol/l) 组织中mda吸光度的测定样本准备:同1)部分中组织中no吸光度的测定中的样本准备测定原理:过氧化脂质降解产物中的丙二醛(mda)可与硫代巴比妥酸(tba)* 缩合,形成红色产物,在532nm处有最大吸收峰。* 因底物为硫代巴比妥酸(thibabituric acid tba)所以此法称tba法。实验过程:试剂及其配制按试剂盒说明书进行,按下列表格进行操作:标准管标准空白管测定管测定空白管10nmol/ml标准品(ml)0.1无水乙醇(ml)0.1测试样品(ml)0.10.1试剂一(ml)0.10.10.10.1混匀(摇动几下试管架)试剂二(ml)3333试剂三(ml)11150%冰醋酸(ml)1漩涡混匀器混匀,试管口用保鲜膜扎紧,用针头刺一小孔,95水浴40min,取出后流水冷却,然后3500转/分,离心10分钟。取上清液,532nm处,1cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度值。(3)大鼠精囊湿重及其指数的测定:末次给药24小时后,准确称取大鼠体重后,处死大鼠,打开腹腔,取出精囊,称其湿重。以两侧精囊总湿重/体重得出大鼠精囊指数。(4)肾指数和肝指数的测定:末次给药24小时后,准确称取大鼠体重后,处死大鼠,打开腹腔,取出肾脏和肝脏,分别称其湿重。以两肾总湿重/体重得出大鼠肾指数,以肝总湿重/体重得出大鼠肝指数。(5)肾he染色:肾组织取出后,浸泡于福尔马林中,石蜡包埋,切片,苏木伊红染色。4 统计学处理数据以 s表示,用t-test检验差异的显著性。二 结果(一)对去势大鼠血清中睾酮(t)、雌二醇(e2)的影响 从下表可以看出,与空白组相比,模型组血清中睾酮的含量显著升高(p0.01),可能去皮下注射丙酸睾丸酮注射液有关,而雌二醇水平与空白组相比差异无统计学意义,表明在去势条件下,通过皮下注射丙酸睾丸酮注射液,可使大鼠体内睾酮含量显著升高,而对雌二醇水平无明显影响,使大鼠的前列腺组织在外源性雄激素的作用下出现增生。与模型组相比,爱普列特组、前列康组、益肾克癃方高剂量组均可显著降低模型大鼠血清中的睾酮水平(p0.01),益肾克癃方高剂量组大鼠血清中雌二醇水平与模型组相比显著降低(p0.01),与空白组相比也显著降低(p0.05)。实验结果提示益肾克癃方抑制模型大鼠前列腺增生作用机制可能与其降低雄激素、雌激素水平有关,使模型大鼠体内严重失衡的雌、雄激素比例得到改善,从而发挥抗前列腺增生作用。睾酮(t)的标准曲线:y=-3.4848x+0.2847 r2=0.9976雌二醇(e2)的标准曲线:y=-2.017x+5.842 r2=0.9799表2-5 对去势大鼠血清中睾酮(t)、雌二醇(e2)的影响( s,n=11)组别剂量(g/kg)睾酮(t,ng/ml)雌二醇(e2,pg/ml)空白组1.130.10456.0691.64模型组1.220.09*588.98142.04爱普列特组0.0051.070.07#541.9586.82前列康组0.70.960.08#461.69140.85高剂量组29.30.940.08*,# 304.90105.70*,#低剂量组14.61.110.18482.73132.75注:与空白组比较,*p0.05,* p0.01;与模型组比较,#p0.05,# p0.05),且爱普列特组、前列康组、益肾克癃方高、低剂量阻与模型组、空白组比较也无显著性差异(p0.05)。提示前列腺增生并未引起前列腺组织的过氧化伤害。模型组与空白组相比大鼠前列腺组织中no含量有显著性差异(p0.05),且爱普列特组、前列康组、益肾克癃方高、低剂量组剂量组与模型组比较也有显著性差异(p0.05)。提示丙酸睾丸酮致去势大鼠前列腺增生的过程中对大鼠前列腺组织有损害作用,益肾克癃方可对抗这种伤害,并且益肾克癃方高、低剂量组的对抗作用均强于阳性对照药爱普列特、前列康。表2-6 对去势大鼠前列腺组织中mda和no的影响( s,n=11)组别剂量(g/kg)mda(mol/gprot)no(mol/gprot)空白组1.2990.24732.2271.0223模型组1.1670.14693.5361.3265*爱普列特组0.0051.1610.17681.4820.6982#前列康组0.71.2090.19742.1970.5683#高剂量组29.31.1920.20210.6360.2126*,#低剂量组14.61.2690.45401.1220.6977*,#注:与空白组比较,*p0.05,

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