联合信号转导和转录激活因子3与热_省略_白90鉴别良恶性嗜铬细胞瘤的探讨

联合信号转导和转录激活因子 3 与热休克蛋白 90 鉴别良恶性嗜铬细胞瘤的探讨 徐云泽 1，2 祝宇 1 陈东宁 1 朱奇 1 张翀宇 1 沈周俊 1 赵菊平 1 黄翼然 2 (1 上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科,上 海 200025;2 上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿 外科, 上 海 200000) 摘要 目的：通过检测热休克蛋白 90（HSP90）与信号转导和转录激活因子 3（STAT3）在良恶性肾上腺嗜铬 细胞瘤中的表达情况，探讨 HSP90 和 STAT3 在早期诊断恶性嗜铬细胞瘤中的价值。方法：采用免疫组织化 学技术检测 94 例良恶性肾上腺嗜铬细胞瘤组织标本中 HSP90 和 STAT3 的表达差异，同时用蛋白免疫印 迹法检测 24 例手术标本中 HSP90 和 STAT3 的表达差异，并分析两者联合诊断恶性嗜铬细胞瘤的效用。结 果：HSP90 和 STAT3 在恶性嗜铬细胞瘤中阳性表达率分别为 66.67和 83.33，在良性嗜铬细胞瘤中的阳 性表达率分别为 22.37和 26.32，在正常肾上腺髓质组织中无表达，恶性嗜铬细胞瘤组与良性嗜铬细胞 瘤组之间 HSP90 和 STAT3 的表达均存在显著性差异（P0.001，P0.001）；Western Blot 分析结果显示 HSP90 和 STAT3 在恶性嗜铬细胞瘤中的蛋白表达水平远高于良性嗜铬细胞瘤。联合 HSP90 和 STAT3 诊 断恶性嗜铬细胞瘤时阳性预测值为 0.70。结论：HSP90 和 STAT3 在恶性嗜铬细胞瘤中的表达高于良性嗜铬 细胞瘤组织，且联合 HSP90 和 STAT3 可有效诊断恶性嗜铬细胞瘤。 关键词 嗜铬细胞瘤；热休克蛋白 90；信号转导和转录激活因子-3；阳性预测值 中图分类号 R736.6 文献标识码 A Expression of heat shock protein 90and signal transducer and activator of transcription 3in malignant pheochromocytoma Xu Yunze1,2,ZHU Yu1,CHEN Dongning1,ZHU Qi1 et al （1 Department of Urology，Ruijin Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University ，Shanghai，200025，China；2 Department of Urology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University） Abstract Objective:To evaluate heat shock protein 90（HSP90）and signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）as tissue-based markers to predict malignant pheochromocytoma（PCC）.Method：We compared the expression of HSP90and STAT3of benign and malignant PCCs by immunohistochemical analysis and western immunoblot.Result：The expression of HSP90and STAT3in malignant PCC was found to be higher than in benign tumors and normal adrenal tissues.Using both HSP90and STAT3，the positive predictive value of malignancy was significantly increased to 0.70，compared with 0.41by HSP90or 0.44by STAT3alone.Conclusion：This study has confirmed that malignant PCCs overexpress HSP90and STAT3，and the combination of HSP90and STAT3can be used as helpful diagnostic markers to diagnose malignant PCCs. Key words pheochromocytoma；heat shock protein 90；signal transducer and activator of transcription 3；positive predictive value 信号转导和转录活化因子 3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）是一种存在于细胞 浆与酪氨酸磷酸化信号通路相偶联的双功能蛋白，具有信号转导和转录的双重作用；其在细胞中的持续激 活，可以抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，参与肿瘤的发生与发展1。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）作 为广泛存在于各种生物体内的一个高度保守的蛋白质家族，其亚型 HSP90 与肿瘤的关系较为密切，在很多 癌组织中均有异常表达，且其表达水平与肿瘤分化程度、临床转归、抗药性形成等有关2。我们运用免疫组 织化学技术及蛋白质印迹法检测嗜铬细胞瘤中 STAT3 和 HSP90 的表达情况，并探讨联合两者早期诊断恶 性嗜铬细胞瘤的价值。 1 资料与方法 1.1 临床资料 选取我院 1986 年 10 月2010 年 8 月手术切除的肾上腺嗜铬细胞瘤组织标本 94 例（患者 数 92 例）和因良性肾疾患行肾切除时获取的同侧正常肾上腺组织标本 20 例。恶性嗜铬细胞瘤的诊断标准 为远处非嗜铬组织转移或术后长期随访中出现远处转移，并经手术获取标本后经病理检查证实为嗜铬细胞 瘤者。良性嗜铬细胞瘤组（良性组）75 例，男 34 例，女 41 例，年龄 1177 岁，平均 43.05 岁；恶性嗜铬细胞 瘤组（恶性组）17 例，男 9 例，女 8 例，年龄 1975 岁，平均 45.06 岁（表 1）。 1.2 试剂及方法 一抗为鼠抗人 HSP90 多克隆抗体（Abcam，USA，1100 稀释）和兔抗人 STAT3 多克隆抗 体（Abcam，USA，1150 稀释）；二抗为 DAKO 公司 EnVision TM 抗兔 IgG 试剂盒及 EnVision TM 抗鼠 IgG 试剂盒。采用免疫组织化学 SP 法，标本脱水及石蜡包埋后 4m 厚连续切片，二甲苯、脱蜡各 15min，3 H2O2 孵育，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤 3 次灭活内源性过氧化 物酶，微波抗原修复，滴加 10正常山羊血清，室温下封闭 1h 以阻断非特异性反应。分别滴加上述两种抗 体，湿盒中 4孵育过夜，PBS 洗涤 3 次，分别滴加生物素标记二抗（DAKO 公司 EnVision TM IgG 试剂盒）， 37 孵育 30min。PBS 洗涤 3 次后，用二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，常规脱水，透明，封片。蛋白 免疫印迹实验：提取嗜铬细胞瘤组织和正常肾上腺组织蛋白后采用 BCA 法蛋白质定量计算样品蛋白的浓 度。取蛋白加样于 10SDS 聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转膜后以 5脱脂奶粉TBST 封闭 1h，与含 5脱脂 奶粉的 TBST 稀释的一抗于 4中过夜。TBST 洗涤 3 次后与含 5脱脂奶粉的 TBST 稀释的二抗作用 1h， 机器显影。 1.3 结果判断 HSP90 和 STAT3 以肿瘤细胞的细胞核或细胞浆中出现棕褐色或棕黄色颗粒为染色阳性， 否则为阴性。判断阳性或阴性表达的依据为细胞染色强度和染色细胞所占比例两种指标的积分之和。其中 染色强度积分为：不染色0（基本未着色或者染色强度与背景相似者），轻度染色1（着色浅，略高于背景 色），中度染色2（明显高于背景而呈棕黄色或棕褐色），强染色3（呈深棕黄色或深褐色）；阳性细胞比例 积分为：无细胞染色0，30细胞染色1，3060细胞染色2，60细胞染色3。若两种积分 之和大于 3 分则表达为阳性，小于或等于 3 分则为阴性3。 1.4 统计学处理 采用 SPSS15.0 统计软件。计量资料运用两独立样本 t 检验进行统计学分析，其数值用均 数标准差（xs）表示；两组 HSP90 和 STAT3 之间的比较用卡方检验和 Fishers 确切概率法；运用 LOG 回 归分析预测恶性嗜铬细胞瘤。以 P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 免疫组织化学检测结果显示 HSP90 在良性组中的表达为 22.37（17/76，95CI 为 13.00to31.74）， 在恶性组中的表达率为 66.67（12/18，95CI 为 44.89to 88.45），在正常肾上腺髓质组织中无表达，恶 性嗜铬细胞瘤组与良性嗜铬细胞瘤组之间 HSP90 的表达差异有统计学意义（P0.001）；STAT3 在恶性嗜铬 细胞瘤中的表达率为 83.33（15/18，95CI 为 66.11 to 100.55），在良性嗜铬细胞瘤中的表达率为 26.32（20/76，95CI 为 16.42to 36.22），在正常肾上腺髓质组织中无表达，恶性嗜铬细胞瘤组与良性 嗜铬细胞瘤组之间 STAT3 的表达差异有统计学意义（P0.001）（图 1、2）。Western Blot 分析结果显示 HSP90 和 STAT3 在恶性嗜铬细胞瘤中的蛋白表达水平高于良性嗜铬细胞瘤，而正常肾上腺髓质组织中 HSP90 和 STAT3 的表达水平最低，差异有统计学意义（P0.01）（图 3）。HSP90 诊断恶性嗜铬细胞瘤的阳 性预测值为 0.41（95CI 为 0.23to 0.61）。STAT3 诊断恶性嗜铬细胞瘤的阳性预测值为 0.44（95CI 为 0.26to 0.60）。联合 HSP90 和 STAT3 诊断恶性嗜铬细胞瘤时，阳性预测值上升为 0.70（95CI 为 0.45to 0.86）。应用逐步逻辑回归分析显示 HSP90 及 STAT3 均与恶性嗜铬细胞瘤独立相关（P0.039，P0.002） （表 2）。 图 1 HSP90 在恶性嗜铬细胞瘤中呈阳性高表达（HE 染色，40） 图 2 STAT3 在恶性嗜铬细胞瘤中呈阳性高表达（HE 染色，40） 图 3 Western Blot 分析结果 3 讨论 恶性嗜铬细胞瘤往往预后不良，5 年生存率仅为 40左右。与良性嗜铬细胞瘤相比，恶性嗜铬细胞瘤 在临床表现和组织病理学上均缺乏特异性4。目前唯一认可的恶性嗜铬细胞瘤诊断标准为非嗜铬组织区域 出现嗜铬细胞瘤转移病灶，而按此标准确诊时肿瘤己至晚期，预后不佳。如何准确迅速地判断嗜铬细胞瘤 的性质，是目前临床工作中亟待解决的问题。 HSP 是机体在应激状态下合成的一组高度保守的蛋白质分子，以分子伴侣的形式参与多种蛋白的折叠、 亚基组装、细胞内运输及降解等过程。根据分子质量大小可分为 HSP100、HSP90、HSP70、HSP60 和小 HSP 五大家族，其中 HSP90 是一种广泛存在于真核细胞的分子伴侣蛋白，具有调控多种客户蛋白的功能，在胃 癌、肝癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤细胞中高表达，且通过调节 PI3K/AKT，JAK/STAT 和 RAS/ERK 在内 的多条信号通路从而参与信号转导及细胞周期调控，起到抑制细胞凋亡、促进细胞增殖及存活的作用，故 对于肿瘤的生长及转移至关重要5。HSP90 的客户蛋白有 100 多种，其中多数可参与信号转导、细胞周期 及翻译调控等过程，HSP90 对客户蛋白的稳定和功能起着十分重要的影响6。本组的研究显示：HSP90 在 良性组中的表达为 22.37（17/76，95CI 为 13.00 to 31.74），在恶性组中表达率为 66.67（12/18，95CI 为 44.89to 88.45），在正常肾上腺髓质组织中无表达，恶性嗜铬细胞瘤组与良性 嗜铬细胞瘤组之间 HSP90 的表达存在显著性差异（P0.001）；HSP90 诊断恶性嗜铬细胞瘤的阳性预测值 为 0.41（95CI 为 0.23to 0.61）。 STAT3 是在研究 IFN 信号转导机制过程中发现的一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通路相偶联 的具有关键作用的双功能蛋白，调控着多种与细胞增殖凋亡相关功能蛋白的表达，并具有信号转导和转录 的双重作用，目前定义为癌基因7。近年来的研究表明，STAT3 具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖作用，参 与多种恶性肿瘤的发生、发展和演进过程。生理情况下 STAT3 蛋白的激活迅速而短暂，持续激活则导致调 控细胞增殖和血管生成的基因如 bcl-xl、survivin、cyclind D1、VEGF 等表达增多，导致细胞异常增殖和恶性 转化。 STAT3 蛋白是 EGFR、IL-6/JAK、Src 等多个致癌性酪氨酸激酶信号通路的聚会点，与肿瘤的增殖分化、 袭转移、血管生成和免疫逃避等生物学行为均密切相关，目前已证实多种恶性肿瘤的发生与 STAT3 的持续 性过度激活有关。我们的研究结果显示：STAT3 在恶性嗜铬细胞瘤中表达率为 83.33（15/18，95CI 为 66.11to 100.55），在良性嗜铬细胞瘤中的表达率为 26.32（20/76，95CI 为 16.42to 36.22），在正 常肾上腺髓质组织中无表达，恶性嗜铬细胞瘤中 STAT3 的表达水平远高于良性嗜铬细胞瘤和正常肾上腺 髓质组织。STAT3 诊断恶性嗜铬细胞瘤的阳性预测值为 0.44（95CI 为 0.26to 0.60），提示高表达 STAT3 的嗜铬细胞瘤患者术后有必要进行长期的密切随访，以便于提高恶性嗜铬细胞瘤患者的 5 年生存率。 STAT3 是 HSP90 重多客户蛋白中的一员，同时 STAT3 信号通路也会影响 HSP90 的表达水平。特异性的 HSP90 抑制剂可以抑制 STAT3 信号通路的激活，过表达 HSP90 后可以一定程度上逆转这种抑制，提示两 者之间在着广泛的信号交联8，9。联合 HSP90 和 STAT3 诊断恶性嗜铬细胞瘤时，阳性预测值上升为 0.70（95CI 为 0.45to 0.86）。应用逐步逻辑回归分析显示，HSP90 及 STAT3 均与恶性嗜铬细胞瘤独立相关 （P0.039；P0.002）。上述结果提示联合 HSP90 和 STAT3 可有效提高恶性嗜铬细胞瘤的早期诊断率，有 望成为预判恶性嗜铬细胞瘤的分子指标。 参考文献 1 Prinsloo E,Kramer A H,Edkins A L,et al.STAT3interacts directly with Hsp90J.IUBMB Life,2012,64:266-73. 2 Khalil A A,Kabapy N F,Deraz S F,et al.Heat shock proteins in oncology:Diagnostic biomarkers or therapeutic targetsJ.Biochim Biophys Acta,2011,1816:89-104. 3 Zhu Y,He H C,Yuan F,et al.Heparanase-1and Cyclooxygenase-2:prognostic indicators of malignancy in pheochromocytomasJ.Endocrine,2010,38:93-99. 4 Feng F,Zhu Y,Wang X,et al.Predictive factors for malignant pheochromocytoma:analysis of 136patientsJ.J Urol,2011,185:1583-1590. 5 Khalil A A,Kabapy N F,Deraz S F,et al.Heat shockproteins in oncology:Diagnostic biomarkers or thera-peutic argetsJ.Biochim Biophys Acta,2011,1816(2):89-104. 6 Trepel 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