生物技术大实验(一).doc

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薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂薁羂袄莁蚄螄膃莁莃羀腿莀薆袃肅荿蚈肈羁莈螀袁芀莇蒀蚄膆蒆薂衿肂蒅蚄蚂羈蒅莄袈袄蒄薆蚀节蒃虿羆膈蒂螁蝿肄蒁蒁羄羀蒀薃螇艿蕿蚅羂膅蕿螈螅肁薈蒇羁羇膄蚀螄羃膃螂聿芁膃蒁袂膇膂薄肇肃膁蚆袀罿膀螈蚃芈艿蒈袈膄芈薀蚁肀芇螃袇肆芇蒂螀羂芆薅羅芁芅蚇螈膇芄蝿羃肃芃葿螆罿莂羄莄芇螄肆膇蚆螃袆蒃薂螂羈芅蒈螂肀蒁莄螁膃芄蚂螀袂肆薈衿羅节蒄袈肇肅莀袇螇芀芆袆罿肃蚅袆肁荿薁袅膄膁蒇袄袃莇莃袃羆膀蚂羂肈莅薇羁膀膈蒃羀袀莃葿薇肂膆莅薆膄蒂蚄薅袄芅薀薄羆蒀蒆薄聿芃莂蚃膁肆蚁蚂袁芁薇蚁羃肄薃蚀膅荿葿虿袅膂莅蚈羇莈蚃蚈肀膁蕿蚇膂莆蒅螆袂腿莁螅羄莄芇螄肆膇蚆螃袆蒃薂螂羈芅蒈螂肀蒁莄螁膃芄蚂螀袂肆薈衿羅节蒄袈肇肅莀袇螇芀芆袆罿肃蚅袆肁荿薁袅膄膁蒇袄袃莇莃袃羆膀蚂羂肈莅薇羁膀膈蒃羀袀莃葿薇肂膆莅薆膄蒂蚄薅袄芅薀薄羆蒀蒆薄聿芃莂蚃膁肆蚁蚂袁芁薇蚁羃肄薃蚀膅荿葿虿袅膂莅蚈羇莈蚃蚈肀膁蕿蚇膂莆蒅螆袂腿莁螅羄莄芇螄肆膇蚆螃袆蒃薂螂羈芅蒈螂肀蒁莄螁膃芄蚂螀袂肆薈衿羅节蒄袈肇肅莀袇螇芀芆袆罿肃蚅袆肁荿薁袅膄膁蒇袄袃莇莃袃羆膀蚂羂肈莅薇羁膀膈蒃羀袀莃葿薇肂膆莅薆膄蒂蚄薅袄 生物技术大实验i 讲义 甘丽萍/肖国生 重庆三峡学院生命科学与工程学院实验教学进度表（共32学时）周 次实验项目名称组次计划学时实验内容6生物技术大实验基础知识25l 生物技术实验室基本规则；l 分子生物学仪器使用及注意事项；生物技术试剂及培养基配制及使用规则。7质粒dna的提取27l 碱裂解法提取质粒dna；l dna电泳检测及结果分析；l 凝胶成像系统的使用。8动物组织rna的提取 27l 动物组织rna的提取及检测；l 能判断提取mrna质量。9感受态细胞的制备及转化筛选27l 细菌培养和培养菌液od值的检测；l 感受态细胞的制备方法；l 质粒转化及筛选。l 掌握大肠杆菌的转化方法；熟练掌握质粒重组子的抗性筛选。10dna的限制性内切酶酶切反应26l dna的限制性内切酶酶切操作；l 电泳分析酶切凝胶结果分析。实验一 生物技术大实验基础知识【实验目的】 l 介绍分子生物学实验室基本规则；l 学习分子生物学仪器使用及注意事项；l 掌握常用试剂及培养基配制和使用规则。 【实验内容】一、分子生物学实验课的目的和要求分子生物学实验课程的设立为系统培养学生在分子生物学领域基本技术和技能，通过学生的独立实验设计和实践，培养学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力,掌握分子水平的基本技术，为以后的学习和工作打下良好技术基础。二、实验的进行程序和要求1预习 学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。2讲解 教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。3独立操作与观察 除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。4示教 每次的实验都备有示教内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。5作业 实验报告必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。学生应认真阅读教师批改后的实验报告，不断提高实验质量。6小结 实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。三、实验规则和注意事项1每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。2上实验课时必须携带实验指导、实验报告纸及绘图文具等，按规定座位入座。3实验前，要认真检查所用仪器、药品是否完好、齐备，如有缺损应及时向教师报告，自己不得随意调换标本、仪器等。没有得到教师的允许，不能动用实验室其它非本次实验所用的仪器设备。注意试验室的告示和各种说明。注意安全，对于任何不了解的药品或者仪器设备，不可触碰，避免给自己或者试验室造成损失。4实验时要遵守纪律。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧哗，不准在实验室吃食和会客。5实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。6要爱护仪器、标本和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告，并主动登记、说明情况。凡是有化学药品的试剂和溶液瓶上，必须贴上标签，注明名称、成份、浓度、配制日期。配制的药品本人应该在药品上贴上标签，写上配制者姓名、配置时间、试剂名称。7.水槽：在水槽中倒入有毒废弃液后，应用大量水冲洗。垃圾也应该分类放置，一个用于放置有毒药品，一个放置废弃培养基，一个用于放置生活垃圾。 8.实验结束后，应清理实验台面，所有液体废物、酸类、染料等，应倒在废物缸内，不能倒在水槽中。认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。四、常用仪器仪器使用及注意事项1.培养箱 在分子生物学试验中，有很多反应都是在特定温度下进行的，这时就需要一个控温的装置。例如：用于细菌的平板培养，我们通常设定为37于培养箱倒置培养；其他分子生物学实验如酶切等需要25，30，37等条件。2.冰箱 冰箱是实验室保存试剂和样品必不可少的仪器。分子生物学实验中用到的试剂有些要求是4保存，有些要求是-20保存，实验人员一定要看清试剂的保存条件，放置在恰当的温下保存。具体来说，不同温下保存的物品如下：a. 4适合储存某些溶液、试剂、药品等。b.-20适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和dna、蛋白质样品等。c.-80适合某些长期低温保存的样品、大肠杆菌菌种、纯化的样品、特殊的低温处理消化液，感受态等的保存。d.0-10的层析冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。3.摇床 摇床是实验室常用仪器，一般有常温型和低温型两种。对于分子生物学实验室，如果能配置低温型摇床，就可以适应不同的实验需求。例如：用于大肠杆菌，酵母菌等生物工程菌种的振荡培养及蛋白的诱导表达，培养通常为28和37，诱导表达需要20-37；在感受态的制备过程中，需要有18的温控制；用于蛋白凝胶的染色脱色时振荡，常温使用；用于大肠杆菌常规转化时振荡复苏，常为37。对于控制温低于室温时，我们需要低温型摇床来控温。4.水浴锅 水浴锅也是一种控温装置，水浴控温对于样品来说比较快速且接触充分。例如，用于42的大肠杆菌转化时的热激反应；用于dna杂交过程中水浴控温。5.烘箱 烘箱是用于灭菌和洗涤后的物品烘干。烘箱有不同的控温范围，用户可以根据实验需求进行选择。例如，有些塑料用具只能在42-45的烤箱中进行烘干；用于rna方面的实验用具，需要在250烤箱中烘干。6.纯水装置 纯水装置包括蒸馏水器和纯水机。蒸馏水器的价格便宜，但在造水过程中需要有人值守；纯水机价格高些，但是使用方便，可以储存一定量的纯水。纯水使用也有不同的级别，一般实验用水需要纯水，用于pcr、dna测序、酶反应均需要超纯水。7.灭菌锅 分子生物学所用到的大部分实验用具都应严格消毒灭菌。包括实验物品、试剂、培养基等。灭菌锅也有不同大小型号，有些是手动的，有些是全自动的。用户需要根据自己的需要选购。灭过菌的器皿不可随意打开，避免污染。 8.天平 天平用于精确称量各类试剂。实验室常用的是电子天平，电子天平按照精度不同有不同的级别。称量较贵的药品时，应注意少量多次称量，避免浪费。若称量过量时不可将药品重新放回药盒中，以免污染药品。药勺不可交叉使用，使用完后用水冲洗干净，然后用纸擦干净。称量有毒药品的用具应经过特殊处理。9.液体量器 液体量器用于精密量取各类液体。常见的液体量器有量筒、移液管、微量取液器、刻度试管、烧杯。10.ph计 用于配置试剂时精确测量ph值，从而保证配置的溶液的精确性。有时也需要利用ph计测定样品溶液的酸碱度。11.分光光度计 分光光度计通过测定吸光值，从而用于分析样品核酸和蛋白的含量及纯度；同时也可以测定培养菌液的浓度。12.离心机 离心机有冷冻和常温之分。主要用于收集微生物菌体、细胞碎片以及其他沉淀物。有些样品由于在常温下不太稳定，需要低温环境。例如在感受态制备过程中必须保证低温环境，所以需要冷冻离心机。13.超净工作台 分子生物学中凡是涉及对细菌的操作均需在超净工作台下完成，还有感受态制备，转化反应等，都需要无菌的环境。使用前打开开关电源，开启紫外灯半个小时，工作时应把该灯关闭，按照需要调节风速。14.电泳系统 实验室常用的电泳主要是三种：水平电泳用于核酸dna/rna的琼脂糖电泳检测；垂直电泳用于蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；转印电泳用于将蛋白转印到膜上做western检测。15.pcr仪 不同的类型用于不同的实验。普通和梯度pcr仪用于基因克隆和基因检测过程中dna/rna的扩增。荧光定量pcr仪用于核酸定量分析、基因表达差异分析、单核苷酸多态性检测、甲基化检测。原位pcr仪用于鉴定和定位带有靶序列的细胞在组织中的位置.16.凝胶成像分析系统/紫外检测仪 凝胶成像系统用于对染色后的核酸琼脂糖电泳胶和蛋白聚丙烯酰胺凝胶的观察和拍照，有些可以进行切胶操作。紫外检测仪可以用于对染色后的核酸琼脂糖电泳胶的观察，胶回收时切胶操作，但是不能连接电脑拍照。17.制冰机 实验室常用的是雪花制冰机，制冰机一般是按每日制冰量分成不同型号。分子实验室中制造大多数核酸、蛋白质的实验操作所需的低温环境，以减少核酸酶或蛋白质酶的水解。感受态制备也需要长时间冰浴。18.磁力搅拌器 在配置试剂过程中，有些试剂较难溶解，这时需要借助磁力搅拌器。磁力搅拌器可以加速溶解固体内容物。磁力搅拌器一般带加热功能。19.生物安全柜 分子实验中涉及的试剂和样品很多是有毒的，对于操作人员来说伤害较大。为了防止有害悬浮微粒、气溶胶的扩散，可以利用生物安全柜对操作人员、样品及样品间交叉感染和环境提供安全保护。20.微波炉和电炉 用于溶液的快速加热，电泳琼脂糖凝胶的加热溶化配制，固体培养基的加热溶化不可放入任何金属物品。只能用于玻璃或者塑料。21.液氮罐 感受态细胞的制备需要液氮处理。感受态的保存也可以存于液氮中。22.微管移液器 微管移液器也有不同型号，是用于准确量取特定体积的溶液，需要使用专用的枪头，用后要回归初始值。五、分子生物学实验室常用试剂毒性说明分子生物学研究要做到对有毒试剂的危险,不过虑,不漠视。做好防护,安安全全做实验。每次做试验，穿好试验服，接触有毒物品要求戴一次性手套。六、配置试剂并灭菌1. 培养基lb培养基（luriabertani培养基）（1000 ml）：称取蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，nacl 10 g，加双蒸水至800 ml，摇动容器至完全溶解。用5 mol/l naoh（约0.2 ml）调节ph值至7.0，加入双蒸水至总体积1000 ml，高压下蒸气灭菌20分钟。含氨苄抗性lb固体培养基（1000 ml）：在lb液体培养基中加12 g琼脂粉，高压灭菌后冷却至60 左右加入氨苄青霉素至终浓度50 g/ml, 铺制平板。2. 缓冲液和常用溶液1m trishcl（ph8.0）1. 称量121.1gtris置于1l烧杯中。 加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。浓盐酸42ml，将溶解定容至1l，高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定ph值，因为tris溶液的ph值随温度的变化差很大，温度每升高1，溶液的ph值大约降低0.03个单位。0.5 m edta（ph8.0）称取186.1g na2edta2h2o，置于1l烧杯中。加入约800ml的去离子水，充分搅拌，用naoh调节ph值值8.0（约20g naoh）。（ 注意：ph值至8.0时，edta才能完全溶解）。加去离子水将溶液定容至1l，适量分成小份后，高温高压灭菌。室温保存。2 mol/l naoh 量取80ml去离子水置于100200ml塑料烧杯中（naoh溶解过程中大量放热，有可能使玻璃烧杯炸裂）。称取8g naoh小心地逐渐加入到烧杯中，边加边搅拌。 待naoh完全溶解后，用去离子水将溶液体积定容至100ml，将溶液转移至塑料容器中后，室温保存。te缓冲液（ph 8.0）：trishcl （ph 8.0）10 mmol/l，edta（ph 8.0）1 mmol/l75 mmol/l cacl2（1000 ml）：800 ml无菌双蒸去离子水中加无水cacl2 8.325 g，溶解定容1000 ml后分装，高压灭菌后储存于4备用。25 mg/ml iptg：溶解250 mg的iptg（异丙基硫代-d-半乳糖苷）于10 ml水中，贮存于-20中。2.5 x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）：溶解25 mg的x-gal于1 ml的二甲基甲酰胺,用铝箔包裹装液管，贮存于-20。3 mol/l naac（ph 5.2）（1000 ml）：naac3h2o 408.1 g以dd h2o溶解，用冰醋酸调ph至5.2，定容分装，高压灭菌后室温保存。10 mg/ml rnase a ：rnase a 0.1 g，trishcl（ph 7.5）10 mmol/l，nacl 15 mmol/l，终浓度为10 mg/ml，100加热15min，缓慢冷却至室温，分装后-20 贮存。1.2 % 琼脂糖（agarose）：1.2 g琼脂糖，加入50tae缓冲液100 ml，100 c煮沸至完全溶解，冷却至适温（约50 c）加入10 mg/ml溴化乙锭5 l，摇匀即可灌制凝胶。depc处理水：加1 ml焦炭酸二乙脂（depc）至1000 ml双蒸水中，震荡摇晃24 h，120c 35min高压灭菌使depc失活。3.碱变性法质粒抽提缓冲液溶液i（sol. i）： 50 mmol/l葡萄糖，25 mmol/l trishcl（ph8.0），10 mmol/l edta（ph8.0）。高压蒸汽灭菌20 min，保存于4 c。溶液（sol. ）：0.2 mol/l naoh（从10mol/l贮存液中现用现稀释），1.0 %（m/v）sds，现用现配制，室温下使用。溶液（sol. ）：5 mol/l乙酸钠 60.0 ml、冰乙酸11.5 ml、ddh2o 28.5 ml，高压蒸汽灭菌20 min，保存于4 c。4 核酸电泳相关试剂50tae缓冲液（50储存液，ph约8.5）：称取tris碱242 g，naedta2h2o 37.2 g，加入57.1 ml冰乙酸，补加dd h2o至1000 ml，使用时稀释50倍。10 mg/ml eb（溴化乙锭）：0.1 g溴化乙锭固体溶于10 ml ddh2o中，磁力搅拌数小时后转移至棕色瓶中，室温下避光保存。 膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆蚃肅膆薄蚂螄羈蒀蚁袇膄莆蚀罿羇节蝿虿膂膈螈螁羅蒇螇袃膀蒃螇肆羃荿螆螅艿芅螅袇肂薃螄羀芇葿螃肂肀莅袂螂芅芁葿袄肈膇蒈羆芄薆蒇螆膆蒂蒆袈莂莈蒅羁膅芄蒅肃羈薃蒄螃膃蒈薃袅羆莄薂羇膁芀薁蚇羄芆薀衿芀薅蕿羁肂蒁蕿肄芈莇薈螃肁芃薇袆芆腿蚆羈聿蒈蚅蚈芄莄蚄螀肇莀蚃羂莃芆