植物激素浓度和灭菌消毒时间对植物组织培养状况影响的探究论文.doc

植物激素浓度和灭菌消毒时间对植物组织 培养状况影响的探究一.植物祖师培养综述1.1概念植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义组织培养是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。1.2 研究历史19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。近几十年来植物组织培养技术已经发展成为一项新兴无性繁殖技术。1.3技术原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。 1.4培养特点1.4.1培养条件可以人为控制组培采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。 1.4.2生长周期短，繁殖率高组培是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然组培需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。1.4.3管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。二.实验具体实施方案2.1培养基贮备液以及各种植物激素配制2.1.1培养基简述培养基是植物组织培养中离体植物材料赖以生存的“土壤”。不同组织培养类型、外植体需要的培养基配方不同，组织培养是否成功，培养基的选择具有重要作用。目前常用的培养基有ms、b5、white等。无论何种培养基，都由矿物营养、维生素、碳源、植物激素、有机附加物等无类物质组成。在植物组织培养中应该培养植物的种类和部位，选择最适的培养基，才能获得植物组织培养的成功。本实验以ms为基本培养基。2.1.2 仪器试剂仪器和用具分析天平、恒温水浴锅、电炉、量筒、移液管、烧杯、容量瓶、试剂瓶等试剂ms培养基、植物激素ba、植物激素naa2.1.3步骤1）根据扩大倍数和配制母液量计算每种化合物称取量；2）称取大量元素化合物，分别溶解后顺次逐个加入并混合，加水定容止所需体积；3）称取微量元素化合物，分别溶解后顺次逐个加入并混合，加水定容止所需体积；4）称取feso4 .7h2o和na2edta，分别溶解后混合，加水定容止所需体积；5）称取各种维生素和氨基酸，分别溶解后混合，加水定容止所需体积；6)称取25mgba先溶解于1mol/l hcl中，再加水定容至25ml（1mg/ml）；7）称取25mgnaa，用naoh溶解后再加水定容至25ml（1mg/ml）。附表：ms培养基母液配制表2.1.4注意事项1)注意大量元素母液配制的程序： 除钙盐外，其他大量元素分别称量并按顺序融于蒸馏水中，钙盐单独配置，组合混合后，用蒸馏水定容；2)微量元素母液配制的小窍门：因其用量小，为称量方便及精确起见常配置成100或1000倍母液；3)注意不同母液的储存方法：激素母液装入棕色试剂瓶中，铁盐，有机母液，激素母液放于4度冰箱中，大量元素和微量元素母液常温下保存于柜子中，naoh瓶子的瓶塞上应缠一圈纸。2.2培养基配制和灭菌2.2.1愈伤组织诱导培养基配制1）计算各种母液用量（按配置1000mlms培养基计算）2）每组取50ml的烧杯一只，按上述用量用量筒或移液管（不能混用 ），量取或吸取各种母液，放于烧杯中，同时加上激素ba（浓度2mg/l）备用；3）每组取1000ml的烧杯一只，加300ml蒸馏水，加入琼脂6g，在石棉网上加热溶解，称取30g蔗糖放入溶解的琼脂中，同时加入各种取好的母液，用玻璃棒不断搅拌混合，并加蒸馏水至1000ml；4）调整ph:将培养基搅匀，用ph试纸或ph计测其ph值，可用一定浓度的hcl和naoh调节至5.8；5）培养基分装、封口：把配置好的培养基趁热分装到培养瓶中，培养基应占试管或三角瓶的1/4-1/3左右为宜，注意不要将培养基沾在管壁上，以免引起污染，分装后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培养基名称及配制时间等。2.2.2继代培养基配制1）计算各种母液用量（按配置1000mlms培养基计算）2）每组取50ml的烧杯一只，按上述用量用量筒或移液管（不能混用 ），量取或吸取各种母液，放于烧杯中，同时加上激素备用；附表：各组植物激素用量组别一二三四ba浓度（mg/l）0.10.50.50.5naa浓度（mg/l）000.10.53）每组取1000ml的烧杯一只，加300ml蒸馏水，加入琼脂6g，在石棉网上加热溶解，称取30g蔗糖放入溶解的琼脂中，同时加入各种取好的母液，用玻璃棒不断搅拌混合，并加蒸馏水至1000ml；4）调整ph:将培养基搅匀，用ph试纸或ph计测其ph值，可用一定浓度的hcl和naoh调节至5.8；5）培养基分装、封口：把配置好的培养基趁热分装到培养瓶中，培养基应占试管或三角瓶的1/4-1/3左右为宜，注意不要将培养基沾在管壁上，以免引起污染，分装后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培养基名称及配制时间等。2.2.3生根培养基配制1）计算各种母液用量（按配置1000mlms培养基计算）2）每组取50ml的烧杯一只，按上述用量用量筒或移液管（不能混用 ），量取或吸取各种母液，放于烧杯中，同时加上激素备用；附表：各组植物激素用量组别一二三四iba浓度（mg/l）0.10.500吲哚丁酸浓度（mg/l）001.01.53）每组取1000ml的烧杯一只，加300ml蒸馏水，加入琼脂6g，在石棉网上加热溶解，称取30g蔗糖放入溶解的琼脂中，同时加入各种取好的母液，用玻璃棒不断搅拌混合，并加蒸馏水至1000ml；4）调整ph:将培养基搅匀，用ph试纸或ph计测其ph值，可用一定浓度的hcl和naoh调节至5.8；5）培养基分装、封口：把配置好的培养基趁热分装到培养瓶中，培养基应占试管或三角瓶的1/4-1/3左右为宜，注意不要将培养基沾在管壁上，以免引起污染，分装后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口，注明培养基名称及配制时间等。2.2.4培养基灭菌.2.2.4.1普通人工控制的高压灭菌锅操作步骤：1）加水：将水加入高压灭菌锅的外层锅内，水位高度与支柱高度一致，连续灭菌时一定要检查水位高度，及时注水补充，检查水位是灭菌前的必要步骤，因为水量不足会导致高压灭菌锅的损坏；2）装锅：将分装的培养基和所需的各种用具放入高压灭菌锅的灭菌筒内，不要过于紧密，三角瓶瓶口向上，盖好锅盖，上好螺丝；3）排气：在增压前将国内的冷空气排尽，使蒸汽能达到各个消毒部位，以保证彻底灭菌，4）灭菌：当指针移至1.11.2kg/cm2时，将火调小，保持该压力1520min（在121摄氏度下保持1520min），切断电源，缓慢放出蒸汽，即达到消毒目的。当压力逐渐降低到零度后，才能打开锅盖，从锅中取出灭菌物品，放入白瓷盘，存放于培养室待用。培养基灭菌后取出让其凝固，直立放置让其保持平面，有的试管为扩大培养基面积，要求斜放保持鞋面。此时锅及锅内物品都很烫，操作时需戴加厚的棉手套。注意事项：1）锅内冷气必须排尽，否则压力表指针虽然达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在并达不到应有的温度因而影响灭菌效果：2）当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格控制时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果；3）三角瓶中的液体不超过总体积的70%，否则当温度达到100摄氏度时，培养基会喷溢，造成培养基和包装纸的污染。2.2.4.2全自动立式高压蒸汽灭菌锅操作步骤：1） 检查灭菌锅内的水位，应当浸没加热圈并不要高于套桶底部，若水量不足请加入蒸馏水或去离子水使得加热圈被浸没；若不慎加入过量的水，请使用底下带有绿色扳手的排液阀排出多余的水后使水位合适。灭菌锅在使用以前排液阀必须关闭；2） 检查左侧下方排气管，使其浸在水盆里，并确保管口一定浸在水面以下；3）放入要进行高压灭菌的物品，最好将物品放入灭菌金属筐内，再放入灭菌锅内进行灭菌。将顶盖转到灭菌锅正上方并旋紧；4） 关上安全阀；5）打开电源，设定温度、时间后并按set键确认；6）按start键开始高压灭菌；7）灭菌结束，灭菌锅开始发出警报声，待温度降低到80c仔细检查压力表读数是否为零，确认为零则关闭总电源后可以开启顶盖，开启时操作者应头部略微后仰。开盖后可以先让锅内物品稍微冷却后再取出；8）若由于非常规原因导致灭菌异常终止请使用安全阀放空锅内高压蒸汽，待压力表读数为零后可以打开顶盖。注意事项：1）任何时候当压力表显示压力不为零绝对不能打开灭菌锅顶盖；9） 任何时候灭菌前请注意：灭菌锅内的水位是否合适，是否浸没加热圈；顶盖是否已经盖紧；安全阀是否已关闭；左侧下方排气管是否浸在水面以下；2）长期使用或者受到污染的灭菌锅应当用蒸馏水或去离子水进行清洗，使用底下排液阀将清洗液排出，再加入蒸馏水或去离子水到适当的位置备用；3）灭菌时至少要留出约占容器1/4体积的空间，这样沸腾的液体就不会溢出；4）灭菌时要把容器的盖子松开，防止容器内压力过大，致使容器破裂；5）取出灭好菌的容器前要拧紧容器的盖子，否则与空气接触容器内染菌。2.3植物无菌材料建立和培养2.3.1无菌操作技术2.3.1.1用品超净工作台、75的酒精、95的酒精、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主要指 解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、培养材料（根、茎、叶或种子等）、0.1的升汞（或漂白粉）、无菌水等；2.3.1.2方法步骤1）在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min；2）正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，2030min后接种；3）用肥皂水洗净双手，在缓冲间内穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室；4）用75的酒精擦拭工作台面和双手；5）用蘸有75酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台；6）把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95 酒 精 中，在 火 焰 上 灭 菌 后 ，放 在器 械 架 上 ；7）将植物材料进行灭菌消毒处理（见下表）植物材料石楠茎段侧柏种子75%酒精消毒30秒，无菌水冲洗23次一组、二组氯化汞处理8分钟，无菌水冲洗34次氯化汞处理10分钟，无菌水冲洗34次三组、四组氯化汞处理10分钟，无菌水冲洗34次氯化汞处理15分钟，无菌水冲洗34次8）用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开封口塑料；9）取下接种器械，在火焰上灭菌；10）把培养材料迅速放入培养瓶，扎上瓶口（每人接种510瓶）。操作期间应经常用75酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95的酒精中浸泡和在火焰上灭菌；11）接种结束后，清理和关闭超净工作台。3.植物培养材料的观察统计与分析3.1不同灭菌消毒方法对植物材料消毒的影响统计表1材料处理接种瓶数污染瓶数污染率存活数存活率%石楠茎段消毒1消毒2侧柏种子消毒3消毒4注：消毒1：石楠茎段用75%酒精消毒30秒，无菌水冲洗23次；氯化汞处理8分钟，无菌水冲洗34次消毒2：石楠茎段用75%酒精消毒30秒