动物转基因与生物反应器 思考题

动物转基因与生物反应器 思考题 1 转基因动物的概念、主要研究内容以及现状和前景。 （找不到前景） 概念：将外源基因导入动物的受精卵或早期胚胎细胞，使之整合到动物的基因组并获得表达，由此外源基 因能随着细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的动物称为转基因动物。 主要研究内容：提高动物品种的抗性；提高生长速度；改良动物的适应性；改良动物的生产性状；动物反 应器 现状：同基因重组微生物和转基因植物相比，转基因动物的技术效率很低，费用高，消耗多，产生有用结 果耗时长。概括如下： 生产转基因动物需要高水平 DNA 操作 1.到目前为止，真正了解其全部表达调控元件的动物基因只有少数几个。 2.对大多数基因来讲，我们还只能分离它近 5端的启动子，及近 5端和近 3端的增强子。 3.转基因动物的载体已变得相当大，加上目的基因序列，表达结构的总长度一般都在 10kb 以上，长的 可以达到 20-30kb。 4.表达仍需受基因插入位点附近染色体环境的影响，产生所谓的基因表达“位置效应” 。 动物转基因技术效率低下 显微注射仍旧是最常用的动物转基因技术。显微注射 DNA 不仅需要昂贵的设备和训练有素的操作人员， 而且效率低下（按照注射和移植的胚胎数来计算，每生产一只转基因绵羊、山羊或猪，大体需要注射 100 个单细胞胚胎。生产转基因牛的效率更低) 生产转基因动物方法，还有精子介导、逆转录病毒载体转染和 ES 细胞途径等。 2 为什么要研究和应用转基因动物，为什么不能用离体培养的动物细胞取代转基因动物呢？ 1.应当认识动物细胞不等同于自由生活的细菌和酵母菌，它是复杂的动物体的基本单元。因此，当动物细 胞离体培养时，它们的许多特性迅速消失。 2.在离体状况下，要维持细胞在体内相同甚至相近的环境条件，也是不可能的。 3.有些基因转入动物细胞系中后，与把它们转入转基因动物中的行为有很大差别。离体培养的细胞中缺少 某些能够通过结合到内含子上而刺激基因表达的组织特异性因子。 4.最为重要的是，利用转基因动物可以研究许多复杂的生物学过程。 3. 卵泡发育，排卵和黄体的控制。 促性腺激素对卵母细胞的发育的影响 卵母细胞在出生后在减数分裂诱导因子的作用下，将染色体减少到单倍体时期。这一过程在减数分裂到达 双线期或核网期时被减数分裂抑制因子阻止。直到卵泡开始进入最后发育成熟阶段才开始恢复减数分裂。 卵泡发育的起始阶段包括卵母细胞的生长。同时，卵泡细胞开始分裂并形成数层颗粒细胞。颗粒细胞分泌 另外一种界限物质-透明带，该透明带与颗粒细胞相连并立刻包围卵母细胞。 促性腺激素受体的形成和作用 为了使卵泡发育越过腔前阶段，颗粒细胞和膜细胞必须表达出促性腺激素的受体。FSH 和 LH 受体分别在颗 粒细胞和膜细胞上表达出来。 促性腺激素受体在颗粒细胞和膜细胞上的出现导致了雌激素合成的细胞间相互作用的形成。 雌激素的作用之一就是随着卵泡的进一步发育促进 FSH 受体的进一步增加。 LH 受体与排卵作用 有腔卵泡发育的后期，FSH 和雌激素促使颗粒细胞中产生 LH 受体，而 FSH 受体开始减少。有腔卵泡雌激素 分泌的增加导致促性腺激素排卵前峰的出现。这样，在发育的最后阶段，卵泡在 LH 的控制下排卵后开始形 成黄体。 成熟卵泡中，颗粒细胞分泌大量的雌二醇，抑制小卵泡的发育，同时大量的雌二醇可以促进排卵前 LH 高峰 的分泌，从而促进排卵。 4. 雌激素和 GnRH 控制雌性动物的性容受性而睾酮控制雄性的性容受性。不确定 ppt 睾酮决定外生殖器和大脑的性别分化 生殖管道系统和外生殖器的发育受发育中的性腺的控制。 如果个体为雌性，即发育的性腺为卵巢，苗勒氏管发育成输卵管、子宫、子宫颈和阴道，而沃夫氏管退化。 引起这两个管道变化的重要因素是睾酮。如果个体为雄性，则睾丸网产生苗勒氏管抑制因子，它引起沃夫氏 管发育，而苗勒氏管退化。 5a-还原酶对于雄激素的作用是非常重要的，因为睾酮必须在细胞内转化成二氢睾酮才能使组织发生雄性化。 在雄性动物中，促性腺激素分泌的控制与雌性的相似。下丘脑 GnRH 的波动性释放影响促性腺激素的波动性 分泌，后者反过来引起睾丸中睾酮的波动性分泌。 5下丘脑-垂体如何对生殖的控制？ 下丘脑和垂体前叶激素控制性腺的活动 性腺的活动受下丘脑和垂体前叶的控制。肽类激素或直接通过神经原轴突到达垂体，或通过垂体门脉系统 进入垂体。垂体对下丘脑肽类激素刺激的反应是产生或分泌对性腺活动有重要作用的激素。 垂体前叶分泌控制生殖过程的 FSH、LH 和催乳素 腺垂体（前叶）产生蛋白质激素，对于生殖有重要作用。 其中主要是促性腺激素（FSH 和 LH） ，另一种激素是催乳素。FSH 和 LH 在卵泡发育和排卵中有协同作用。 FSH 在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中起主要作用，而 LH 在卵泡最后成熟和排卵中起主要作用。神经垂 体分泌的催产素也是生殖中的一个重要激素。 促性腺激素释放的变化 促性腺激素分泌的主要类型是波动性分泌，这一波动性分泌类型是受下丘脑 GnRH 的波动性分泌的特征 决定的。 促性腺激素分泌的波动产生系统在卵泡期增加，而在发情周期的黄体期降低。雌激素降低促性腺激素分 泌的波幅，而孕酮降低波的频率。这种频率增加而波幅下降相结合的特征对于发育中的有腔卵泡最后生 长期的营养提供是非常重要的。 下丘脑和腺垂体对持续升高的雌激素分泌发生的反应，是使促性腺激素分泌增加，这种关系是正反馈关 系。 卵泡能够将自己的成熟状态通过雌激素信号传递给下丘脑和腺垂体，随着卵泡的成熟，雌激素的生成量 增加。 促性腺激素的分泌受卵巢性激素（雌激素和孕酮）的调节。在一定时间，这些激素对促性腺激素分泌起 抑制作用。 孕酮对促性腺激素波动频率的影响，认为是在下丘脑水平。而雌激素通过影响垂体和下丘脑两个水平来 影响促性腺激素的分泌。 促性腺激素的分泌能够被下丘脑和卵巢中生产的肽类和蛋白质类激素调节 6 试述体细胞克隆技术的过程。 体细胞的制备 卵母细胞的制备 体细胞核移植 胚胎移植 7. 列举转基因技术的种类过程及应用？ 显微注射：使用显微注射器直接把 DNA 注射到动物的受精卵的原核或细胞质中，然后生产动物个体。 选择小鼠品系（） 外源 DNA 制备 收获受精卵 准备不育公鼠 显微注射的受精卵 假孕母鼠 将导入外源基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管或子宫 转基因鼠中外源基因整合的检测 通过繁育建立转基因小鼠品系 要求：假孕母鼠与移进胚胎的发育阶段同步化，为移植胚胎提供着床和继续发育的生理条件。 优点： 外源 DNA 大小基本不受限制（1-50kb） ；导入过程直观。 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 对卵子伤害大，胚胎存活率低 低效率（尤其是大家畜，见效率图） 基因整合随机性 转基因沉默 反转录病毒载体法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎 与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的), 获得转基因动物的方法。 优点： 受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高 缺点： 容纳大小有限，最大长度 8Kb，很难克隆全套基因表达元件 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性 不能控制转染时间，生产出的动物多为嵌合体 精子介导法 直接以精子为载体的转基因方法。 将成熟精子与外源 DNA 共培养，成熟精子与外源 DNA 预培养之后，使精子有能力携带外源 DNA 进入卵 子中，使之受精，并使外源 DNA 整合到染色体中。 优点：可重复性好 缺点：稳定性低 容易出现嵌合体 胚胎干细胞法（ES 细胞法） 将携带有外源基因的 ES 细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。 优点： 外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入 ES 细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便 缺点： ES 细胞系建立及培养困难 维持 ES 细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 8. 比较随机整合与同源重组的差异？ 随机整合 即使外源 DNA 含有与某一条染色体广泛同源的序列，大多数整合仍然是随机的，只有少数是通过同源交换而 实现重组。 外源 DNA 整合的构型 1).在一个特定的胚胎或一个特定细胞克隆，DNA 总是整合在染色体的单一位点，最多整合在少数几 个位点上； 2).在每一个整合位点，外源 DNA 通常呈现多拷贝串状整合； 3).在绝大多数情况下，某一位点上多拷贝串状整合的外源基因，采取头尾相连的排列方式 4). 这些方向一致的串状拷贝，是被导入 DNA 的完整或近乎完整的拷贝，在最坏的情况下，也只有在 两个相邻拷贝相结合的地方出现小的不完整； 5).在稀有的情况下，发现两个拷贝呈现头对头或尾对尾的连结方式，在这种情况下常发生末端缺失。 外源 DNA 整合到染色体上的机制 整合常发生在匹配较差的序列之间的不正常交换。在外源 DNA 及其染色体上的插入位点之间的结合部，常常 包含一段短的 DNA 序列（所谓填充序列） ，它明显地既不来自外源 DNA，也不来自染色体。 外源 DNA 整合时间和转基因嵌合体产生 转基因嵌合体的产生是由于基因整合时染色体已复制，或者已整合的基因从一个子染色体上丢失。 研究结果表明，显微注射 DNA 的时间越早越好，在用体外受精的方法生产原核胚胎时，更应掌握好及时完成 注射的时机。 同源重组 如果外源 DNA 含有适当的同源区，也可以通过类似的同源重组过程整合到真核生物的染色体上。DNA 通过 同源交换整合到染色体上的机制，为向目标基因导入预先设计的突变提供了途径，这种方法通常被称作基因 打靶。 外源基因通过同源重组实现整合 对于使用原核胚显微注射技术生产转基因动物也许意义不大，但对于通过动物克隆方法生产转基因动物的用 处可能很大。 位点专一性重组 位点专一性重组是通过结合在专一位点上的重组酶分子将参加位点拉扯到一块，从而实现同源交换。 目前，在转基因工作中常用的两种重组酶属于 Lambda 整合酶家族：噬菌体 P1 的 Cre 重组酶和啤酒酵 母菌的 FLP 重组酶。 这两种酶的作用机制是一样的，每一种酶都认识一段 34 对碱基的 DNA 序列。Cre 认识的序列称作 Lox P，而 FLP 认识的序列名为 FRT。重组酶的识别序列由核心序列和侧翼序列组成，侧翼序列完全 相同但方向相反，是酶的结合位点；由八对碱基组成的核心序列呈不对称性，决定整合位点的方向。 发生重组时，每条参与重组的双链 DNA 结合两个重组酶分子，整个反应总共有四个重组酶分子参加， 重组过程不消耗能量。 位点专一性重组是双向的，可以把外源基因整合到染色体上，也可以从染色体上把外源基因剪切下来。 在反应过程中，把两个分子结合在一起，亦即外源 DNA 整合到染色体上的反应，依赖底物的浓度， 而剪切过程不依赖底物浓度。 在生物体内由整合酶催化的剪切反应非常有效，相反，定点整合反应效率较差。为了改进整合效率，对 Lox P 序列进行了修饰 9. 基因表达的原理与应用 组织特异性表达 动物组织的多样性，是由基因的组织特异性表达造成的，这一点早已被证实。 组织特异性基因表达是通过两种调控机制实现的。 第一种调控过程是相对短效的调控过程，由出现在表达细胞内的调控因子结合到基因的调控 DNA 序 列上，激活基因表达。 第二种调控过程是长效调控。这种调控过程使细胞永久性地处于分化状态，每一种细胞都可以长期维 持和记忆它所属的细胞类型的特征，只表达它应当表达的基因。 染色质的结构 DNA 分子在细胞中不是处于伸展状态，而是和特殊的核蛋白一起折叠和紧缩为一种称为染色质的结 构。 在细胞的分化过程中，染色质结构产生了一系列变化，这些变化导致在细胞中形成三类不同包装水平 的染色质结构。大多数不活动的 DNA 形成高度卷曲和包装的螺线管结构；活跃的和潜在活跃的基因 形成更加开放的串珠状结构；而在基因的某些区段则形成没有核小体的裸露 DNA 或结构上变得松散 的核小体。染色质的这种结构上的变化，可以使不同细胞被限制在特定的分化状态，接受特定诱导因 子的刺激而表达特定的基因群。 真核基因表达调控 在细菌中，从基因到蛋白质几乎是一步完成的。当 RNA 聚合酶还在从 DNA 上转录 RNA 拷贝时，核 糖体就已经结合到新生成的 RNA 链上，开始将它翻译成蛋白质。与此相反，在真核生物中，从基因 到蛋白质是通过几个步骤完成的，表达过程及其调控更加复杂。 包括：转录；帽化；多聚腺苷酸化；RNA 拼接；RNA 运输；翻译；基因的协调表达 10. 外源基因表达如何有效实现？ 在目前的技术水平下，外源基因在转基因动物中的表达水平，实际上是难以预测的。 近年来对真核基因表达调控机理的研究突飞猛进，运用最新研究成果改进被转移的目的基因的表达结构， 已有可能使外源基因在转基因动物中的表达机会大大增加。 一、真核基因表达的调控序列 1TATA 框和 Inr 序列 许多真核基因的启动子含有 TATA 框，它位于基因转录起始位点上游约 30 个碱基之处，共有序列为 TATA（A/T ）A（A/T） 。TATA 框的主要功能是决定从哪一个碱基开始基因的转录。 Inr 序列。Inr 序列的位置不是在转录起始位点的上游，而是围绕在转录起始碱基（通常为腺苷酸）的两侧， 其共同序列为 Y2AN(T/A)Y2。 2其它短的调控序列 在 TATA 框的上游，还存在另外一类调控序列，按它们的功能区分主要可以分成两类。一类序列是通过 结合其它转录激活因子，提高转录水平。 另一类序列只存在于特定基因启动子上游，它们只对特定信号起反应。 3.增强子 真核基因的表达除了受位于转录起始位点附近的 DNA 序列的调控外，还要受到距离很远的一类调控序列 的调控。这类序列叫做增强子，其本身不具有启动子的功能，但能够使启动子的转录活性提高数百倍。 4基因座控制区 基因座控制区是调控基因正确表达的另一种重要元件。基因座控制区的作用机制是通过改变其相邻基因的 染色质结构，导致这些基因被转录 5核基质附着区（MAR） MAR 序列的基本功能是将染色质的环状域附着到称为核基质的蛋白质支架上，构成基因组中各个功能域 的边界，相当于基因组中的“标点符号” 。 在以 MAR 为边界的一个染色体环状域中，基因座控制区和增强子等调控元件，只能在本域内发挥作用。 相邻环状域的调控元件，也不能越过这个边界，影响另一个域内基因的表达特性。 MAR 序列的功能没有组织特异性。 二、表达结构的构建和功能域转移 由于多数基因的基因座控制区和远端增强子尚未分离出来，在构建用于生产转基因动物的表达结构时， 一般都是在目的基因的两端各增加一个 15kb 的 DNA 片段，大概只含有启动子、增强子和多聚腺苷酸 化信号。当这样一种结构整合到动物染色体上之后，目的基因的表达完全要依赖整合部位的染色体环境。 若要可靠和有效表达目的基因，必须构建和转移完整的功能域，使被转移的基因表达结构包含一切必要 的调控元件，以便实现不依赖整合位点的有效表达。在缺乏 LCR 调控元件的情况下，一种行之有效的方 法是利用大片段 DNA，如酵母人工染色体，作为基因表达的载体。 11. 简述动物乳腺生物反应器的优势。 从表达水平，产品收集的简易程度和对动物的副作用等诸多因素来衡量，乳腺是比其它器官系统更为优越 的基因表达靶器官。(生物活性高，无污染。动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统。易分离提纯，成 本低廉。产量高。 12. 简述动物乳腺生物反应器的的制作过程及应用。 获取目的基因（例如血清白蛋白基因）构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子） 显微注射导入哺乳动物受精卵中形成胚胎将胚胎送入母体动物发育成转基因动物（只有在产下的 雌性个体中，转入的基因才能表达）。 应用：分类：抗体，细胞因子、疫苗、组织修复材料、受体、激素、食用蛋白和滋补药等 8 大类产品 13动物乳腺生物反应器 有关的转基因技术有哪些，具体过程如何？ 转基因技术是研究动物乳腺生物反应器的瓶颈，极大地限制了这项重要技术的发展。 目前：生产转基因动物的主要技术仍然是向原核期胚胎直接注射纯化的 DNA 分子。 优点：重复性非常好 缺点：不能保证经过注射 DNA 的胚胎都发育成转基因动物，即使已经准确无误地将几百个考贝的 DNA 分子注入到每一个胚胎的原核中，发育成功的幼畜中仍然只有一小部分是整合了外源 DNA 的转基因动物。 第一种技术路线是，对供体母畜实行激素超排处理，然后进行手术冲取原核期胚胎，在体外进行 DNA 显微注 射后，再把它们移植到同期发情的受体母畜体内。国际上通用的方法。 优点：注射后的胚胎直接移植到母体内发育，因而每百枚移植的胚胎可以得到较多的仔畜 第二种技术路线是，体外受精技术加显微注射。这种技术不需要供体母畜，直接从屠宰场收集新鲜卵巢，吸 取未成熟卵母细胞，体外培养成熟和体外受精，发育成的原核胚显微注射 DNA 后继续培养，发育到囊胚时再 移植到受体动物体内。基于试管动物技术和显微注射相结合的一种工艺。 优点：可以利用屠宰场大量的废弃卵巢，把实验规模做得很大。 缺点：需要有很好的体外培养条件，有时还需要具备有效的胚胎冷冻技术。 第三种技术路线是，通过体细胞克隆转基因（表 6-14） 。先在培养的体细胞中完成基因转移，然后用转基因体 细胞作核供体，用体外培养的去核卵母细胞作细胞质受体，经过核移植生产转基因胚胎。 优点：充分运用了在体细胞中转移基因和筛选整合外源基因的细胞系的高效率，并通过克隆过程和 将体细胞直接变成转基因动物。 14. 动物克隆技术的影响要素及制作过程？ 细胞核供体 具备的主要生物学特性： 1、供体细胞必须是完整的二倍体，它必须确保有供体动物完整的基因组，不能多，也不能少。 2、供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一 样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。 在体细胞克隆中，细胞的类型和细胞所处的状态对成功率影响很大。 受体细胞质 作用：提供必要的条件，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过 程。 核移植中受体细胞质的功能，就是它含有的特定因子可以使基因表达程序发生重新排列。 许多实验证明，核移植若想获得成功，生下活的核移植动物后代，供体核和受体细胞质所处的细胞周期 最为关键。 多年的研究，发现哺乳动物的中期去核卵母细胞，是最易获得成功的受体细胞质。 受体卵母细胞成熟度与激活 卵母细胞的成熟包括核成熟和胞质的成熟。 卵母细胞的激活能力，取决于成熟后的时间，较老的卵母细胞可获得更高的激活率。然而，老龄卵母细 胞核移植后，胚胎发育不如使用新排出的卵母细胞好 卵母细胞去核的效果 去核的时机一般选择第一极体刚刚排出之时，那时中期板就在第一极体的附近。 去核原因：不去掉卵母细胞的核，则发育成的胚胎染色体倍性不对，或者两个细胞核相互干扰，影响胚 胎发育。 方法：盲吸法，用玻璃管吸去第一极体之下的三分之一的细胞质；用荧光染料先将 DNA 染色再去核，成 功率可达到 90% 以上，且损失的细胞质较少 ；先对 DNA 染色，再用紫外线照射破坏 DNA。 15. 基因打靶的载体的类型、构建与筛选（见 18），条件性定向基因转移技术。 1、基因剔除型载体 2、穿梭型载体 3、双置换型载体 4、共整合型载体 条件性定向基因转移：通过基因转移对基因座上的基因进行有限制的修饰，这种基因修饰可以局限在某些细胞 类型，也可以局限在某个发育阶段，或者可以既限制细胞类型，也限制发育阶段。 条件性定向基因转移是在常规的定向基因转移技术中使用了重组酶系统，特别是 Cre/Loxp 系统。 同源整合细胞克隆的筛选： 1、PCR 筛选法 在一般基因打靶实验中，打靶载体中总是包含一个用作正筛选的标记基因，最常用的是 neo 基因。 基于 PCR 的亲缘筛选 (sibling selection) 可以很好地从 G418 阳性克隆中筛选出极稀少的同源重组细胞 克隆。 载体构建：如果决定采用 PCR 进行筛选，在构建打靶载体时应注意保持同源区的两臂一长一短。短臂长 度应保持在 12kb，以保证扩增出的片段不会太长，维持 PCR 扩增的有效性。在构建载体之前，事先在 标记基因内部选好一个引物序列，并在同源交换区以外的靶座位序列上选好另外一个引物序列。为了控制 PCR 的条件，有的研究者还设计阳性对照载体，用来生产阳性对照细胞 2.正负筛选法 正负筛选法是一种基于遗传学原理的筛选方法，其中正向筛选是用来选出那些稳定地整合了标记基因的 细胞，而负筛选是用来杀死非同源重组而产生的细胞。 为了能进行正、负两种筛选，打靶载体除了包含正筛选标记基因外，还要在线性化载体的一端加上一个负 筛选基因，正、负筛选标记基因均带有其各自的启动子，能够独立进行表达。 载体构建：第一种构型设计是将 neo 基因的编码序列连同它自身的翻译起始密码子置于靶基因启动子下 游，发生同源交换后，靶基因的启动子将驱动 neo 基因的表达，表达产品是 neo 基因编码的蛋白质。 第二种构型是将 neo 基因的编码序列插入靶基因的编码序列，使两者的读框符合。发生同源交换事件之后， 靶基因的启动子将驱动融合基因表达，表达产品是一个融合蛋白，其中 neo 基因编码的肽序列位于融合蛋 白质的后半部。 3. 无启动子筛选法 无启动子筛选法的原理是筛选整合到靶基因座上的正筛选标记基因。为此，必须在打靶载体上将正筛选基因， 如 neo 基因的启动子除去，使其在发生非同源重组时保持沉默。 如果 neo 基因正确地放置在打靶载体上，同源重组将恢复它的转录和翻译活性。也就是说，它将利用靶基因 的启动子进行表达。 载体构建：第一种构型设计是将 neo 基因的编码序列连同它自身的翻译起始密码子置于靶基因启动子下游， 发生同源交换后，靶基因的启动子将驱动 neo 基因的表达，表达产品是 neo 基因编码的蛋白质。 第二种构型是将 neo 基因的编码序列插入靶基因的编码序列，使两者的读框符合。发生同源交换事件之 后，靶基因的启动子将驱动融合基因表达，表达产品是一个融合蛋白，其中 neo 基因编码的肽序列位于 融合蛋白质的后半部。 15.条件性基因打靶的原理、应用及特点 原理 通过基因转移对基因座上的基因进行有限制的修饰，这种基因修饰可以局限在某些细胞类型，也可以局限在 个发育阶段，或者可以既限制细胞类型，也限制发育阶段。 应用 1、常规定向基因转移技术灭活某个基因会导致死亡或有害的表型，因而防害在体内详细分析该基因功能的时 候。 2、条件性定向基因转移可以用来在一个特定细胞类型中分析那些广泛表达的基因产物。 特点 可以防止因为基因在发育早期被剔除，使机体产生适应性代偿反应。 16. Cre/Loxp 系统在定向基因转移中的应用有哪些？ 1.去除筛选标记 使用 Cre/Loxp 的最直接目的之一，是在定向基因转移实现之后除去标记基因。因为筛选标记极有可能干 扰基因的功能或表达调控。 2、创造大片段缺失 创造大片段缺失的潜在用途很多，其中包括靶向性灭活大的基因，从基因组中去除整个基因簇，以及隐 性突变的遗传筛选。 3、基因置换 用一段异源的 DNA 序列去置换靶基因座上一段内源的野生型 DNA 序列。 17. 不同基因打靶载体的构建及筛选原理? 基因剔除型载体 如果实验的目标是使基因组中某一个基因失去活性，最常用的载体类型是置换载体。 典型的置换载体由两段与基因组靶基因座序列同源的 DNA 片段构成（总长度 4-10kb） ，中间插入正筛 选标记。正筛选标记通常是细菌氨基糖苷磷酸转移酶基因（neo）能够用 G418 进行筛选。在通常情况 下，载体的同源性长臂外端连上一个胸腺嘧啶激酶基因（tk） ，作为额外的负筛选标记，用来去掉那些 随机地整合了载体 DNA 的细胞（使用 GANC 筛选）载体的特点：同源臂、标记基因 靶载体上含有正筛选基因（neo）和负筛选基因（tk ） 。随机整合将使正、负筛选基因都整合到染色体 上，得到的转化细胞抗 G418，但不抗 GANC 。 同源重组（HR）将使正筛选基因取代靶序列中的启动子和外显子 1，从而使靶基因失活。负筛选基因 处在同源序列之外，同源重组将使它丢失。因此，同源重组细胞可以用 GANC 来富集。 穿梭型载体 在不同类型受体细胞( 如酵母与细菌、细菌与动物细胞等)中都能够进行复制的克隆载体。 利用了一