中华绒螯蟹表达序列标签(est)分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究

中华绒螯蟹表达序列标签（EST ）分析及免疫相关基因的克隆、表 达模式研究 【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国的重要增养殖对象之 一。近年来,随着其养殖规模的不断扩大和集约化程度的提高,由细菌、 病毒和类立克次体生物等引起的各种病害日趋严重,给中华绒螯蟹养 殖业造成了巨大的损失。至今,病害仍然是困扰其养殖业的一个重要 因素。除改善环境因素外,提高机体自身免疫力和抗病力是解决这一 难题的一个重要方法。本论文试图从分子角度来研究中华绒螯蟹的 免疫防御机制,以其为这一重要方法提供坚实的理论基础。本研究借 助分子生物学和生物信息学手段,首次完成对中华绒螯蟹血细胞 cDNA 文库的构建和表达序列标签(EST)的分析,不仅丰富了中华绒螯 蟹的基因数据,同时筛选出许多与免疫相关的基因序列。在此基础上, 通过 cDNA 末端快速扩增(RACE)和实时定量 PCR 技术进一步对主 要的免疫相关基因进行了克隆和表达模式分析,这些研究为了解中华 绒螯蟹免疫机制提供了基础资料,同时也为蟹病的防治提供了新思路。 主要研究结果如下:1 采用常规 cDNA 文库构建技术,成功构建了滴度 为 4.50106CFU/mL,库容为 3.3106CFU/mL,重组率为 73%的中华 绒螯蟹血细胞 cDNA 文库;从文库中随机挑取了 3,118 个克隆进行 5- 端单向测序,经去除低质量和污染序列后,共得到 3,041 条高质量 EST 序列,这些序列的平均长度为 561bp。经拼接后获得了 1,049 条 unique 序列 ,包括 292 条重叠群(Contig) 和 757 条单一序列(Singleton) 。 通过比对发现有 488 条 Unique 序列被注释成已知的功能基因,551 条 Unique 序列未被注释任何功能;通过 GeneOntology 功能分类发现 了 26 个中华绒螯蟹先天性免疫反应,如参与酚氧化酶系统的丝氨酸 蛋白酶、Kazal-型蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、 -巨球蛋白、 酚氧化酶原激活因子以及酚氧化酶酶原,参与凝集反应的谷胱酰胺转 移酶,与抗氧化系统相关的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶以及谷 胱甘肽过氧化物酶,抗菌肽类的抗脂多糖因子、甲壳素、以及 Osmotin,模式识别分子类的 C-型凝集素、甘露糖结合蛋白、脂多糖 和 -1,3 葡聚糖结合蛋白、Toll 受体蛋白。通过 EST 表达丰度分析 发现,中华绒螯蟹血细胞主要免疫相关基因为 Kazal-型蛋白酶抑制剂 和 C-型凝集素。2 模式识别蛋白及其功能的研究是当前甲壳动物免 疫学的研究重点之一,许多物种的模式识别蛋白及其功能已经明确。 本研究根据 EST 提供的信息,采用 RACE 技术成功克隆了中华绒螯 蟹一种模式识别蛋白-脂多糖和 -1,3 葡聚糖结合蛋白 (LGBP)基因全 长 cDNA 序列。生物信息学分析发现,该序列全长为 1,236bp,包括 26bp 的 5-末端非转录区(5-UTR),1,089bp 的开放阅读框(ORF) 和 121bp 的 3-末端非转录区(3-UTR),共编码 362 个氨基酸,包含一个由 15 个氨基酸组成的信号肽;蛋白序列与中国明对虾(Penaeuschinensis) 、 细角滨对虾(Litopenaeusstylirostris),凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei) 和淡水螯虾(Pacifaxtacusleniusculus)LGBP 的相似性分别为 67%、 66%、66%、61%;该基因编码蛋白含有几个保守的区域,如整 合素结合区,激酶 C 磷酸化位点,N连接的糖基化位点等,另外还发现 了一个水解酶位点。实时定量 PCR 结果显示,LGBP 基因 mRNA 在 中华绒螯蟹肝胰腺、鳃、肌肉、血细胞、胃和肠中均有表达,其中在 血细胞中的表达量最高。用嗜水气单胞菌进行急性感染实验发现, LGBP 在血细胞中的表达量在感染后 1.5h 达到最高水平,与对照组相 比存在显著性差异(P0.05),而后表现为下降趋势,在感染后 12h 恢复 到起始水平,说明该基因参与了中华绒螯蟹的抗病过程。3 酚氧化酶 原激活酶(PPAF)的活化以及 PPAF 活化酚氧化物酶原是酚氧化物酶 系统行使非特异性免疫功能的关键步骤。本研究成功克隆了中华绒 螯蟹 PPAF 基因全长 cDNA 序列。该序列全长为 1,386bp,其中包括 154bp5-UTR,1,134bpORF 和 95bp3-UTR,编码 378 个氨基酸。该编 码蛋白含有信号区域、半胱氨酸折叠区域和保守的丝氨酸区域。该。 PPAF 氨基酸序列与其它无脊椎动物 PPAF 氨基酸序列相比,具有很 高的相似性(55%-75%)。PCR 结果分析表明肝胰腺、肌肉、肠道、 鳃中均有 PPAF 的表达。嗜水气单胞菌急性感染后 6h、12h、48h,与 对照组相比 PPAF 基因 mRNA 表达水平均显著增加(P0.05) 。结果 表明 PPAF 与机体对外来病源的防御作用密切相关。4 作为抗氧化酶 类,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、和谷胱甘肽 -S-转移酶(GST)在清除体内过多的氧自由基、保护细胞免受氧化损 伤等方面起非常重要的作用。本研究在 EST 序列的基础上,通过 RACE 技术获取了这三种酶基因全长 cDNA 序列。其中,SOD 基因 cDNA 全长为 1,339bp,包括 20bp5-UTR,867bpORF 和 452bp3-UTR, 共编码 288 个氨基酸,没有信号肽序列,但含有 Mn-SOD 的标记保守 序列(DVWHHAYY),说明该 SOD 属于 Mn-SOD。序列比对发现,中华 绒螯蟹 Mn-SOD 与凡纳滨对虾(L.vannamei)、班节对虾 (Penaeusmonodon)、蓝蟹(Callinectessapidus)和罗氏沼虾 (Macrobrachiumrosenbergii)、克氏原螯虾(Procambarusclarkia)的 Mn- SOD 相似性分别为 90%、89% 、87%、84%和 81%。SOD 基因在各 组织均有表达,其中在血细胞中表达量最高,而其他组织中表达量相对 比较低,结果提示中华绒螯蟹 SOD 基因主要在血细胞中表达。以嗜 水气单胞菌急性感染中华绒螯蟹,血细胞 SOD 基因 mRNA 的表达在 感染后 1.5h 达到最高,之后开始下降并在 12h 达到最低点,12h 后表达 量又开始升高,至 48h 时表达量同 1.5h 的表达量基本相同。但是 1.5h、12h、48h 感染组的表达量与对照组之间 SOD 基因 mRNA 的 表达水平不存在显著性差异(P0.05)。GPx 基因 cDNA 全长为 1,101bp,其中包括 94bp5-UTR,660bpORF 和 347bp3-UTR。该 ORF 编码 219 个氨基酸,没有信号肽序列。ORF 中没有发现编码硒半胱氨 酸的序列(TGA),说明该 GPx 属于不含 Se 的 GPx。该序列含有典型 的过氧化物结构域,烷基过氧化还原蛋白(AhpC)结构域,硫氧还蛋白折 叠结构域。序列比对发现,该基因氨基酸序列与锯缘青蟹 (Scyllaserrata)、地中海海绵(Suberitesdomuncula)和繁茂膜海绵 (Hymeniacidonperlevis)GPx 氨基酸序列相似性分别为 81%、67%和 66%。 GPx 基因 mRNA 在各组织均有表达, 其中在肝胰腺中表达量最 高,而血细胞中表达量相对比较低。结果提示中华绒螯蟹的 GPx 基因 主要在肝胰腺中表达。嗜水气单胞菌感染中华绒螯蟹不同时间后, GPx 基因 mRNA 在血细胞中的表达呈现下调作用。在感染后 1.5h,GPx 基因 mRNA 表达量显著性低于对照组(P0.05), 随着感染时 间的延长,感染组 GPx 基因 mRNA 表达量虽然有所提高,但仍显著性 低于对照组。结果提示,病菌的感染可能抑制了中华绒螯蟹的 GPx 的 表达。GST 基因 cDNA 全长为 958bp,包含 85bp5-UTR,651bpORF 和 222bp3-UTR。该 ORF 编码 216 个氨基酸 ,其中含有一个由 17 个 氨基酸组成的信号肽。序列比对发现,该蛋白氨基酸序列与赤拟谷盗 (Triboliumcastaneum)和致倦库纹(Culexquinquefasciatus)GST 相似性 为 53%、与大劣按蚊(Anophelesdirus)和库蠓(Culicoidesvariipennis) GST 相似性为 52%、与疟蚊(Anophelesgambiae)GST 相似性为 51%。该蛋白氨基酸序列含有一个 82 个氨基酸组成的 G-位点和 126 个氨基酸组成的 H-位点,另外也含有一个蛋白酶磷酸化位点和一个 N-连接的糖基化位点。相似性和系统发生分析表明该 GST 属于 delta-GST。通过实时定量 PCR 分析发现,中华绒螯蟹 GST 在肝胰腺, 肌肉和血细胞中均有表达,而在鳃、胃和肠中未检测到其表达。其中 在血细胞中的表达量最高,说明血细胞为其主要的合成部位。中华绒 螯蟹受嗜水汽单胞菌感染后,GST 在血细胞中的表达量在感染后 6h 达到最大,且与对照组存在显著性差异(P0.05),而后表现为一个下降 趋势,在感染 12h 后恢复到起始水平。结果表明,GST 基因不仅在解毒 方面起重要作用,同时还参与中华绒螯蟹的免疫反应。 【关键词】： 中华绒螯蟹血细胞表达序列标签免疫相关基因脂多糖-13-葡聚糖结 合蛋白(LGBP)酚氧化酶原激活酶(PPAF)超氧化物岐化酶(SOD)谷胱 甘肽过氧化物酶(GPx) 谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 【学位授予单位】：华东师范大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2009 【分类号】：S917.4 【目录】：中文摘要 6-10ABSTRACT10-15 第一章文献综述 15-40 第一节表达序列标签(EST)的研究进展及甲壳动物的 EST15-21 第二 节甲壳动物先天免疫系统研究进展 21-34 第三节中华绒螯蟹免疫基 因研究概况 34-39 第四节本论文的研究目的、意义和技术路线 39-40 第二章中华绒螯蟹血细胞 cDNA 文库的构建及 EST 分析 40-63 第一 节中华绒螯蟹血细胞 cDNA 文库的构建 40-47 第二节中华绒螯蟹血 细胞 cDNA 文库的 EST 分析 47-63 第三章中华绒螯蟹脂多糖和 - 1,3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆与表达 63-86 第一节中华绒螯 蟹 LGBP 基因全长 cDNA 的克隆和序列分析 63-79 第二节嗜水气单 胞菌急性感染对中华绒螯蟹 LGBP 基因 mRNA 表达的影响 79-86 第 四章中华绒螯蟹酚氧化酶原激活酶(PPAF)基因的克隆与表达 86-102 第一节中华绒螯蟹 PPA