β淀粉样多肽细胞毒性作用的研究进展

阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统原发性、退变性疾病，是老年性痴呆中最常见的类 型，临床表现为进行性痴呆，记忆、理解、判断等认知功能障碍，严重影响着老年人的生 存质量。AD 无论是家族性的，还是散发性的，目前为止对其发病机制尚不清楚。 1 淀粉样多肽的生物学作用 AD 病理学特征是：与学习、记忆相关的大脑皮层中出现老年斑 (SP)、神经纤维缠结及 神经元的缺失。 淀粉样蛋白(A) 积聚形成的丝状沉淀是 SP 的重要组成成分1，2 ， 在 AD 的发病中起着相当重要的作用。 1.1 A 的生成和代谢 A 是由 前体蛋白(APP)通过蛋白酶解途径裂解成长度为 3943 个氨基酸的片段，APP 基因位于第 21 号染色体上。APP 是一个 110135 kD 的跨 膜蛋白,其细胞外侧 N 末端很长，细胞内 C 末端则很短,两个 N 糖基化位点位于细胞膜外。 APP 至少有 3 种蛋白酶解途径3，4: 分泌途径。在 分泌酶的作用下,水解 A 的 lys16 leu17 位肽键,生成的两个片段均不沉积,称为非淀粉样肽源性途径或结构性分泌, 这是 APP 加工的主要途径 ; 分泌途径。指在 分泌酶的作用下，APP 的第 671 和 672 残基间的肽键断裂 ,它产生 A 的 N 端; 分泌途径。 分泌酶切割 A3944 之间的肽键,生成完整的 A。在某些病理条件下,如 APP 基因突变，APP 主要经 和 分泌途径,产生过多的 A ,导致 AD 发病。A 由 3943 个氨基酸残基组成,分子量在 4 kD 左右。A 的 2/3 左右的序列位于 APP 的 N 末端,1/3 左右的序列位于 APP 的跨膜 结构域。A 在 N 端被修饰 ,改变其表面电荷增强了疏水性,形成丝状沉淀，促进 A 聚 集和神经毒性的产生。此外，家族遗传性 AD 与 3 个不同的基因突变相关 5，6：APP 基因、早老素 (presenilin，PS)基因 1 及 PS 基因 2，细胞培养结果显示上述基因突变蛋白 产物加速丝状 A 的生成。 1.2 A 的生物学特性 A 在正常老年人脑组织中也存在,是机体细胞如神经细胞和胶 质细胞正常代谢的产物,Savory 等7，8研究表明可溶性 A 单体是一种天然的抗氧化 剂，可以保护脑细胞，抑制氧化应激;A 在水溶液中以 螺旋、随机螺旋和 片层结构 三种形式混合存在。其中 片层结构可促进 A 单体聚集，形成淀粉斑块; 片层结构形 成抑制物可以抑制 A 的聚集并分解 A 聚合物，从而阻止 A 对培养神经元的毒性作 用。 片层结构的生成数量具有温度、时间和浓度依赖性，温度升高、放置时间延长和 A 浓度增加均可以促进 片层结构形成。在环境溶液的 pH 值为 47 时， 片层结构 最易生成。另外，溶液中的 螺旋在一定条件下也可以形成 片层结构。某些金属离子， 如 Zn2+，可以加速 A 聚集和沉积。当 APP 基因发生突变或环境因素、代谢因素作用， 引起 A 表达增加，在杏仁核、海马及新皮质等部位的浓度增高，作用时间延长，以及局 部体液异常，从而导致 片层结构生成，促进 A 聚集，沉积在这些区域。 2 A 的毒性作用 2.1 A 与氧化应激及一氧化氮 在 AD 的形成的过程中,氧化应激起着非常重要的作用。 在脑内,自由基的产生和消除的速率维持着一种动态平衡,当 A 堆积时,这种平衡被打破。 A 可以看作是氧化应激与 AD 脑细胞死亡之间的偶联分子。A 通过多种途径诱导氧化 应激。Stadelmann 等9研究报道 A 损伤了线粒体氧化还原活性，增加了活性氧(ROS) 的堆积。抗氧化剂可以抑制 A 介导的氧化应激反应10 。A 本身可作为氧自由基供 体，产生 ROS，这些产物可破坏细胞膜，促使脂质过氧化，损伤膜蛋白。A 还可通过与 特异的受体结合激活小胶质细胞释放炎症因子，同时诱发小胶质细胞产生自由基，加剧氧 化应激。Vodovotz 和 Hashimoto 等11，12研究表明一氧化氮合酶(NOS) 合成的一氧化 氮(NO)参与 AD 的发病过程。丝状的 A 沉淀与 AD 患者脑内神经元的缺失关系密切，病 理学和生物化学研究证明丝状的 A 诱导产生的 NOS 具有神经毒性。在 AD 患者脑内的 神经元纤维缠结中含有诱导型 NOS。NOS 抑制剂可以阻止家族性 AD PS1 基因的突变 11，13 。从而推测，ROS 与 NO 可能是 A 诱导神经元细胞死亡的重要介导物质。但 是 ROS 和(或)NO 的靶分子尚未明确。 2.2 A 与 ASK1 JNK 信号转导系统及内质网应激 ASK1 JNK 信号转导系统是一个 重要的凋亡信号转导途径。Kadowaki 等14研究发现等以丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶 途径(mammalian mitogen activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK) 为特征的细胞凋 亡信号转导激酶 1(ASK1) 途径包含 IRE1 TRAF2 ASK1 级联反应最终激活了内质网应 激途径的激酶(c Jun NH2 terminal kinase;JNK)。Nishitoh 等15研究表明，ASK1 基 因敲除小鼠可以抵抗内质网应激引起的细胞死亡。A 激活 JNK，引起 c Jun 磷酸化 16，17 。A 介导的神经细胞死亡可被显性负相突变 c Jun 的表达、JNK 抑制剂、 c Jun 或 JNK 靶向断裂所抑制1618 。但是 A 激活 JNK 的机制尚不清楚。 Imaizumi 等19研究发现，内质网腔内未折叠蛋白的堆积诱导的内质网应激参与 AD 患 者神经元细胞的退行性变。内质网应激是 AD 的发病原因之一， ASK1 是内质网应激介导 细胞死亡的关键分子，Nakagawa 等20报道 A 通过内质网应激激活 ASK1 JNK 途径， 引起细胞死亡。综上所述，ASK1 也许会成为治疗和预防 AD 的靶分子。 2.3 A 与炎症 A 通过慢性免疫炎症应答对神经元细胞产生直接和间接的毒性作用。 SP 内含有补体、急性期蛋白、激活的小神经胶质细胞等炎性标记物。小胶质细胞和星形细 胞均可被丝状或可溶性 A 激活,激活的小胶质细胞可以分泌多种细胞因子,如白细胞介素 (IL) 1，IL 6、肿瘤坏死因子 (TNF )，还可以分泌多种蛋白如 2 巨球蛋白， 导致神经细胞损伤。正常神经元细胞 A 的清除维持在一个动态的平衡中，但是细胞如何 通过胞饮或吞噬作用对 A 清除的分子学机制并不清楚。最近直接针对 A 的免疫治疗为 治疗 AD 提供了一条有益的新思路。在 AD 的动物模型实验中，A 疫苗可以抑制 A 斑 的形成，阻止认知能力的衰退。CD14 是一个由小神经胶质细胞表达的、分子量为 55 kD 的糖基磷脂酰肌醇 髓细胞样醣蛋白。CD14 主要功能是通过胞饮作用清除细菌细胞壁的 脂多糖成分。研究发现 CD14 在 A42 激活小神经胶质细胞过程中起重要作用。CD14 参 与细胞吞噬细菌及病原体成分细胞炎症反应，同时也在脑细胞清除 A 过程中很关键 21 。脂多糖受体 CD14 干扰 A 纤维沉积，促进神经胶质细胞对 A 纤维的吞噬清除 作用。对 CD14 分子的研究为阐明 AD 临床治疗提供了一个很好的前景。 2.4 A 与钾离子通道 K+通道是一个大的家族，它们参与细胞的增殖和凋亡的调控。 在肿瘤细胞，生长因子通过激活 K+通道，增加 K+通道活性，促进肿瘤细胞的增殖。在表 达原癌基因 ras 的细胞中， Ca2+敏感性 K+通道是通过细胞内 Ca2+浓度的变化反复激活， 导致细胞膜电位不稳定22 。研究表明 K+通道阻断剂抑制细胞的增殖，K+通道的激活对 细胞周期 G1 期的影响非常关键， K+通道开放时 K+外流，细胞内 K+浓度降低促进细胞的 凋亡23 。Colom 等24研究证实 K+通道激活促进细胞凋亡 ;反之，细胞外 K+浓度升 高，抑制 K+通道开放，阻止细胞凋亡。K+和 Cl 是细胞中与凋亡相关的重要离子，细胞 膜上的 K+通道开放，细胞膜去极化，增加了膜对 Cl 的通透性，Cl 外流到细胞外间隙， 导致细胞内渗透性失水，细胞容积减小，引起凋亡。研究表明，A25 35(20 m)和 A1 42(20 m)促进神经元细胞 K+外流，引起细胞凋亡;反之，利用 K+通道阻滞剂四乙 铵(tetraethylammonium,TEA)抑制 K+外流，将会阻止细胞凋亡25 。 2.5 A 与胆碱能神经系统的损伤 中枢神经系统中的胆碱能神经元及其突触与大脑的 学习记忆功能密切相关。AD 患者大脑病理特征之一是大脑基底部胆碱能神经元的慢性、 进行性缺失。其特点是胆碱能神经系统标志物的减少，如：胆碱乙酰转移酶(ChAT)的缺失、 毒蕈碱和烟碱乙酰胆碱受体水平降低以及乙酰胆碱水平的降低。因此目前临床上治疗 AD 的方法主要基于维持和增加胆碱能神经递质的传递。大量的研究资料表明：脑基底部胆碱 能神经递质的传递、APP 代谢机制、A 斑介导神经胶质细胞激活的炎症因子及神经营养 因子信号转导途径之间关系密切26 。乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂和毒蕈碱可以增强 APP 向可溶性淀粉样蛋白裂解，减缓脑内淀粉样物质的沉积27，28 。而且淀粉样物质 的沉积与 AChE 的表达密切相关，AChE 促进 A 纤维状沉积;在细胞培养实验中以及对转 基因小鼠和 AD 患者的研究中 A 调控 AChE 的表达、聚集、糖基化。这样在神经斑周围 表达的 AChE 促进了 A 的形成、沉积，这个过程又刺激了 AChE 的生成。因而抑制 AChE 可以阻止 APP 的裂解和 A 斑块的形成29，30 。研究表明，AChE 可以促进 A12 28 和 A25 35 的沉积，但不会影响 A1 16 的沉积 26 。A 斑块的形成 激活了神经胶质细胞，IL 1 表达上调，影响 APP 的代谢，干扰了胆碱能神经递质的传递。 选择性激动膜乙酰胆碱受体 M1/M3 而不是 M2/M4，通过激活蛋白激酶 C 和/或 MAP 激酶 系统介导，可以增加 sAPPa 的分泌，减少总 A 的生成 ;烟碱样受体激动剂可以调节 APP 的代谢过程，抑制 A 的沉积 ;有活性的星形胶质细胞和小神经胶质产生的细胞炎症因子： IL 1 及 TNF 与 A 的沉积密切相关 31 。IL 1 和 TNF 选择性的损害脑基底 部胆碱能神经元细胞，IL 1 上调 APP 的表达，促进 A 斑块的形成;IL 1 可以增加 AChE 的活性，增强 AChE 的表达2931 。神经生长因子(NGF)具有维持胆碱能神经元 细胞的功能，同时也参与胆碱能介导的 APP 代谢的调节32 。 2.6 A 与神经元的凋亡 神经元凋亡是 A 毒性作用引起 AD 重要的病理学机制。研 究表明，将 A1 40 分别注入野生小鼠和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 3 (cystein asparate protease，caspase3)基因缺陷小鼠脑内海马区，野生小鼠海马区神经元大量缺失， caspase3 基因缺陷小鼠脑对神经元细胞的保护呈基因剂量效应，同时还发现体外培养 caspase3 基因缺陷小鼠的神经元细胞加入 A1 40，细胞死亡率无明显改变，体外培养野 生型小鼠神经元细胞加入 A 1 40，细胞大量死亡，说明 A 毒性作用于凋亡密切相关 33 。 此外研究表明氯通道的开放参与 A 毒性作用，且其毒性作用可以被氯通道阻断剂抑 制34 。但关于其离子机制国内外尚无此方面的研究。 参考文献： 1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126 例J;中国中医药科技;1999 年 06 期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002 年 05 期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003 例痤疮患者特征分析与控制对策J; 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